全 文 ：醇定容 , 摇匀 , 即得;分别精密量取上述溶液 2mL、
3mL 、4mL 、5mL 、6mL ,置 10mL 量瓶中 ,加稀乙醇定容 ,
精密吸取各对照品溶液 10μL ,分别注入高效液相色谱
仪中 ,进行测定 ,以对照品进样量为横坐标 ,以峰面积
为纵坐标 , 绘制标准曲线 。计算回归方程为:Y =
421295.5X-3329.5 ,R2=0.9996 ,结果表明牡荆素鼠李
糖苷在1.504 ～ 4.512μg具有良好的线性关系。
2.5　精密度试验
吸取供试品溶液 10μL ,注入液相色谱仪 ,连续进
样5次 ,结果 RSD=0.4%,说明精密度良好 。
2.6　稳定性试验
吸取对照品溶液 10μL ,分别于 0 , 2 ,4 , 6 ,8 , 24h注
入液相色谱仪 ,结果 RSD=0.5%,说明供试品溶液在
24h内稳定。
2.7　重现性试验
取同一批号的供试品 5份 ,按供试品溶液制备方
法制成 5份供试品溶液(每份含两个平行样),依法测
定含量 ,结果 RSD=1.6%,说明本法重现性良好 。
2.8　回收率实验
采用加样回收试验法 ,取供试品(牡荆素鼠李糖苷
含量为 2.58%)的样品约 75mg ,精密称定 ,共 6 份 ,分
别精密加入牡荆素鼠李糖苷对照品 ,依法制成供试品
溶液 ,测定结果表明本法的回收率良好 ,见表 1。
表 1　回收率实验
编号 供试品 mg
样品含量
mg
加入对照品
mg
测得量
mg
回收率
%
回收率平
均值 %
RSD
%
1 75.000 1.935 2.0 3.796 96.46
2 75.465 1.947 2.0 3.951 100.09
3
4
75.968
75.736
1.960
1.954
2.0
2.0
3.899
3.960
98.47
100.15 99.45 1.75
5 75.233 1.941 2.0 3.957 100.41
6 76.318 1.969 2.0 4.014 101.14
　　注:牡荆素鼠李糖苷对照品加样量为 2.568mg。
2.9　样品测定
依法测定 3 批样品 , 含量分别为 7.38 、7.42 、
7.40mg 粒。
3　讨论
用本法测定心安胶囊中牡荆素鼠李糖苷含量 ,方
法简便快捷 ,准确 ,专属性强 ,能有效控制成品的质量 ,
可提高心安胶囊的成品质量标准。
参考文献:
[ 1] 　卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制
剂第三册[ S] .1991:53.
[ 2] 　郑河平 ,郑洁平 ,郭宝萍 , 等.心安胶囊中牡荆素鼠李糖苷的检测
方法研究[ J] .中国药事, 2002 , 16(9):555-556.
翻白草降血糖活性部位提取工艺的优化研究
孙海峰 ,杨婷 ,阴旗俊 ,曹思思
(黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘　要:目的:建立翻白草中降血糖活性部位(总黄酮类成分)的含量测定方法 ,并优选其提取工艺 。方
法:以芦丁为对照物 ,用紫外分光光度法建立总黄酮的含量测定方法。以提取液中总黄酮的量为指标 ,
用正交设计法优化提取工艺。结果:芦丁在 0.1mg mL ～ 0.5mg mL 范围内线性关系良好 ,吸收度(A)和
浓度(mg mL)的线性方程为 Y=1.5598X+0.0043;翻白草总黄酮的最佳提取工艺为:70%乙醇 ,8倍量体
积 ,回流提取 2次 ,每次提取 2h 。结论:本实验为翻白草中总黄酮的检测提供了定量的检测方法 ,所优
选出的翻白草中总黄酮类成分的提取工艺具有简单 、稳定 、可行和重现性好等特点。
关键词:翻白草;正交试验;分光光度法;总黄酮;含量测定
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2009)03-0049-03
收稿日期:2009-02-20　　修回日期:2009-03-21
基金项目:黑龙江省科技攻关计划(GC06C40504)
作者简介:孙海峰(1964-),男 ,教授 ,药学博士 ,从事中药资源开发与研
究。 E-mail:Shf120@sina.com
　　翻白草为蔷薇科委陵菜属植物翻白草 Potentilla discolor Bunge 的带根全草 ,主要分布在北半球的温带
和寒带。《本草纲目》 :气味甘 ,微苦 ,性平 ,无毒。有清
热解毒 、凉血止血功效 ,主治肺热咳喘 、泻痢 、咳血 、吐
血 、痈肿疮毒等 。近年来民间流行用翻白草治疗糖尿
病并取得一定疗效 。现代药理研究表明 ,翻白草有抗
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菌和降血糖作用 ,其抗菌活性成分为槲皮素 、山奈酚等
黄酮类成分 。” [ 1] 。据前人及笔者研究确认 ,其降血糖
活性部位是其中的黄酮类成分[ 2] 。
《东北药用植物》中报道其“植株各部分均为黄酮
