全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:667-671
文章编号:1001-6880(2008)04-0667-05
　
　
　收稿日期:2007-09-10　　　接受日期:2007-11-30
　基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(2004CB72030)
＊通讯作者 Tel:86-10-62829823;E-mail:qchang@implad.ac.cn
蛇莓中鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的分离鉴定及含量测定
王予祺 1 ,斯建勇 1 ,刘新民 1 ,唐劲天 2 ,常　琪 1＊
1中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所 , 北京 100094;
2清华大学医学物理与生物工程研究所 , 北京 100084
摘　要:蛇莓为民间常用草药 , 通常与其它中药配合使用 ,用于多种癌症的治疗。为了解其抗肿瘤活性成分 ,本
文对其化学成分进行了研究。从该植物的酚性部分中分得两个酚性成分 , 分别鉴定为鞣花酸(Elagicacid, EA)
和短叶苏木酚羧酸 (Brevifolincarboxylicacid, BA)。 EA为首次从该属植物中分得。并首次建立了蛇莓中 EA和
BA的 HPLC含量测定方法 , 样品以 50%乙醇为溶剂超声提取 30 min, 提取液以 C18色谱柱进行分离。 以 25 mM
磷酸二氢钾缓冲液(pH=2.4)-乙腈进行梯度洗脱 ,流速 1.0mL/min, 360 nm下检测。结果显示 , EA和 BA均具
有良好的线性范围(r2 >0.999)、精密度(RSD<0.50%)和重现性(RSD<1.50%), 回收率分别为 99.65%和
102.95%。当进样体积为 20 μL时 , EA和 BA的最低检测限分别为 12和 20 ng/mL。以上结果表明该方法简便
易行 , 结果准确 ,重复性好 ,可用于蛇莓中 EA和 BA的含量测定。
关键词:蛇莓;鞣花酸;短叶苏木酚羧酸;HPLC
中图分类号:R284.1;Q946.91 文献标识码:A
Isolation, IdentificationandQuantitativeDeterminationofElagic
AcidandBrevifolincarboxylicAcidinDuchesneaindicabyRP-HPLC
WANGYu-qi1 , SIJian-yong1 , LIUXin-min1 , TANGJin-tian2 , CHANGQi1＊
1InstituteofMedicinalPlantDevelopment, ChineseAcademyofMedicalScience＆Peking
UnionMedicalCollege, Beijing100094 , China;2InstituteofMedicinalPhysics＆Engineering,
TsinghuaUniversity, Beijing100084 , China
Abstract:DuchesneaindicaisatraditionalChinesemedicinecommonlyusedfortreatmentofcancersincombination
withotherherbs.Twophenolics, ellagicacid(EA)andbrevifolincarboxylicacid(BA), wereisolatedfromthephenolic-
fractionoftheherb.Inaddition, anewRP-HPLCmethodforsimultaneousdeterminationofEAandBAwasdeveloped
andvalidated.TheseparationwasperformedonaC18 column, gradientlyelutedwith25mMpotassiumdihydrophosphate
buffer(pH2.4)andacetonitrileat1.0 mL/minandmonitoredat360 nm.Theplantmaterialswereextractedwithetha-
nol-water(50∶50).ThetwocomponentsEAandBAshowedgoodlinearity(r2 >0.999)withinthestudiedconcentra-
tionranges, withLODof12and20 ng/mL, respectively.Theprecision(RSD)waslessthan1.50% forbothtwocom-
poundsandtheextractionrecoverieswere99.65% and102.95%, forEAandBA, respectively.Thedevelopedmethod
wasappliedtoassaythetwocomponentsintheherbsofDuchesneaindica.
