全 文 ：蛇莓总酚的抗肿瘤作用及免疫学机制的初步探讨
彭　博 1 ,胡　秦1 ,王立为 1 ,王予祺 1 ,常　琪1 ,唐劲天 2 ,刘新民 1 ,陈　颖1 ,党海霞 1
(1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京　100094;2.清华大学工程物理系 , 北京　100084)
收稿日期:2007 - 01 - 25,修回日期:2007 - 05 - 17
基金项目:国家重点基础研究发展规划 (973规划 )资助项目 (No
2004CB72030)
作者简介:彭　博(1979 - ),女 , 博士 , 研究方向:肿瘤药理学 , Tel:
010-62899741, E-mai l:m edpb@ sohu. com;
刘新民(1962 -),男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向:肿瘤
药理学 ,通讯作者 , Tel:010-62812595, E-m ail:liuxinm inuae
@ yahoo. com. cn
中国图书分类号:R-332;R 284. 1;R 329. 24;R 392.11;
R 392.12;R 73-36;R 979.1
文献标识码:A　文章编号:1001 - 1978(2007)08 - 1007 -04
摘要:目的　探讨蛇莓 [Duchesnea indica(Andr)Focke]有效
部位蛇莓总酚(Duche snea pheno lic ex tract, DPE)的抗肿瘤作
用及其免疫调节作用。方法　体外实验采用 MTT法测定肿
瘤细胞 (SKOV-3、H eLa、HEC-1B、NC I-H 460、 CNE、 BGC-823)
生长抑制率。体内实验采用小鼠 U14移植瘤模型 , 采用
M TT法和溶血素分光光度法 , 检测肿瘤抑制率 、T淋巴细胞
转化率和 B淋巴细胞抗体量 , 分析其对小鼠体内抗肿瘤作用
及免疫调节的关系。 结果　DPE以剂量依赖的方式抑制肿
瘤细胞增殖 , 有明显的体内抗肿瘤作用。同时 DPE可增强 T
细胞增殖和 B细胞抗体分泌。结论　DPE既可直接作用于
肿瘤细胞 , 也可以通过提高机体细胞与体液免疫应答的水平
而发挥体内抗肿瘤作用。
关键词:蛇莓;抗肿瘤;免疫调节
　　蛇莓始载于《别录》,为蔷薇科植物蛇莓 [Duch-
esnea indica(And r)Focke]的全草。性味甘 、酸 、寒 ,
有小毒 ,入肺 、肝 、大肠经 ,功效清热解毒 、凉血消肿 ,
用于热病惊痫 、咽喉肿痛 、咳嗽吐血 、疔疮痈肿 、蛇虫
咬伤 、湿疹 [ 1] 。研究证明蛇莓水提物体内外有抗肿
瘤作用 ,同时蛇莓与其他中药配伍常用来治疗胃癌 、
肺癌和妇科肿瘤 [ 1, 2] 。但目前对其抗肿瘤作用研究
较少 ,且作用机制不清 。现对其抗肿瘤作用及其机
制进行初步探讨 。
1　材料与方法
1. 1　动物及细胞株　昆明种♀小鼠 ,体重 (22±2)
g, 由中国医学科学院动物中心提供 ,合格证号:
SCXK11-00-0006。小鼠子宫颈鳞癌细胞株 (U14)由
中国医学科学院药物所提供 ,本室以腹水型传代保
种 。人大细胞肺癌细胞株 NC I-H460、人鼻咽癌细胞
株 CNE、人胃癌细胞株 BGC-823由中日友好医院临
床医学研究所生化及分子生物学研究室惠赠 。人卵
巢癌细胞株 SKOV-3、人子宫颈癌细胞株 HeLa、人子
宫内膜癌细胞株 HEC-1B购自中国协和医科大学基
础学院细胞中心。
1. 2　药品与试剂　蛇莓购自中国药材公司 ,由中国
医学科学院药用植物研究所张本刚教授鉴定为蔷薇
科蛇莓属植物 Duchesnea indica(Andr)Focke的全
草。蛇莓总酚 (Duchesnea phenolic ex tract, DPE)由
本所常琪教授提取(提取率为 6.57%, 总酚含量为
43%)。 RPM I1640培养基(G ibco), 胎牛血清(武汉
三利 ),MTT (Am resco), 环磷酰胺 (CTX , 上海华联
制药有限公司生产 ,批号:031205),其他试剂为国
产分析纯 。
1. 3　仪器　SpectraM ax 190型酶标仪 (美国分子仪
器公司 ),紫外可见 UV2550分光光度计 (日本岛
津)
1. 4　方法
1. 4. 1　蛇莓总酚对人肿瘤细胞的生长抑制作用　
取对数生长期的肿瘤细胞 ,以 5 000个 /孔接种于 96