类化合物”[ 3] 。近年来 ,有关翻白草化学成分的组成 、
结构等方面的研究报导较多 ,但对翻白草中黄酮类成
分的提取工艺研究尚未见报导 。本文用紫外分光光度
法建立总黄酮的含量测定方法 ,对其最佳提取工艺进
行了探索 ,寻找最佳工艺 ,为翻白草的大规模开发和利
用奠定基础。
1　材料和仪器
1.1　仪器　恒温水浴箱:江苏金坛市医疗仪器厂;电
子分析天平:梅特勒-托利多上海有限公司;微型植物
粉碎机:天津泰斯特仪器有限公司;旋转蒸发仪:上海
亚荣生化仪器厂;K-Q500E型医用超声波清洗器 ,昆
山市超声仪器有限公司;721A 型分光光度计:四川仪
表九厂。
1.2　材料 　翻白草药材:采自湖南怀化 。芦丁对照
品:成都思科华生物技术有限公司 ,纯度 98%。亚硝
酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠 、乙醇均为分析纯。
2　方法
2.1　翻白草总黄酮含量测定方法的建立
2.1.1　对照品溶液的制备　精密称取干燥至恒重的
芦丁对照品 5mg ,置 50mL 容量瓶中 ,以 70%乙醇溶解
并稀释至刻度 ,即得(每 1mL中含芦丁 0.1mg)。
2.1.2　供试品溶液的制备　取翻白草粗粉 10g ,精密
称量 ,置圆底烧瓶中 ,加入 70%乙醇 120mL ,回流提取
两次 ,每次 1h , 滤过 ,滤液回收乙醇 ,干燥 。残渣用
70%乙醇溶解 。
2.1.3　测定波长的选择　取芦丁对照品溶液及供试
品溶液各 3mL于 10mL容量瓶中 ,加 5%亚硝酸钠溶液
0.3mL ,摇匀 ,放置 6min ,加 10%硝酸铝溶液 0.3mL ,摇
匀 ,放置6min ,加 4%氢氧化钠溶液 4mL ,用 70%乙醇
稀释至刻度 ,摇匀 ,放置 15min 后分别进行光谱扫描
(420nm～ 700nm),选定最大吸收波长 。
2.1.4　标准曲线制备　取芦丁对照品溶液 0 、1 、2 、3 、
4 、5mL ,分别置 10mL 容量瓶中 ,按 2.1.3项下制备供
试品 ,于 510nm 处测吸光度。以浓度 C 为纵坐标 ,吸
光度值A为横坐标建立回归方程 。
2.1.5　精密度试验　取芦丁对照品溶液(0.1mg/mL)
适量 ,连续测定 5次 ,记录结果。
2.1.6　稳定性试验　取供试品溶液 ,每隔 10min测定
一次 ,记录结果 。
2.1.7　重现性试验　分别取同一批次的翻百草 ,平行
取样 5份 ,按 2.1.2项下制成供试品溶液 ,依法测定 ,
记录结果 。
2.1.8　加样回收率实验　精密吸取 5 份样品液各
3mL 分别加入芦丁标准液(0.1mg mL)1mL , 于 510nm
处测定吸收度 ,计算回收率。
2.2　翻白草中总黄酮提取工艺考察
2.2.1　提取方法的考察　精密称取药材粉末 4份 ,每
份10g ,分别用下列方法提取 。
超声提取法:加入 70%的乙醇 120mL 超声提取
60min ,两次 ,合并滤液 ,减压回收至干;回流提取法:加
入70%的乙醇 120mL 回流提取 60min ,两次 ,合并滤
液 ,减压回收至干;渗漉法:加入 70%的乙醇 240mL渗
漉 ,减压回收至干;冷浸法:加入 70%的乙醇 120mL室
温浸提 60min ,两次 ,合并滤液 ,减压回收至干。分别
测定总黄酮含量 。
2.2.2　提取工艺的优化　在确定了提取方法后 ,对提
取工艺进一步优化 ,采用 L9(34)正交实验设计 ,考察乙
醇浓度 、溶媒用量 、提取时间 、提取次数四个主要影响
因素 。因素水平见表 1。
表 1　有效部位提取工艺考察因素与水平表(n=3)
水平因素 1 2 3
A(乙醇浓度%) 50 70 90
B(提取次数) 1 2 3
C(溶媒体积) 1∶8 1∶10 1∶12
D(提取时间 h) 1 2 3
精密称取翻白草药材粉末约 10g ,按正交表进行
实验 ,选择有效成分总含量为指标进行方差分析和直
观分析。
2.2.3　最佳提取工艺验证试验　精密称取翻白草粉
末约 10g ,3份 。按最佳提取工艺进行提取。
3　结果
3.1　翻白草总黄酮含量测定方法的建立
3.1.1　测定波长的确定　对照品和供试品溶液均在
510nm处有最大吸收 ,故选定 510nm为检测波长 。
3.1.2　标准曲线的制备　按 2.1.4项下制备标准曲
线 ,在 510nm 处测定吸光度。以浓度 C 为纵坐标 ,吸
光度值 A为横坐标进行线性回归 ,所得回归方程为:Y
=1.5598X+0.0043 , R2=0.9997 ,表明被测溶液浓度在
0.1mg mL ～ 0.5mg mL 范围内线性关系良好。
3.1.3　精密度试验　经计算 ,RSD=1.0%,表明仪器
精密度良好。
3.1.4　稳定性试验　经计算 , RSD=0.85%,表明样品
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在室温下 1h内总黄酮含量稳定 。