Keywords:Duchesneaindica;elagicacid;brevifolincarboxylicacid;HPLC
　　蛇莓 [ Duchesneaindica(Andr)Focke]为蔷薇
科蛇莓属植物 ,别名三匹风 、地莓 、一点红 、蛇含草 、
宝珠草 、野杨梅等 ,为民间常用草药 [ 1] 。蛇莓以全
草入药 ,具有清热解毒 ,收敛止血之功效 ,用于热病
惊痫 、咽喉肿痛 、咳嗽吐血 、蛇虫咬伤等症 [ 2] 。近年
来 ,蛇莓常与其他中药配伍用来治疗妇科炎症[ 3]和
肿瘤 ,包括乳腺癌 , 肺癌 , 肝癌 ,结肠癌和子宫肌
瘤[ 4-7] 。我们前期研究发现蛇莓水提液酚性部分在
体外能够显著抑制肿瘤细胞(SKOV-3、HeLa、HEC-
1B、NCI-H460、CNE、BGC-823)的增殖 ,并可在体内
抑制小鼠移植瘤 U14的生长 [ 8] 。为了进一步明确
蛇莓酚性成分的化学组成 ,我们对其进行了化学成
分的研究 ,从中分得两个酚性化合物 ,分别为鉴定鞣
花酸(Elagicacid, EA)和短叶苏木酚羧酸 (Brevi-
DOI :10.16333/j.1001-6880.2008.04.031
folincarboxylicacid, BA), EA为首次从该属植物中
分得。此外 ,本文还首次建立了 HPLC分析方法 ,对
其在蛇莓中的含量进行了测定 ,并比较了它们在不
同产地蛇莓中的含量变化 。
1　仪器与试剂
1.1　仪器
Fisher-Johns型熔点测定仪(温度未校正);Shi-
madzuUV-2100s型紫外光谱仪;Perkin-Elmer983G
型红外光谱仪 , KBr压片;BrukerAM-500型核磁共
振仪 , TMS为内标;FAB-MS质谱用 Zabspec型质谱
仪 , ESI-MS质谱用 Esquire-LC00054型质谱仪 。
Waters高效液相色谱仪(Milford, MA)含 600型四
元梯度泵 , 996型二级管阵列检测器 , 717型自动进
样器。数据采集及分析采用 WatersMilennium软件
(Version3.2)。
1.2　试药
乙腈为色谱纯 ,购自美国 Fisher公司;其它试剂
均为分析纯 ,购自北京化工厂;水为去离子重蒸水 。
鞣花酸和短叶苏木酚羧酸对照品:按下述 2.2项中
方法自制 ,经 HPLC检测为单一峰 ,归一化法计算其
纯度分別为 99.6%和 99.2%。
1.3　供试样品
用于提取分离的蛇莓全草样品 ,收集于安徽省 ,
由中国药材集团公司提供 ,其品种经中国医学科学
院药用植物研究所张本刚教授鉴定为蔷薇科蛇莓属
植物 Duchesneaindica(Andr)Focke。凭证标本
(20050443)收藏于中国医学科学院药用植物研究
所标本馆。另外两个蛇莓样品购于北京中药店 ,产
地分别为河北省和山东省 。
2　实验方法
2.1　蛇莓酚性部分的提取
将蛇莓干燥全草 150 g经粉碎后 ,用 100 ℃热
水 2.5L浸渍提取 1 h,连续提取 3次 ,合并提取液
用 AB-8大孔树脂柱(70×7.5 cm)吸附酚性成分 ,
弃去不能被吸附的组分后 ,先用 10 L去离子水洗脱
非酚性组分 ,如糖类 ,氨基酸 ,蛋白质和矿物质 ,再用
90%乙醇洗脱得到醇洗液 , 60 ℃时减压浓缩醇洗液
至干 ,得到棕色粉末 9.6 g,为蛇莓酚性部分 ,重复多
次如上步骤 ,共得 150 g蛇莓酚性部分用于下一步
分离。
2.2　鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的分离
将蛇莓酚性部分 150 g用乙醇溶解后 ,用 324 g
聚酰胺(200 ～ 300目)吸附 、晾干 、研碎 、过筛 ,置于
100 g聚酰胺(200 ～ 300目)装填的色谱柱上层 ,先
后以丙酮 、丙酮 -甲醇(10∶1)洗脱 ,分别得到组分 Ⅰ
(37.8 g)和组分 Ⅱ(20 g)。再将这两个组分别进行
SephadexLH-20 (Sigma, 6 ×30 cm)色谱柱层析 ,以
甲醇为洗脱剂洗脱 ,每 100mL收集一份 。将组分 Ⅰ
中的第 12 ～ 14流份合并 ,浓缩至小体积 ,放置后有
一沉淀物析出 ,抽滤得沉淀物 ,并用丙酮重结晶 ,得
到化合物 1 (1.23 g,鞣花酸)。将组分 Ⅱ中的第 8