孔板 ,于 37℃ 5% CO2条件下培养 10 ～ 12 h后 ,给
药组加入 DPE(使其终浓度为 20 ～ 240mg L- 1 ,以
0.08% DMSO作为阴性对照 , 20 nmo l L -1的顺铂
作为阳性对照 ),采用 MTT比色法 ,于波长 570 nm /
650 nm处测定吸光度 A值 。肿瘤细胞的生长抑制
率 /%=(1 -实验组的 A值 /阴性对照组的 A值 )×
100%
1. 4. 2　小鼠移植性肿瘤 U14模型建立 [ 3] 　取本室
自行传代 5 ～ 7 d生长良好的腹水癌细胞 ,洗涤后以
适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液 , 细胞数为
2.5×1010 L - 1 ,每组 10只 , d 0每只鼠右腋窝皮下
接种 0.2 m l(含瘤细胞 5×106个 )。接种后 d 1将
荷瘤鼠随机分为 5组 , DPE以 3个剂量组分别 ig,模
型组 ig蒸馏水 ,连续给药 20 d;阳性对照组 ip环磷
酰胺 60 mg kg-1一次 。常规饲养 , 饮水 ,食物不
限。
1. 4. 3　抑瘤作用观察　停药次日 d 21,小鼠全部脱
颈椎处死 ,剥取皮下实体瘤瘤块 ,称重 ,按下列公式
计算肿瘤抑制率 /%:肿瘤抑制率 /% =[模型组平
均瘤重(C) -实验组平均瘤重 (T)] /模型组平均瘤
1007 中国药理学通报　ChinesePharmacolog ica l Bulletin　2007 Aug;23(8):1007 ～ 10
重 (C)×100%
1. 4. 4　蛇莓总酚对细胞免疫功能的影响——— T淋
巴细胞转化试验 [ 4] 　于 d 21处死动物 ,无菌取脾 ,
用无菌 PBS冲洗 ,于无菌平皿内以 200目钢网用针
芯研磨 ,移至离心管约 1000 r m in-1离心 10 m in,
破红 ,洗涤细胞 3次 。以含 10%胎牛血清的 RP-
M I1640调整细胞浓度为 5 ×109个 L -1 ,加入 96
孔板 , 100μl /孔 。每组实验孔加入 ConA 10 μl(终
浓度 2.5 mg L -1), 培养 60 h后 ,加入 MTT 20 μl
(终浓度 0.5 g L- 1)培养 4 h后 , 加入三联液 100
μl(10%SDS /5%异丁醇 /0.01 mo l L -1 HC1(W /V /
V)), 37℃过夜。酶标仪测 570 nm的 A值 。
1. 4. 5　蛇莓总酚对体液免疫功能的影响 ———溶血
素分光光度法　选用♀昆明小鼠 ,瘤细胞接种 ,动物
分组及给药途径 、方法 、剂量和时间与 2.1同 ,于 d
16致敏动物 ,小鼠腹腔注射 5% SRBC 0.4 m l。停
药次日 d 21杀鼠取脾 ,研磨后洗涤 ,用冷 PBS制成
2×1010 L- 1的细胞悬液 ,将 1 m l上述脾细胞悬液 、
0.2% SRBC 1 m l、1 ∶10稀释补体 1 m l充分混匀
后 , 37℃水浴 60m in后 , 3 000 r m in-1 ,离心 5m in。
取上清 , 413 nm读 A值 。
1. 5　数据处理　数据以 –x±s表示 ,应用 G raphpad
prism 4.0分析 ,组间比较采用 one-way ANOVA检验。
2　结果
2. 1　MTT法测定 DPE对肿瘤细胞的生长抑制作
用　应用不同浓度的 DPE(20 ～ 240 mg L -1)处理
肿瘤细胞 72 h后 ,药物对 3种妇科肿瘤细胞呈现明
显的剂量依赖性的生长抑制作用 (Fig 1);但其增殖
抑制作用未呈现时间依赖性(HeLa细胞 24、48、72 h
的 IC50分别为 93.93、 96.35、 89.83 mg L -1;SK-
OV-3细胞分别为 85.03、83.48 、80.68 mg L -1)。
其中 SKOV-3和 HeLa细胞对 DPE表现出较高的敏
感性(Tab 1)。
F ig 1　E ffect o fDPE on cancer cell prol ifera tion byMTT assay
Tab 1　Concen tration producing 50% grow th inhib ition
(IC50) of DPE on cancer cell l ines a t 72 h(–x±s , n=3)
C ell lines IC50 /m g L- 1
