全 文 ：第 14 卷 第 2 期 北华大学学报(自然科学版) Vol． 14 No． 2
2013 年 4 月 JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science) Apr． 2013
文章编号:1009-4822(2013)02-0183-03 DOI:10． 11713 / j． issn． 1009-4822． 2013． 02． 015
毛樱桃果肉总黄酮最佳提取纯化工艺设计研究
熊蔚蔚，徐铭键，张成义
(北华大学药学院，吉林 吉林 132013)
摘要:目的 探讨毛樱桃果肉总黄酮的最佳提取纯化条件，并验证所得产物的性质及活性．方法 采取联合提取
纯化法分离毛樱桃果肉总黄酮;采用红外光谱鉴定提取物的性质，并用小鼠足肿胀实验验证所得产物的生物学
活性．结果 联合提取纯化法所得产物得率较高，折合生药量平均达到 0． 833%，经红外光谱检测所得提取物与
芦丁标准品有较高的一致性;小鼠足肿胀实验显示:所得产物抗炎活性显著，且呈剂量依赖性．结论 联合提取
纯化法具有较强的统一性，可使分离纯化更加协调有序地进行，节约时间，提高效率，该法所得毛樱桃果肉总黄
酮具有较高的得率和纯度，产物品质和生物学活性良好，可推广利用．
关键词:毛樱桃果肉;总黄酮;提取纯化;红外光谱;足肿胀
中图分类号:R284 文献标志码:A
收稿日期:2012-08-25
基金项目:吉林省教育厅科学技术研究项目(2011126)．
作者简介:熊蔚蔚(1988 －) ，男，硕士研究生，主要从事抗炎免疫药理学研究;
通信作者:张成义(1966 －) ，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事抗炎免疫药理学研究．
On the Technological Design for the Optimal
Extraction and Purification of TFPTTP
XIONG Wei-wei，XU Ming-jian，ZHANG Cheng-yi
(College of Pharmacy，Beihua University，Jilin 132013，China)
Abstract:Objective To explore the best condition to extract and purify total flavone in Prunus tomentosa thunb
pulp(TFPTTP) ，and confirm the properties and activities of the extracted product． Method The combined
extraction and purification method was used to extract TFPTTP，infrared spectroscopy was applied to identify the
nature of the extract，and the mouse paw swelling experiment was performed for verifying the biological activity of
the extracted product． Results The combined extraction and purification method product yield was higher，which
was equivalent to 0． 833% of the crude drug dosage;the infrared spectroscopy detection demonstrated that the
spectrum of the extract was highly consistent with that of rutin，one of standard substances;the paw swelling
experiment showed that the product could produce a significantly anti-inflammatory activity and the activity was
dose-dependent． Conclusion The combined extraction and purification method has strong unity，it can make the
separation and purification more smoothly and orderly，save the time and improve the extraction and purification
