全 文 ：57※基础研究 食品科学 2007, Vol. 28, No. 09
收稿日期：2007-02-06
作者简介：程霜(1970-)，男，副教授，博士，研究方向为膳食多酚与健康。
欧李多酚清除自由基活性研究
程 霜
(聊城大学食品科学与工程系， 山东 聊城 252059)
摘 要：采用大豆卵磷脂脂质模型系统、低密度脂蛋白体系和牛血清白蛋白介质三个不同的评价体系考察欧李多
酚的清除自由基和抗氧化活性。研究表明，欧李多酚的脂质过氧化和蛋白质氧化抑制呈剂量和时间依赖性方式，总
酚与抗氧化能力之间的相关性较好，能完全抑制由过氧自由基和铜离子诱导早期的共轭二烯(CD)的生成，延长脂
质氧化诱导期，有效地抑制由过氧自由基诱导的牛血清白蛋白氧化。欧李多酚能通过淬灭自由基的方式抑制因自由
基所致的生物膜、脂蛋白和血清白蛋白氧化损伤。
关键词：欧李；自由基清除剂；抗氧化活性；多酚成分
Free Radical Scavenging Activities of Polyphenols from Prunus humili Bge Fru t
CHENG Shuang
(Department of Food Science and Engineering, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)
Abstract ：The radical scavenging capacity of polyphenolic compounds from Prunus humilis Bgfruit was studied by three
different antioxidant tests system such as soybean phosphatidylcholine liposome model system, LDL media and bovine serum
album media. The correlation between the total phenols and antioxidant capacities assayed by the three methods is high, and
polyphenol in Prunus humilis Bge fruit is found to inhibit the lipid peroxidation and protein oxidation in a close-dependent and
a time course manner. There is a complete inhibition of conjugate diene (CD) formation induced by proxyl radicals and Cu2+ at
the early stages. In inhibition study of lipid peroxide, lag phase was increased. Peroxidation of BSA induced by proxyl radical is
also efficiently scavenged. Free radical scavenging activities present polyphenols from P unus humilis Bgefru t to b effect ve
antioxidants to protect against oxidative damage of biofilm, lipoprotein and serum protein induced by free radicals. These results
indicated that polyphenol in Prunus humilis Bge fruit has potential application value.
Key words：Prunus humilis Bge； free radical scavengers；antioxida t activity； polyphenolic compounds
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)09-0057-05
自由基具有较高的反应活性，参与许多重要的生命
过程，与细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤的诱发或抑