SKOV-3 80. 68±3. 41
H eLa 89. 83±8. 02
HEC-1B 223. 80±22. 61
NC I-H460 245. 66±19. 01
BGC823 112. 63±0. 63
CNE 63. 24±9. 05
2. 2　DPE对小鼠子宫颈癌 U14的作用　结果显
示 ,低剂量的 DPE(0.25 g kg-1)对小鼠子宫颈癌
U14的生长有促进作用;0.5、1 g kg -1 DPE能明显
抑制 U14的生长 ,抑瘤率分别为 27%, 63%;高剂量
的 DPE抑制肿瘤生长接近阳性药环磷酰胺的作用。
DPE各剂量组均未见明显的毒性反应 ,治疗结束时
小鼠全部存活 。
Tab 2　Anti-tum or effect o fDPE on U14 in vivo(–x±s, n=10)
G roup Dose /g kg- 1 Tum or w eigh t /g
M odel - 2. 420±0. 839
CTX 0. 06 0. 652±0. 756
DPE 0. 25 2. 584±0. 718
0. 5 1. 150±0. 590**
1 0. 777±0. 552**
　　**P<0.01 vsm odel g roup
2. 3　蛇莓总酚对荷瘤小鼠细胞及体液免疫的影响
　通过 T淋巴细胞转化实验和溶血素分光光度实
验显示 ,同正常小鼠相比 ,荷瘤小鼠细胞和体液免疫
功能减弱 ,表现为 B细胞抗体释放量减少 , T细胞增
殖活性降低 ,但差异无统计学意义 。蛇莓总酚 1 g
kg
-1能明显促进荷瘤小鼠的 T淋巴细胞的增殖;但
低剂量的 DPE(0.25 g kg -1)明显抑制淋巴细胞的
增殖 。不同剂量的 DPE ig后 ,荷瘤小鼠体液免疫功
能增强 ,表现为剂量依赖性的抗体量增加 (A 413值 ),
Tab 3。
Tab 3　Effect of DPE on the pro lifera tion of T lymphocy tes
and relea sed antibod ies(–x±s, n=10)
G roup
Dose
/g kg- 1
P roliferat ion of
T lym phocytes /A 570
Released an tibodies
/A 413 value
Norm al - 0. 449±0. 144 0. 367±0. 077
M odel - 0. 408±0. 098 0. 083±0. 109##
CTX 0. 06 0. 322±0. 046* 0. 105±0. 06
DPE 0. 25 0. 270±0. 072** 0. 153±0. 119
0. 5 0. 385±0. 096 0. 464±0. 385**
1 0. 588±0. 112** 0. 512±0. 337**
　　##P <0. 01 vs norm al group;* P <0. 05, ** P <0. 01 vs m odel
group
1008 中国药理学通报　ChinesePharmacologica l Bulletin　2007 Aug;23(8)
3　讨论
　　以往体外实验证实 ,蛇莓水提物对人体消化道
肿瘤人体肝癌 (7721)、胃癌 (7901)、食管癌 (Eca
109)有明显的杀伤作用 [ 2] 。作者在已有研究的基
础上进一步扩大瘤谱 ,结果显示蛇莓总酚对人卵巢
癌 (SKOV-3)、人宫颈癌 (HeLa)、人子宫内膜癌
(HEC-1B)、人鼻咽癌(CNE)、人胃癌(BGC-823)、人
肺癌(NC I-H460)细胞的增殖有良好的抑制作用;其
中对 SKOV-3、HeLa、CNE显示出较高的敏感性 。有
研究发现蛇莓对小鼠体内 S180、H22、S37有明显的
抑瘤作用[ 2] 。本实验结果表明 DPE (0.5、 1 g
kg
- 1)抑制小鼠 U14生长 , 抑瘤率分别达到 27%、
63%,高剂量的 DPE作用接近 ip 60mg kg- 1CTX。
　　机体的免疫功能与肿瘤的发生 、发展有密切关
系 。机体对肿瘤的免疫反应既有细胞免疫又有体液
免疫反应的参与。其中细胞免疫占主导地位 , T细
胞为细胞免疫的主要方面 ,是机体抗肿瘤免疫的核
心力量 , T淋巴细胞增殖反应是一个能够代表机体
细胞免疫能力的重要免疫因素 [ 5, 6] 。体液免疫是特
异性抗原抗体结合反应 ,主要由 B细胞介导的免疫
应答。本实验在证实蛇莓具有良好的体内外抗肿瘤