～ 9流份合并 ,浓缩至小体积 ,放置后有一沉淀物析
出 ,抽滤得沉淀物 , 并用甲醇重结晶 ,得化合物 2
(218 mg,短叶苏木酚羧酸)。
2.3　鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的 HPLC含量分析
2.3.1　色谱条件
色谱柱:ThermoHypersileODSC18柱(250mm×
4.6 mm, 5 μm),柱温为 23℃。流动相为 A和 B两
相组成 , A为 25 mM磷酸二氢钾缓冲液 (pH=
2.4), B为乙腈 ,按表 1中所示的程序进行梯度洗
脱。流出液在 200 ～ 400nm波长范围内进行全波长
扫描测定 ,由于 360nm为 EA和 BA共同的最大吸
收波长 ,故选择 360nm为检测波长。
表 1　HPLC梯度洗脱程序
Table1　HPLCgradientelutionprogramme
时间
Time
(min)
流速
Flowrate
(mL/min)
流动相 A
MobilephaseA
(%)
流动相 B
MobilephaseB
(%)
0 1 88 12
8 1 88 12
15 1 84 16
35 1 84 16
45 1 75 25
50 1 75 25
55 1 88 12
60 1 88 12
　　注:A.25mM磷酸二氢钾缓冲液 , pH 2.4, B.乙腈。
2.3.2　对照品溶液的制备
精密称定 EA对照品 2.0mg和 BA对照品 1.15
mg,分别置于 2.0 mL的容量瓶中 ,加 DMSO使溶解
并稀释至刻度 ,摇匀 , -20 ℃保存。临用时将两个储
备液等体积混合 ,再用 50%甲醇稀释成一系列包含
EA(1.56 ～ 25.00 μg/mL)和 BA(0.90 ～ 14.38
μg/mL)5个不同浓度的标准溶液。
2.3.3　供试品溶液的制备
668 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
取全草粉末 0.1 g,精密称定 ,置密封瓶中 ,加
50%乙醇 50 mL,超声处理 30 min。静置使提取液
冷至室温后 ,将提取液移至一离心管中 , 13 000 rpm
离心 5 min,取上清液作为供试品溶液 。
3　实验结果
3.1　鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的分离和结构鉴定
本研究利用大孔树脂吸附法提取制备了蛇莓酚
性成分 , 又利用聚酰胺柱层析和反复的 Sephadex
LH-20柱层析从此酚性部分中分离得到了两个酚性
化合物 ,通过如下的理化性质和各种光谱数据鉴定
它们为 EA和 BA。
　　化合物 1　土黄色无定形粉末 , mp.>300 ℃
(甲醇),微溶于 H2O, CHCl3和 EtOH。盐酸 -镁粉反
应呈阴性 , 三氯化铁反应为阳性 。 UVλMeOHmax nm:
358, 255;IRυKBrmax cm-1:3558 (OH), 1697 (C=O),
3080, 1616, 1583, 1508, 1448 (Ar-);EI-MSm/z
(%):302(M+ , 100), 91(8), 77(8);1HNMR(500
MHz, DMSO-d6 )δ:7.43 (2H, s, H-4, H-4′);13 C
NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:107.3(C-3, C-3′),
110.1(C-2 , C-2′), 112.4(C-1, C-1′), 136.3(C-5, C-
5′), 139.9(C-6, C-6′), 148.1(C-4, C-4′), 159.1(2,
C=O)。1H, 13CNMR数据与文献 [ 9, 10]中鞣花酸的完
全一致 ,故鉴定为 Elagicacid(见图 1)。
　　化合物 2　黄色无定形粉末 , mp.>300 ℃(甲
醇),三氯化铁反应为阳性 。UVλMeOHmax nm:354, 281,
220;IRυKBrmaxcm-1:3533, 3326 (OH), 1735, 1714, 1701
(C=O), 1620, 1593 , 1525 (Ar-);FAB-MSm/z:
293.1[ M+H] + , 273.2[ M-H2O-H] +;EI-MSm/z
(%):248(100), 220(10), 192(10), 164(50), 118
(15), 69(6), 57(8);1HNMR(500 MHz, DMSO-d6)
δ:10.85(1H, s, OH), 10.04(2H, s, OH), 7.28(H-
7, s, OH), 4.35(H-8, dd, J=8 , 2 Hz), 2.98(H-9a,
dd, J=8, 19 Hz), 2.46(H-9b, dd, J=2, 19 Hz);13C
NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:37.4(C-9), 40.9(C-
8), 107.9(C-7), 113.0(C-7a), 115.1(C-3a), 139.0
(C-3), 140.2(C-5), 143.8(C-4), 145.6(C-2),
149.5(C-6), 160.2(C-1)173.5(COOH), 193.3(C-
10)。以上 1H, 13CNMR数据与文献 [ 11]中短叶苏木
酚羧酸的完全一致 , 故鉴定为 Brevifolincarboxylic
acid(见图 1)。
图 1　化合物 1和化合物 2的化学结构
Fig.1　Chemicalstructuresoftwoisolatedcompounds1 and2
3.2　蛇莓中鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的 HPLC含
量测定
3.2.1　HPLC色谱分离
图 2为在本实验条件下所得的蛇莓 50%乙醇
提取液的 HPLC色谱图 ,可以看出 , EA和 BA的色
谱峰有较好的对称性 ,且能够与其他峰达到基线分
离 ,其保留时间分别为 34.4和 10.1min。
图 2　蛇莓全草 50%乙醇提取液的 HPLC色谱图
Fig.2　HPLCchromatogramsof50% ethanolextractfromthewholeplantofDuchesneaindica
A.对照品 Standardpreparation;B.安徽产蛇莓D.indicainAnhuiProvince;C.河北产蛇莓D.indicainHebeiProvince;D.山东产蛇莓 D.in-
dicainShandongProvince
669Vol.20 王予祺等:蛇莓中鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的分离鉴定及含量测定
3.2.2　线性关系
分别精密吸取 5个不同浓度的对照品溶液 20
μL依次注入高效液相色谱仪 ,测定峰面积 。以对照
品浓度为横坐标 ,峰面积为纵坐标 ,绘制标准曲线 。
得 EA的回归方程为 y=32478x-6367.8, r=
0.9999。 BA的回归方程为 y=48344x-1077, r=
0.9999。结果表明 ,在上述色谱条件下 , EA进样浓
度在 1.56 ～ 25.00 μg/mL范围内与峰面积值呈良
好的线性关系 , BA进样浓度在 0.898 ～ 14.38 μg/
mL范围内与峰面积值呈良好的线性关系 。
3.2.3　精密度
在上述色谱条件下 ,精密吸取对照品溶液 20
μL,重复注入液相色谱仪 6次 ,测定峰面积。计算
EA和 BA峰面积的 RSD分别为 0.41%和 0.25%,
表明方法的精密度良好。
3.2.4　稳定性
在室温条件下 ,取同一对照品溶液分别于 0、3、
6、9、12和 24 h各测定一次 。结果显示 ,所测得的
EA和 BA在不同时间点的峰面积没有明显改变 ,
RSD(n=6)分别为 0.31%和 0.27%,说明 EA和
BA溶液在室温条件下至少 24 h内稳定。
3.2.5　重复性
取安徽产蛇莓样品 ,照供试品溶液制备项下操
作 ,平行制备 6份供试品溶液 ,并按上述色谱方法测
定 EA和 BA的含量 。结果显示 , 6次测得 EA含量
的 RSD为 1.18%, BA的 RSD为 1.49%,表明该方
法的重复性良好 。
3.2.6　回收率
采用加样回收法试验 。取已知 EA和 BA含量
的蛇莓粉末 0.05g,精密称定 ,共称取 10份 ,分别置
密封瓶中 ,其中 5份分别精密加入 EA对照品 0.31
