全 文 ：化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
第 26 卷第 5 期
2014 年 5 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Ｒesearch and Application
Vol． 26，No． 5
May，2014
文章编号:1004-1656(2014)05-0690-06
火棘果总黄酮的提取和纯化研究
黄 荣* ，傅小红
(成都师范学院化学与应用化学系，四川 成都 610041)
摘要:采用溶剂提取法、索氏提取法、循环超声提取法提取火棘果总黄酮，利用静态吸附方法筛选分离火棘果
总黄酮的最适大孔树脂，利用动态吸附方法研究最适大孔树脂纯化火棘果总黄酮的条件，并用紫外分光光度
法测定其含量。得出结果为循环超声提取时间短、效率高;D101 大孔吸附树脂纯化效果最好，最佳工艺为上
样浓度为 0. 899 8g·L－1，上样液 pH 为 4，上样体积 5BV，上样速率 2. 5mL·min－1，用 5BV70%乙醇以 2. 0 mL·
min－1速率洗脱，经树脂纯化后总黄酮的纯度由原来的 9. 00%提高至 28. 11%。
关键词:火棘果;总黄酮;大孔吸附树脂;提取;纯化
中图分类号:O629. 9 文献标志码:A
Ｒesearch on the extraction and purification of total
flavonoids from the fruits of pyracantha fortuneana
HUANG Ｒong* ，FU Xiao-hong
(Department of Chemistry and Applied Chemistry，Chengdu Normal University，Chengdu 610041，China)
Abstract:Methods of solvent extraction，Soxhlet extraction and ultrasonic circulation extraction were used for the extraction of total
flavonoids from pyracantha fortuneana fruits. Static absorption was adopted to screen the optimum macroporous resin for separating
total flavonoids. Dynamic absorption was introduced to study the conditions for purifying total flavonoids by using the selected opti-
mum macroporous adsorption resin. The analysis of the contents of total flavonoids was accomplished with UV spectrophotome-
try. The results showed that circulative ultrasonic wave extraction was the fastest and the most efficient. The optimum macroporous
resin was D101 as well as the optimum purification conditions were 0. 899 8mg·mL－1 of the sampling liquid concentration，pH 4 of
the sample solution acidity，5 BV of the sample liquid volume，2. 5 mL·min－1 of the sampling velocity，and 2. 0 mL·min－1 of the elu-
tion speed with 5 BV 70% ethanol. Under these conditions，the purity of total flavonoids increased from the original 9. 00% to
28. 11% .
Key words:fruits of pyracantha fortuneana;total flavonoids;macroporous adsorption resin;extraction;purification
火棘(Pyracantha fortuneana)为蔷薇科火棘属
植物，有很高的生态价值，我国的火棘资源非常丰
富［1］，火棘果实总提物具有清除氧自由基、降血
脂、增强免疫力、增强体力和促进消化功能等作
用，这与其含有金丝桃苷、山奈酚、槲皮素、花青
素、芦丁等黄酮类化合物有关［2］。火棘总黄酮在
医疗、保健方面有广阔的开发前景［3］，因此对火棘
果总黄酮的提取纯化研究有着深远的意义。查阅
文献资料，未见对火棘提取物进行纯化研究的报
道。本研究采用溶剂提取法、索氏提取法、循环超