效果基础上 ,进一步探讨了 DPE对 U14荷瘤小鼠的
免疫功能的影响 。结果显示高剂量 DPE能明显提
高荷瘤小鼠 T淋巴细胞增殖能力 , 0.25 ～ 1 g kg -1
DPE呈剂量依赖性增加抗体释放量 。此外 ,研究证
明蛇莓对小鼠巨噬细胞的吞噬功能有明显促进作
用 [ 7] 。提示 DPE能提高荷瘤小鼠特异性的细胞 、体
液免疫和非特异性的免疫功能 。
　　本实验发现同模型组相比 ,低剂量 DPE能促进
肿瘤生长 、抑制荷瘤鼠的细胞免疫功能 ,只有在中 、
高剂量下发挥抑制肿瘤 ,提高细胞免疫力的作用;但
DPE呈剂量依赖性增加 B细胞抗体生成量 ,提高体
液免疫力。以上结果的出现可能与 DPE中有多种
化学成分 ,不同的化学成分对肿瘤生长和机体免疫
起不同的调节作用有关。
　　总之 , DPE有良好的体内外抗肿瘤作用。 DPE
不但可直接作用于肿瘤细胞 ,并且可提高荷瘤鼠的
细胞及体液免疫应答 ,从多方面发挥抗肿瘤作用。
因此 ,进一步研究 DPE的抗肿瘤作用机制有重要的
意义 。
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Study on anticancer function of phenolic extract from
Duchesnea indica and its mi munolog icalm echan ism
PENG Bo
1 , HU Q in1 , WANG Li-wei1 , WANG Yu-qi1 , CHANG Q i1 ,
TANG Jin-tian2 , LIU X in-m in1 , CHEN Y ing1 , DANG Ha i-x ia1
(1. Institute ofM edicinal P lant, Chinese Academ y ofMed ical Sciences, P eking Union Med ica l College, Beijing　100094, China;
2. Institu te of Med icina l Phy sics＆Engineering, Tsinghua University, Beijing　100084, China)
Abstract:A mi 　To study the anticancer activ ity of
Duche snea pheno lic ex tract (DPE) and its immuno-
modu la tion effec.t M ethods　The tumor cells(SKOV-
3, HeLa, HEC-1B, NC I-H460, CNE , BGC-823) grow th
1009 中国药理学通报　ChinesePharmacologica l Bulletin　2007 Aug;23(8)
repression rates w ere measured by MTT colorime ty in
vitro. The an tineop lastic effect o fDPE in vivo was stud-
ied on m ice transplanted U14 tumor. Tumor-inhibiting
activ ities, T lymphocy te pro life ra tion ra tio and re leased
antibodies of B lymphocy tes w ere investigated. Results
　DPE show ed an ticance r activity in a dose-dependent
manner. DPE inh ibited the grow th o fU14 in vivo, im-
proved func tion of T lymphocy te pro liferation and re-
leased antibodies of B lymphocy tes. Conc lusions　
DPE can no t on ly affect tumo r cells directly bu t also
exe rt antitumo r effic iency through re info rcing ce ll-me-
dia ted and humo ral immune response.