制、神经传导、细胞吸附、基因表达等有着密切的关
系，能引起与氧化损伤相关的各种病变[1]。大量研究表
明，自由基与动脉粥样硬化(AS) 发生、发展密切相
关，自由基极易修饰低密度脂蛋白(LDL)成为氧化型低
密度脂蛋白(ox- LDL)，导致动脉硬化的形成和心血管疾
病的发生[2]。自由基清除剂的研究对人类健康的意义重
大，清除多余自由基有益于某些疾病的预防和治疗，多
酚类物质大多具有较强的抗氧化、抗自由基作用，能
保护机体免遭氧化应激的损害，防治自由基氧化损伤相
关的各种疾病[3]。筛选优质天然产物并从中寻找、分离
安全、高效的成分对防治与自由基相关的各种疾病有着
极其重要的现实意义。
欧李(Prunus humilis Bge)，蔷薇科樱桃属、落叶
小灌木，根系发达，根群庞大，植株繁茂，具有固
沙、水土保持、抗蝗、耐旱、耐寒、耐盐碱等减灾
功能，是我国大西北干旱区域退耕还林的先锋树种[4]，
同时也是我国特有林草两用的经济灌木植物，为我国特
有果树[5]，欧李进入盛果期，亩产1000～2000kg，果
实营养极其丰富，鲜果中钙含量可达60mg/100g，铁含
量达1.5mg/100g(苹果分别为9mg/100g和0.24mg/100g)。
由于其钙含量高，且易被人体吸收，因此称为“钙
果”，被誉为天然珍果[6]，果仁可药用。生态建设优
先发展的国策，为固沙植物——欧李的基础研究提供了
良好的机遇。积极抓住这一契机，本研究对欧李多酚
类活性物质进行提取、分离、性能评价，揭示欧李果
实多酚化合物的成分组成，为全面考察欧李多酚的自由
2007, Vol. 28, No. 09 食品科学 ※基础研究58
基清除能力，探讨比较对不同体系、不同自由基的清
除能力及其所致的氧化损伤的抑制作用，以综合评价其
体外抗氧化活性。
自由基一般都不稳定，寿命很短，考察自由基的
清除能力是评价抗氧化物质抗氧化活性的重要手段，自
由基的清除能力会因实验体系或考察指标不同而得到不
同的结果。由于不同自由基的化学性质和作用环境不
同，选择合适的自由基对于评定自由基清除剂的生物活
性及其构效关系尤为重要[7]。本研究采用三个不同的评
价体系(大豆卵磷脂脂质模型系统、低密度脂蛋白体系
和牛血清白蛋白介质)考察欧李多酚的清除自由基和抗氧
化活性。通过一些必要的前期探索性研究，能加快欧
李基础研究的进程，将为推广欧李的种植和生态保护经
济化提供一条新的实践途径，为构筑欧李固沙产业提供
必须的基础理论及技术支持，使我国大片的沙漠、戈
壁成为经济发展的物质资源。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
欧李果 产自内蒙。
大豆卵磷脂(soybean phosphatidylcholine，PC) 中
国医药集团公司北京化学试剂采购站；22-盐酸脒基丙
烷[2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，
AAPH] Acros公司；人低密度脂蛋白 hLDL Sigma
公司；牛血清白蛋白(BSA) 鼎国公司；其余试剂为国
产分析纯。
HP8453A-紫外可见分光光度计(附Chemstation工作
站) Agilent公司；LPS-50荧光分光光度计 Perkin-Elmer
公司。
1.2方法
1.2.1多酚提取与含量测定
考虑到多酚化合物的热敏性、光敏性和高不稳定
性，选择甲醇按20:1的液料比室温避光超声提取三次，
合并提取液，减压蒸除甲醇，总酚含量采用Folin-
Ciocalteu法测定。20μl提取物样品溶液加入到 800μl
H2O中，再加入5ml 0.2mol/L Folin-Ciocalteu试剂、
4.0ml饱和Na2CO3溶液，室温放置2h后于765nm读取吸
收值，以没食子酸(gallic acid)为标准[8]。
1.2.2ROO· 清除活性
35mg大豆卵磷脂(soybean phosphatidylcholine，
PC)溶于2.0ml的CHCl3中，加入1ml提取液，30℃减压
蒸除溶剂，充N2保护残渣，残渣复溶于1ml的pH7.4
10mmol/L PBS中，旋涡振荡使产生均一的多胶束悬浮脂
质体，超声振荡30s，使粘附于容器壁的胶束集中于底
部。脂质体中加入2mmol/L的AAPH引发过氧化，于
37℃保温，间歇一定时间于234nm测定共轭二烯
(conjugated dienes，CD)的吸收值；干预实验同时加入