3.1.5　重现性试验　经计算 , RSD=1.29%,测定方法
重现性良好。
3.1.6　加样回收率实验　经计算 ,五次测得加样回收
率平均值为 99.58%, RSD=1.40%,表明该测定方法
测定结果准确。
3.2　翻白草中总黄酮提取工艺考察
3.2.1　提取方法的考察 ,结果见表 2。
表 2　总黄酮提取方法的考察结果(n=3)
提取方法 总黄酮含量(mg g)
超声法 26.33
回流法 32.99
渗漉法 17.04
冷浸法 14.13
结果表明 ,回流提取法总黄酮总含量高于其他方
法 ,故选回流提取法为最佳提取方法。
3.2.2　工艺优化结果　工艺优化采用正交试验 ,实验
结果见表 3 ,方差分析见表 4。
表 3　总黄酮提取工艺正交实验结果
实验号 因　素
A B C D
总黄酮(mg g)
X1 X2 X3 X总
1 1 1 1 1 26.10 26.70 26.40 79.2
2 1 2 2 2 40.05 40.10 40.07 120.3
3 1 3 3 3 45.39 45.12 45.26 135.77
4 2 1 2 3 33.97 31.72 32.85 98.54
5 2 2 3 1 39.76 37.86 38.81 116.43
6 2 3 1 2 42.84 41.96 42.40 127.2
7 3 1 3 2 18.51 17.02 17.77 53.3
8 3 2 1 3 31.99 29.44 30.72 92.15
9 3 3 2 1 23.24 20.02 21.63 64.89
K1 111.76 77.01 99.52 86.84
K2 114.06 109.63 94.58 100.27 G=295.927
K3 70.11 109.29 101.83 108.82
R 43.94 32.61 7.256 21.98
表 4　总黄酮方差分析表(α=0.05)
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 显著性
A 3670.474 2 1976.4195 44.528 显著
B 2105.313 2 1169.312 25.541 显著
C 82.430 2 83.8585 1.000
D 736.555 2 480.299 8.936
由极差分析可以直观看出 ,对提取工艺影响因素
的大小为:A>B>D>C 。提取翻白草总黄酮的最佳工
艺为A2B2C3D3 。由方差分析结果可知 ,乙醇浓度(A)
和提取次数(B)对提取物有效成分含量有显著影响 ,
为主要因素 ,这与极差分析的结果一致 。因素 D和因
素C 对总黄酮提取率的影响不是很明显 ,从节省时间
和成本的角度考虑 ,综合直观分析及方差分析结果得
出优化提取工艺为(A2B2C1D2),即 70%乙醇 , 8倍量体
积 ,回流提取 2h ,回流提取2次 。
3.2.3　验证实验　按上述优化条件进行验证实验(结
果见表5)。
表 5　正交实验最佳提取工艺的验证结果
实验结果 重复实验 1 重复实验 2 重复实验 3 平均值
总黄酮含量(mg g) 41.73 42.85 41.03 41.87
经计算 RSD为 2.19%。表明该工艺重现性好 ,稳
定可行 ,适宜大量提取。
4　讨论
4.1　本实验采用目前使用比较广的“络合 —分光光度
法”测定翻白草中总黄酮的含量 ,该法的显色原理是
Al
3+在强碱性环境中结合在黄酮类化合物 3′, 4′-二
羟基位置上 ,在黄酮化合物的母核上不发生结合反应。
该法对黄酮类物质具有一定的专属性 ,经方法学考察 ,
得出建立的含量测定方法的显色稳定性 、精密度 、重现
性 、加样回收率都较好 ,因此具有简便 、稳定 、结果可靠
等优点。
4.2　通过超声法 、回流法 、渗漉法和冷浸法对翻白草
中总黄酮的提取方法进行初步比较 ,结果表明 ,乙醇回
流法提取翻白草中总黄酮含量最高 。回流提取法的溶
剂利用率高于其他方法 ,且方法简便 、设备要求低 、成
本低廉 ,故在此选择乙醇回流提取法;通过正交实验优
化工艺 ,得出最佳提取工艺:70%乙醇 ,8倍量体积 ,回
流提取 2h ,回流提取 2次 。经验证试验该工艺稳定性
好 ,总黄酮的提取率高 ,优于其他方法 ,本实验确定的
翻白草总黄酮提取工艺为该药材的进一步开发提供了
科学的依据。
参考文献:
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学技术出版社 , 2006:3820.
[ 2] 　王琦 ,周玲仙 ,罗晓东 ,等.翻白草不同方法提取物对小鼠降血糖
作用[ J] .中国公共卫生, 2007 , 23(2):225.
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[ J] .中草药 ,2005 , 36(3):445-446.
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