Keywords:Duchesnea ind ica;anticancer;immunomod-
ula tion
糖皮质激素抑制狼疮肾炎MMP-2与MMP-9表达的实验研究
蔡广研 , 陈香美 , 师锁柱 ,吕　扬 ,李建军 , 王兆霞
(解放军总医院肾科 全军肾脏病研究所暨重点实验室 , 北京　100853)
中国图书分类号:R-332;R 322.61;R 329. 24;R 394. 2;
R 593.242. 053;R 977. 11
文献标识码:A 文章编号:1001 -1978(2007)08 - 1010 -05
摘要:目的　明确糖皮质激素调控 MM P-2、MMP-9表达与活
性变化与治疗狼疮肾炎的关系。方法　采用 MRL /lpr自发
性狼疮小鼠为模型 , 将 8 wk龄小鼠随机分为甲基强的松龙
(MPS)治疗组与对照组(con tro l), MPS治疗组腹腔注射甲基
强的松龙 25 m g kg - 1 d- 1 ,将小鼠饲养至 28 w k, 观察小鼠
的存活率 、蛋白尿 、肾功能与肾脏病理改变。采用免疫组化
检测 MM P-2与 MMP-9的表达变化 , 利用含有放射自显影的
成像乳胶对冰冻肾组织切片进行原位明胶酶活性的检测。
结果　M PS能够延长狼疮小鼠的存活率(P <0.05)、降低蛋
白尿的发生率(P <0. 01)、降低血清尿素氮(P <0.01), 并减
轻肾小球 、肾小管 -间质以及肾小血管的病理改变 (P <
0. 05)。狼疮小鼠肾小球内 MMP-2、MM P-9的表达与活性随
增龄明显增加(P <0. 01)。M PS能够明显抑制肾小球 MMP-
2、MMP-9的表达及肾组织原位明胶酶的活性变化 (P <
0. 01)。结论　甲基强的松龙对自发性狼疮小鼠的治疗作用
与抑制肾脏异常 MMP-2与 MM P-9的表达与活性密切相关 ,
该作用可能是糖皮质激素治疗狼疮肾炎的机制之一。
关键词:狼疮肾炎;甲基强的松龙;MMP-2;MMP-9;明胶酶谱
　　糖皮质激素是治疗狼疮肾炎的临床常用药物 。
收稿日期:2007 - 02 - 04,修回日期:2007 - 05 - 11
基金项目:国家自然科学基金创新群体基金资助项目 (No
30121005);北京市 自然 科学基 金资 助项 目 (No
7032045);北京市科技新星计划课题(N o 2004A58);全军
医药卫生基金资助项目(N o 06Q065)
作者简介:蔡广研 (1972 - ),男 ,博士 ,副主任医师 , 研究方向:慢性
肾脏病的临床与基础 , Tel:010-66935462, E-m ail:caigy@
301hospita.l com. cn;
陈香美(1951 -),女 ,博士 ,主任医师 ,教授 ,研究方向:慢
性肾脏病与老年肾损害 , E-m ail:xm chen301@126. com
传统观点认为其主要通过免疫抑制与抗炎机制发挥
治疗作用 。明胶酶是基质金属蛋白酶 (matrix me tal-
lop ro teinase,MMP)系统的重要组成部分 ,分为明胶
酶 A(MMP-2)与明胶酶 B (MMP-9)。我们前期采
用自发性狼疮小鼠模型证实 ,明胶酶 A、B的表达与
活化随着病变的发展明显增加 ,调控明胶酶的异常
活化可以减轻炎症性肾脏病理损害。糖皮质激素治
疗狼疮肾炎是否与干预异常活化的明胶酶活性有
关 ,目前尚不清楚 。本研究以 MRL /lpr自发性狼疮
小鼠为模型 ,以甲基强的松龙为治疗药物 ,采用免疫
组织化学与原位明胶酶谱法分别从蛋白质表达与酶
活性两方面对这一问题进行研究 。
1　材料与方法
1. 1　实验动物与分组　MRL / lp r自发性狼疮小鼠
购自日本实验动物中心 , ♀♂各半 。小鼠分笼饲养
至 8 wk龄后 ,随机取♀♂各 5只处死 。将余下小鼠
随机分为甲基强的松龙 (MPS)治疗组与对照组 ,每
组 30只。MPS治疗组腹腔注射甲基强的松龙 25
mg kg- 1 d- 1。两组进食普通饲料 ,自由饮水 ,观
察至 28 wk。
1. 2　尿蛋白的测定　于不同实验观察时间留取尿
液 ,置于 - 70℃冰箱中保存 ,用考马斯亮蓝法测得尿
蛋白浓度 [ 1] 。尿蛋白浓度≥300 mg d l- 1定义为阳
性。
1. 3　肾脏组织标本留取　小鼠麻醉放血后 ,留取血
清标本 。仰卧位固定 ,腹正中切口 ,取出肾脏 ,一部
分留作制备冷冻切片用 , 肾组织离体后立即置于液
氮冷固 , 置于 - 70℃冰箱中保存;另一部分肾组织
置于 4%甲醛中固定 ,石蜡切片 , PAS染色 ,光镜下
观察肾小球病变 、肾小管 -间质病变以及肾小血管
病理改变 。
1010 中国药理学通报　Ch inese Pharm acolog ical Bu lletin　2007 Aug;23(8):1010 ～ 4