各种浓度欧李多酚共同保温孵育，计算CD生成量(摩尔
吸光系数为29500m2/mol)，CD生成量对时间作图，绘
制动力学曲线，过曲线拐点作切线，根据切线斜率计
算最大反应速率Vmax，切线与时间轴的交点即为潜伏期
(lag phase)，潜伏期越长表明氧化进程越慢，抗氧化物
的抗氧化作用越强[9]。
1.2.3抑制LDL氧化修饰
LDL用pH7.4，0.01mol/L PBS充分透析过夜去除
EDTA，在LDL(50μg蛋白/ml)溶液中加入CuSO4溶液至
终浓度为5μmol/L， 37℃保温孵育，于波长234nm测定
氧化产物CD含量，时间间隔20min，扫描时间10h，
干预实验同时加入各种浓度欧李多酚共同保温孵育，根
据LDL内多不饱和脂肪酸氧化产生的CD量随时间变化
绘制时间依赖氧化曲线，以潜伏时间表示LDL氧化敏感
性，以曲线斜率表示CD最大生成速率，以最大吸收差
(ΔAmax)表示CD总生成量[10]。
1.2.4抑制BSA氧化修饰
在10ml比色管中依次加入2.0ml BSA溶液及一定量
的欧李多酚溶液(多酚甲醇溶解后用Tris-HCl缓冲溶液稀
释)、2.0ml 0.5mol/L NaCl溶液维持离子强度模拟内环境，
以0.01mol/L pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液定容，37℃孵育，
选择激发波长为283nm，在300～450nm范围内扫描BSA
溶液的荧光光谱变化，确定欧李多酚与蛋白质之间的相
互作用。
向BSA-欧李多酚复合物溶液中加入AAPH溶液引发
BSA氧化反应，根据荧光变化程度计算BSA氧化抑制率：
(C0－Ct)－(S0－St)
BSA氧化抑制率(%)=———————————×100
C0－Ct
式中，C0为不含萃取物的空白样品起始荧光强度；
Ct为空白样品t时刻的荧光强度；S0为萃取物样品起始
荧光强度；St为萃取物样品t时刻的荧光强度[11]。
2 结果与分析
2.1ROO·清除活性
欧李多酚萃取物均能有效的抑制ROO·诱导的大
豆磷脂模拟膜脂质体过氧化，且呈浓度依赖效应(图
1)；脂质过氧化潜伏期随萃取物浓度的增加而延长，与
萃取物浓度呈明显相关性(R2=0.9932，图2)。
磷脂分子中的不饱和脂肪酸酰基链极易受自由基的
攻击发生过氧化反应，生成的脂质过氧自由基，从而
加剧一系列脂质过氧化反应所致的病理性反应[12]。生物
膜脂质过氧化的结果一方面是膜内高分子量的蛋白质聚
59※基础研究 食品科学 2007, Vol. 28, No. 09
合物、脂质聚合物以及蛋白质与脂质聚集物的不断形
成，另一方面造成脂肪酸链的不断分解与断裂，膜流
动性下降，膜完整性丧失，直接影响细胞膜结合蛋白
质(酶)的活性和细胞膜转运系统的调节功能，最终导致
细胞损伤甚至凋亡[13]。
水溶性的偶氮化合物2,2-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐
酸盐(AAPH)在生理温度下通过热分解而产生自由基，
由于由AAPH产生的自由基的速率很容易控制和测量，
具有稳定的热降解常数，且分解过程无生物转化现象产
生，是一种广泛采用的热降解自由基生成物[14]。AAPH
热降解产生的自由基与氧分子快速结合生成过氧自由
基，能引起典型的脂质过氧化，因此用AAPH引发自
由基为诱导膜损伤提供了一个好的方法。膜脂主要的氧
化产物是CD，CD的生成可被外源性抗氧化成分如人工
合成抗氧剂TBHQ、BHT、BHA、PG和天然酚类化合
物及其衍生物、代谢物等所抑制，多酚分子中含有还
原性羟基(-OH)功能基团，可直接捕捉和清除自由基，
或通过对其提供氢原子而阻断和终止自由基连锁反应
链，阻止和抑制过氧自由基的生成反应和脂质过氧化链
式反应的进行，抑制CD的生成，发挥抗氧化作用[15]。
欧李多酚具有较强的脂质过氧化抑制作用，抑制作
用可能与其花青素富含的可水解单宁单元成分、活性羟
基数目及其空间构象有关。Bors等的研究表明多酚化合
物对自由基的引发抑制和供氢能力取决于其成分组成及
其特殊的空间结构[16]。Hashimoto等对绿茶单宁的空间
结构与其抗氧化活力之间的关系进行了研究，结果表明
不同组成和空间结构的单宁自由基清除能力明显不同，
酚羟基的数目和空间结构对ROO·引发的脂质氧化具有
决定性影响，含可水解单宁化合物的抑制作用明显高于
不含没食子酸基的单宁化合物，原因是可水解单宁不仅
具有更强的供氢能力，而且经酯化后单宁的极性降低，