efficiency． The yield and purity of TFPTTP obtained with this method should be higher and it may show a good
quality and biological activity，indicating that the method should be popularized and utilized．
Key words:Prunus tomentosa thunb pulp (TFPTTP) ;total tavone;extraction and purification;infrared
spectroscopy;paw swelling
在中国东北方民间流传着长白山毛樱桃泡酒
可治疗冻伤这一经验方，在魏晋朝代陶弘景所著
《名医别录》里就有“樱桃泡酒，主调中，治冻伤”的
描述［1］．本课题组以古籍和民间验方为基础结合
现代研究工艺发现，毛樱桃果肉内的总黄酮成分具
有明确的抗炎活性［2］，因此，如何能得到高品质纯
净的毛樱桃果肉总黄酮，对后续研究具有重要意
义．目前，用于总黄酮的提取纯化方法主要采用乙
醇提取法(使用 75% ～ 95% 的乙醇进行回流提
取)［3］，但由于毛樱桃果肉含糖量非常高，直接采
用乙醇进行回流提取后的产物中多糖不易除去，严
重影响后续的纯化效能，因此本课题组经过探索设
计出了一套除糖、提取、纯化等形成有机整体的联
合提取纯化方案． 经检验，本方案提取的总黄酮得
率较高，品质良好，可为后期进一步研究所使用．
1 一般资料
1． 1 原料及试剂
毛樱桃果肉干(毛樱桃鲜果去核，捣碎，置
40℃烘箱中烘干水分) ;芦丁标准品(中国生物制
品鉴定所) ;地塞米松注射液(天津金耀集团股份
有限公司) ;角叉菜胶(上海恒远生物科技有限公
司) ;昆明种健康小鼠 50 只(长春市实验动物繁育
中心) ;大孔树脂、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙醇等试
剂(国药集团化学试剂北京有限公司) ，纯度为分
析纯;蒸馏水(杭州产娃哈哈纯净水)．
1． 2 仪 器
超声细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有
限公司，JY98-3D型) ;旋转蒸发仪(上海亚荣生化
仪器厂，R205 型) ;电子分析天平(瑞士梅特勒
AL204-IC型) ;红外光谱仪(Avatar，FTIR-330 型)．
1． 3 工艺流程
本联合提取纯化法充分利用了各试剂的不同
提取纯化效果，用分步处理的方式使除糖的难题得
到很好的解决．由于各个步骤统一协调，所以能尽
可能多地得到回收溶剂，降低实验过程中的损耗，
保障了得率，提高了品质，具体方案见图 1．
图 1 工艺流程
Fig． 1 Process flow
毛樱桃果肉经过最初的热水分离后可分为水
相(主要含有多糖、无机盐、可溶性黄酮)和不溶物
(主要含有不溶性黄酮、纤维、蛋白质)两大部分，
水相部分经乙酸乙酯萃取，可溶性黄酮萃取进入酯
层，不溶物部分采用无水乙醇超声萃取、过滤，醇提
液里的主要成分即为不溶性的黄酮，将醇提液与萃
有可溶性黄酮的酯层合并经大孔树脂纯化浓缩，再
次使用乙酸乙酯萃取，所得酯层经回收溶剂可得毛
樱桃果肉总黄酮这一最终纯净产物．
1． 4 红外测试
将所得最终产物与芦丁标准品进行红外光谱
图对比，对二者特征基团的谱峰进行逐一检索，检
出后逐一进行归属，计算二者的对应性，确定所得
最终产物的品质与纯度．
1． 5 生物活性检测
选取昆明种健康小鼠 50 只，体质量 18 ～ 22 g，
随机分 5 组，每组 10 只，其中毛樱桃果肉总黄酮
100 mg /(5 mL·kg －1)剂量组、50 mg /(5 mL·kg －1)
剂量组、25 mg /(5 mL·kg －1)剂量组，分别皮下注
射给药 0． 05 mL /10 g，模型对照组皮下注射生理盐
水(0． 05 mL /10 g) ，阳性对照组皮下注射地塞米松
磷酸钠注射液 0． 05 mL /10 g(5 mg /mL) ，各组连续
给药3 d，末次给药后30 min，给每只小鼠左后足趾
注射 1%角叉菜胶 25 μL，4 h 后将小鼠脱颈椎处
死，以手术剪取左右足爪，立即以电子天平称量，以
肿胀足与非肿胀足质量差作为肿胀度，计算各组足
肿胀抑制率，并进行统计学分析． 计算公式如式
(1) ，(2) :
肿胀度(mg)=肿胀足
质 量
(mg)－非肿胀
足质量
(mg) ， (1)
组肿胀
抑制率
=
模型对照组
平均肿胀度
(mg)－治疗组平
均肿胀度
(mg)
模型对照组
平均肿胀度
(mg)
×100%． (2)
2 结 果
2． 1 毛樱桃果肉总黄酮提取纯化结果
经反复摸索，最终确定毛樱桃果肉总黄酮最佳
提取纯化条件为:樱桃果肉干和蒸馏水按 1 20 的
比例置于 50 ℃恒温水浴锅中浸泡 3 次，每次 1 h，