mg(1.11mg/mL, 0.28mL),其余 5份分别精密加入
BA对照品 0.058 mg(0.58 mg/mL, 0.1 mL)。按供
试品溶液制备方法制成供试品溶液 ,并按含量测定
方法进行测定。根据测得量和加入量计算回收率 。
结果显示 , EA平均回收率为 99.65% (RSD,
1.50%, n=5), BA的平均回收率为 102.95%
(RSD, 1.23%, n=5)。说明该测定方法测定结果准
确 。
3.2.7　最低检测限
将 EA和 BA的对照品溶液用 50%甲醇不断稀
释 ,直到测得信号峰的信噪比为 3∶1,此时的浓度即
为最低检测浓度(LOD)。结果表明 EA和 BA的
LOD分别为 12和 20 ng/mL。
3.2.8　样品测定
取不同产地(安徽 ,河北 ,山东)的蛇莓样品粉
末各三份 ,按上述供试品溶液制备方法和色谱条件 ,
测定各样品中 EA和 BA的含量 ,测定结果列于表
2。结果表明 ,所建立的经过验证的 HPLC方法完全
能够用于同时测定蛇莓全草中 EA和 BA的含量。
从所得的 HPLC指纹图谱中可以看出 ,不同产地的
蛇莓样品的 HPLC图谱非常相似(图 2),其所含的
EA和 BA的含量也很相似 ,分别约为 1%和 0.1%。
表 2　不同产地蛇莓全草中鞣花酸和短叶苏木酚羧酸的含
量 (x±s, n=3)
Table2　Contentsofellagicacid(EA)andbrevifolincarboxylic
acid(BA)inthewholeplantofDuchesneaindica
whichwascolectedindiferentregionsofChina(x±
s, n=3)
产地
Area
鞣花酸含量
ContentsofEA(%)
短叶苏木酚羧酸含量
ContentsofBA(%)
安徽 1.04±0.004 0.11±0.002
山东 0.99±0.003 0.10±0.001
河北 0.80±0.001 0.08±0.000
4　讨论
4.1　本研究利用反复柱层析技术从蛇莓中分离得
到了两个酚性成分 ,分别鉴定为鞣花酸(EA)和短叶
苏木酚羧酸(BA)。EA为首次从该属植物中分得。
据大量文献报道 , EA和 BA具有显著的抗氧化和抗
癌活性[ 12-15] ,结合本文中含量分析结果 ,可以推测
蛇莓中的 EA和 BA很可能是其主要的抗肿瘤活性
成分 。
4.2　对于用 HPLC法测定其他植物中的 EA或 BA
含量已有文献报道 ,但未见有同时测定这两个化合
物的方法 ,本研究首次建立了以 HPLC/UV方法同
时测定蛇莓中 EA和 BA的含量方法 ,并进行了方法
学考察 ,包括线性关系 、精密度 、重现性 、稳定性 、检
测限等 。研究证明 ,此方法操作简便 、快捷 ,且重现
性好 ,所得数据准确可靠。可用于蛇莓药材的质量
控制和不同产地蛇莓化学指纹图谱的比较。
4.3　由于所分析化合物 EA和 BA都是酚性化合
物 ,所以本文采用酸性流动相 ,以消除色谱峰的拖尾
现象 。本文比较了多种流动相 ,包括:0.1%乙酸-乙
腈 , 0.2%乙酸 -乙腈 , 0.1%甲酸-乙腈 , 0.2%甲酸-乙
腈 , 0.1%磷酸-乙腈 ,以及 25 mM磷酸二氢钾缓冲
670 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
液 (pH=2.4)-乙腈。实验表明 ,使用最后一种流动
相效果最佳 ,故选择此为最终流动相 。另外 ,由于
EA和 BA的极性相差较大 ,且 EA色谱峰的附近又
有其它成分潜在的干扰 ,因此采用多级梯度洗脱可
使 EA和 BA的保留时间适宜 ,且色谱分离度良好 。
4.4　本文对分析方法中的提取溶剂和提取时间进
行了比较。分别考察了多种溶剂系统的提取效果 ,
包括 20%甲醇 、50%甲醇 、70%甲醇 、甲醇 、20%乙
醇 、50%乙醇 、70%乙醇 、乙醇和水 ,结果 50%甲醇
和 50%乙醇提取效率相当且最高 ,考虑到乙醇毒性
较小 ,所以选择 50%乙醇为提取溶剂。当以 50%乙
醇为溶剂对蛇莓全草进行不同时间的提取 ,结果 30
min即能提取完全 ,所以选择 30 min为提取时间。
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