更有利于与磷脂膜结合发挥“内源性”自由基抑制剂
作用，抑制脂质过氧化的引发过程[17]。本研究结果显
示，欧李多酚显示出极强的AAPH诱导的脂质过氧化抑
制作用，可能是由欧李多酚富含可水解单宁单元的花青
素类成分所致。
2.2LDL氧化修饰
欧李多酚均能有效的抑制Cu2+诱导的LDL氧化修
饰，添加欧李多酚后LDL氧化进程明显减慢(图3)，且
抑制作用呈浓度依赖关系，LDL氧化最大速率随萃取物
浓度的增加而降低；脂质过氧化潜伏期随萃取物浓度的
增加而延长，与萃取物浓度呈明显相关性(R2=0.9815，
图4)。脂质过氧化过程最大CD生成时间随萃取物浓度
的增加而延长。
低密度脂蛋白氧化形成氧化型低密度脂蛋白(ox-
LDL)，ox-LDL是动脉粥样硬化(AS)发生和发展的关键因
素之一，具有很强的细胞毒性，能促进泡沫细胞形成，
改变内皮细胞功能状态，增加内皮细胞通透性，导致
400
300
200
100
0
0 20 40 60 80 100
0μg/ml 3.0μg/ml
6.0μg/ml 9.0μg/ml
12.0μg/ml 15.0μg/ml
18.0μg/ml
共
轭
二
烯
量
(μ
m
o
l
/
g

P
C
)
时间(min)
图1 欧李多酚对AAPH介导的脂质体氧化抑制的时间相关性
Fig.1 Time course inhibition of lipid peroxidation in soybean
PC liposome
100
80
60
40
20
0
0 4 8 12 16 20
y=2.5714x+26.429
R2=0.9932
延
迟
时
间
(
m
i
n
)
浓度(μg/ml)
图2 欧李多酚对AAPH介导的脂质体氧化抑制的浓度相关性
Fig.2 Concentration course inhibition of lipid peroxidation in
soybean PC l iposome
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100200300400500
0μg/ml 0.4μg/ml 0.6μg/ml
0.8μg/ml 0.10μg/ml 0.12μg/ml
0.14μg/ml 0.16μg/ml 0.18μg/ml
native LDL
A2
3
4
n
m
时间(min)
图3 欧李多酚对Cu2+介导的 LDL氧化抑制的时间相关性
Fig.3 Time course inhibition of lipid peroxidation in LDL by
various concentrations induced by 5mmol/L Cu2+ at 37 ℃
2007, Vol. 28, No. 09 食品科学 ※基础研究60
内皮细胞脱落，诱发动脉硬化斑块的形成[18]。鉴于LDL
氧化修饰在AS中的作用，用适当抗氧化剂抑制其氧化
可延缓AS的进展，Cu2+诱导LDL氧化是广泛采用的体
外LDL氧化模型，Cu2+在诱导LDL氧化过程中起着非常
重要的作用[19]。Hailliwell认为，LDL的氧化引发是由
Cu2+的还原所致，LDL的氧化程度与Cu2+的氧化还原状
态密切相关，能被还原剂所抑制[20]，具有较强供氢能力
的欧李多酚能通过促进Cu2+的还原、直接清除过氧自由
基等方式抑制LDL的氧化进程。另一方面，Cu2+与LDL
的结合是LDL氧化的重要因素、Kuzuya研究表明，80%
的Cu2+与LDL特殊部位结合，而且结合率与Cu2+量成
正比，金属离子螯合剂如EDTA、咖啡酸等通过羟基与
Cu2+结合，显著抑制Cu-LDL复合物的生成和LDL氧化
[21]。欧李多酚化合物中包含单宁化合物，具有很强的
金属离子螯合能力，能有效的结合Cu2+，从而减少Cu2+
与LDL的接触和结合机率，有效地推迟LDL氧化的启动
时间，降低LDL氧化速率，潜伏期随萃取物浓度的增
加而延长，且与欧李多酚浓度成很好的相关性。
2.3BSA氧化修饰
BSA中的色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧
光，加入欧李多酚对BSA在342nm处的强发射荧光光
谱具有明显的淬灭作用，且随着欧李多酚浓度的增
加，BSA的荧光强度呈规律性降低(图5)，说明欧李
多酚中的某些成分与BSA中的色氨酸或酪氨酸残基具
有相互作用。
欧李多酚对AAPH诱导的BSA荧光淬灭有明显
的抑制作用，抑制作用随欧李多酚浓度的增加而增