抽滤，合并滤液，浓缩滤液后用乙酸乙酯萃取．不溶
物和无水乙醇按 1 10 的比例浸泡 12 h后，置于超
声细胞破碎仪中 600 W 超声提取 3 次，每次
30 min，抽滤，合并滤液．将两次所得溶液合并经大
孔树脂纯化，旋蒸浓缩，再用乙酸乙酯萃取，回收乙
酸乙酯得到黄色粉末状黄酮．
为了进一步验证该实验条件的可靠性并剔除
实验误差，本课题组进行了 5 次验证实验，见表 1．
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表 1 毛樱桃果肉总黄酮提取纯化验证实验结果
Tab． 1 The result of TFPTTP verification test
m(毛樱桃果肉干)/g m(总黄酮)/g 得率 /% 平均得率 /%
100． 265 0． 841 0． 839
100． 038 0． 827 0． 827
100． 251 0． 836 0． 834 0． 833
100． 194 0． 832 0． 830
100． 162 0． 838 0． 837
从表 1可以看出，本方案各次实验的得率差异不
大，平均得率为 0． 833%，结果与文献报道一致［4］．
2． 2 红外测试结果
毛樱桃果肉总黄酮最终产物和芦丁标准品红
外光谱见图 2，从图 2 可以看出所得最终产物和芦
丁标准品有较好的拟合度．经过对标准品和最终产
物特征基团谱峰逐一检出比对，并确定归属，发现
其归属基团的对应度在 95%左右，可以说明该最
终产物与芦丁标准品具有较高的一致性，从而证明
了该产物具有较高的品质和纯净度，优于本课题组
以前提取的产物［5］．
图 2 芦丁标准品和最终产物红外光谱
Fig． 2 Infrared spectrum of rutin standard and product
2． 3 生物学活性检测结果
经统计学处理发现，与阴性对照组比较，毛樱
桃果肉总黄酮各剂量组均能明显抑制角叉菜胶所
致的小鼠足肿胀程度(P ＜ 0． 05) ，肿胀抑制率依次
为 31． 19%，46． 19%，52． 95%，呈剂量依赖趋势
(见图 3) ，其中 100 mg /kg组的肿胀抑制程度和地
塞米松组肉眼比较已经非常接近．
图 3 小鼠足肿胀实验结果
Fig． 3 The result of foot swelling test
3 讨 论
联合提取纯化法是一种把分离提取纯化有机
融合成一个体系的方法，该方法立足于系统性的开
发思路和整体性的开发视角，达到一次投料，经过
紧密连接的各个步骤最终得到理想结果．将联合提
取纯化法用于毛樱桃果肉总黄酮提取时发现，虽然
该方法是一个有机的整体，但是并不影响单独各个
步骤之间的更改，经过反复的实验，通过对该方法
中的各个环节进行不断的修正，最终得到了适用于
毛樱桃果肉总黄酮的提取方案．通过验证试验的结
果发现，该方案提取率较高且稳定，并且所得产物
呈黄色粉末状，很好地解决了以往单一法中难以除
去多糖的问题，使最终产物更加准确地保证了后续
实验剂量的精确性． 通过红外光谱也可看出，本方
案所得产物的杂峰少，和标准品的峰形峰面积均比
较接近．由此可知，本方案所得产物为纯净的黄酮
类化合物，且质量较好，增加了后续实验的可信度．
由小鼠足肿胀实验的结果可以看出，通过本方案提
取的毛樱桃果肉总黄酮具有良好的生物学活性，优
于本课题组往期的实验结果(往期由于产物不纯，
存在杂质，所以皮下注射时产生致炎反应，导致药
物作用效力下降)．
通过本次研究探索，总结了毛樱桃果肉总黄酮
的最佳提取纯化条件，并得到了纯净的总黄酮产
物，为下一步分析其中单体产物打下了坚实的基
础．但是，本实验方案中也有许多需要进一步改进
的地方，比如综合利用率相对低下，不少物质随着
废液或滤渣被弃去，因此，还需要进一步探索综合
利用率更高的方案．
参考文献:
［1］熊蔚蔚，丁雪馨，付瑶，等． 樱桃成分及其药理作用的
研究［J］． 北华大学学报:自然科学版，2010，11(5) :
408-411．
［2］张成义，邵世和，史玉玲．长白山毛樱桃总黄酮对冻伤
及炎症相关性的影响［J］． 中国免疫学杂志，2010，
26(11) :977-981．
［3］楚红英，李瑜，李华北，等． 苦菜中总黄酮的提取与含
量测定［J］． 安徽农业科学，2012，42(24) :12017-
12019．
［4］熊蔚蔚，徐铭键，刘健，等．毛樱桃总黄酮超声提取工艺优
选［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18(15):29-31．
［5］孙晶波，徐晶，陈璐，等． 毛樱桃乙醇提取物的试验研
究［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(10) :33-35．
【责任编辑:陈丽华】
581第 2 期 熊蔚蔚，等:毛樱桃果肉总黄酮最佳提取纯化工艺设计研究