强，呈浓度依赖关系(图6)。欧李多酚对AAPH诱导
的BSA荧光淬灭的抑制作用与萃取物浓度呈明显相
关性(R2=0.9828，如图7)。
蛋白质是生命活动最重要的物质基础，血清白蛋白
是血浆中最丰富的蛋白质，可作为许多内源性和外源性
化合物的储存和转运蛋白，运输到受体部位，进而发
挥药理作用，对生命活动发挥重要作用。同时，蛋白
质也是自由基的主要攻击对象和靶标之一[22]。Davies等
对AAPH、AMVN诱导的BSA-线粒体膜模型系统中BSA
的氧化进行了考察。结果表明，AAPH不但导致BSA
的色氨酸残基氧化，而且还导致BSA的空间结构发生改
变，进而影响BSA的生理功能[23]。
600
400
200
0
0 0.5 1 1.5 2
y=247.45x+20.381
R2=0.9815
延
迟
时
间
(
m
i
n
)
浓度(μg/ml)
图4 欧李多酚对Cu2+介导的 LDL氧化抑制的浓度相关性
Fig.4 Concentration course inhibition of lipid peroxidation in
LDL by various concentrations induced by 5mmol/L Cu2+ at 37 ℃
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40
相
对
荧
光
强
度
时间(min)
图6 欧李多酚对AAPH介导的BSA氧化抑制的时间相关性
Fig.6 Time-dependent effect of polyphenols on AAPH-induced
BSA oxidation
0μg/ml 1.0μg/ml
1.2μg/ml 1.6μg/ml
2.0μg/ml 2.4μg/ml
120
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4
y=30.105x－0.4682
R2=0.9828
抑
制
率
(
%
)
浓度(μg/ml)
图7 欧李多酚对AAPH介导的BSA氧化浓度的相关性
Fig.7 Concentration course effect of polyphenols on AAPH-
induced BSA oxidation
700
600
500
400
300
200
100
0
300 350 400 450
0μg/ml
0.8μg/ml
1.2μg/ml
1.6μg/ml
2.0μg/ml
2.4μg/ml
荧
光
强
度
波长(nm)
图5 欧李多酚对BSA荧光淬灭影响
Fig.5 Fluorescence quenching effect of polyphenols on
emission spectra of BSA
↓
61※基础研究 食品科学 2007, Vol. 28, No. 09
荧光光谱法是研究生物大分子， 特别是蛋白质与各
种有机小分子、离子和无机化合物相互作用的重要手
段。可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结
构和所处微环境及其分布情况等重要信息， 同时还可以
得到外源物质与蛋白质分子相互作用及其对蛋白质结构
影响等的相关数据。BSA与包括单宁在内的多种多酚化
合物之间有相互作用，Frazier研究表明多酚化合物与B
SA的结合有两种模型：(1)由于多酚化合物有较多的羟
基，能与BSA分子疏水部位的肽键形成氢键或与蛋白侧
链氨基酸残基形成氢键，形成多酚-蛋白质复合物；(2)
多酚化合物围绕在蛋白质分子周围形成结构松散的配合
物[24]。本研究结果显示，欧李多酚与BSA之间具有较
大的结合常数，能形成复合物，说明欧李多酚中的一
些成分可以与BSA结合后发挥相应作用。
研究表明，欧李多酚-BSA复合物具有较强的自由
基清除能力，能显著抑制AAPH引发的BSA氧化损伤，
欧李多酚能通过复合物发挥抗氧化作用。Rohn研究表
明，多酚-蛋白质复合物与多酚化合物一样具有抗氧化
活性[25]。Arts等研究表明，多酚化合物与蛋白质结合
后，其抗氧化能力略有下降，但依然具有较强的抗氧
化能力，是良好的自由基清除剂[26]。研究结果表明，
作为单宁类成分的原花青素与BSA形成复合物后具有自
由基清除能力[27]。本研究结果为欧李多酚的进一步应用
提供了理论支持。
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