收稿日期:2013-12-18;修回日期:2014-01-18
基金项目:四川省教育厅重点项目(12ZA257)资助
联系人简介:黄荣(1964-) ，女，副教授，主要从事天然产物开发工作。E-mail:rong936407@ 163. com
第 5 期 黄 荣，等:火棘果总黄酮的提取和纯化研究
声提取法对火棘果总黄酮的提取方法进行了筛
选，并选用 D101、D141、AB-8、HPD-100、DPD-100A
等 5 种大孔吸附树脂对火棘果提取物进行纯化研
究，旨在提高提取物中黄酮类的含量，确定其最优
纯化工艺，为进一步研究奠定基础。
1 实验部分
1. 1 主要仪器与试剂
TU-1901 双光束紫外—可见分光光度计(北
京普析) ;PHS-3CW 数字酸度计(上海殷特) ;
FA2204N分析天平(上海菁华公司) ;202-1A 电热
恒温干燥箱(北京中兴公司) ;KS 康氏震荡器(江
苏荣华仪器制造有限公司) ;HF-2B(北京弘祥隆
生物技术股份有限公司)。
芦丁对照品(成都康邦生物科技有限公司，含
量≥98%) ;火棘果(于 8－9 月份采自四川凉山州，
分别于 60℃烘干，粉碎过 60 目筛) ，D101 型大孔
树脂(天津大学农药厂) ，D141 型大孔树脂(上海
试剂一厂) ，AB-8，HPD-100，DPD-100A 型大孔树
脂(南开大学化工厂) ，其他化学试剂均为国产分
析纯。
1. 2 火棘果总黄酮的提取
溶剂提取法:取火棘果粉末样品 2 g，精密称
定，加 70%乙醇溶液 30 mL，回流提取 3 次，每次
提取 30min，合并提取液，抽滤，用 70%乙醇定容
至 100 mL，即得总黄酮粗品。
索氏提取法:取火棘果粉末样品 2 g，精密称
定，置索氏提取器中，加入 70%乙醇溶液 30 mL，
80℃提取 6 h，抽滤，用 70%乙醇定容至 100 mL，
即得总黄酮粗品。
循环超声提取法:取火棘果粉末样品 20 g，加
入 70% 乙醇溶液 300mL，用超声波循环装置提
取。参数设定:功率 1 000 w，转速 1 030 r·min－1，
超声波工作时间 3 s，间隙时间 1 s，提取时间 30
min，抽滤，用 70%乙醇定容至 1 000 mL，即得总黄
酮粗品。
1. 3 火棘果总黄酮的测定
1. 3. 1 测定波长的选择 取芦丁对照品溶液及
供试品溶液，以溶剂为空白，于 200－600 nm 波长
范围内光谱扫描。
1. 3. 2 标准曲线的绘制 精密称取 105℃下干燥
恒重的芦丁对照品 20 mg，用 70% 的乙醇溶解，摇
匀，定容至 100 mL，作为贮备液备用。分别精密吸
取该芦丁标准液 0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 mL 于
25 mL的量瓶中，加人 1. 0% A1C13 定容至刻度，
摇匀，静置 30 min。于 276 nm 处测试，以吸光度
值为纵坐标，浓度为横坐标绘制校准曲线。进行
回归分析，得回归方程为:Y = 0. 0385X，(r = 0. 999
8)。在 4－20 mg·L－1的范围内，浓度与吸光度有良
好的线性关系。
1. 3. 3 样品的制备和测定 取处理过的火棘果
粉末样品 20g，加入 70% 乙醇溶液 300 mL，用超声
波循环装置提取，抽滤，用 70%乙醇定容至 1000
mL。按上述标准曲线的实验步骤进行测定。
1. 4 大孔树脂的筛选
1. 4. 1 树脂预处理［4］ 称取大孔树脂 D101、
D141、AB-8、HPD-100、DPD-100A树脂适量于烧杯
中，分别用 95%的乙醇浸泡 4h，将浸泡后的树脂
倒入柱子中，并排除空气，继续用 95%的乙醇冲
洗，直至流出液无浑浊现象。用蒸馏水洗去乙醇，
用 5%的 HCl(用量为上柱体积的 2 倍)浸泡 30
min，用蒸馏水冲洗至 PH为中性。用 5%的 NaOH
(用量为上柱体积的 2 倍)浸泡 30 min，用蒸馏水
冲洗至中性，浸泡于去离子水中备用。
1. 4. 2 静态吸附及洗脱试验 取处理后的 D101、
D141、AB-8、HPD-100、DPD-100A 型湿树脂各 5 g
置于 100 mL锥形瓶中，加入样液 25 mL，摇床上振
荡 3 h，静止 48 h，过滤，测定滤液的总黄酮质量浓
度。计算静态吸附量(Q)和吸附率 E%。将静态
吸附后的树脂过滤抽干，置于具塞三角瓶中，加入
100 mL 70%乙醇，摇床上震荡 3 h，静止 48 h，待充
分解吸后过滤，按“1. 3. 2”方法测定滤液中总黄酮
浓度，计算各种树脂的解吸率。计算公式［5］:
静态吸附量 Q=(C0V0-C1V1)/W
吸附率 E% =(C0V0-C1V1)/C0V0 × 100%
解吸率 B% =C2V2 /(C0V0-C1V1)× 100%
式中:C0:吸附前总黄酮的质量浓度(g·L
－1) ;
C1:吸附后剩余液总黄酮的质量浓度(g·L
－1) ;C2:
解吸液中总黄酮质量浓度(g·L－1) ;V0:样品体积
(mL) ;V1:吸附后剩余溶液体积(mL) ;V2:解吸体
积(mL) ;W:树脂质量(g)。
1. 4. 3 动态吸附试验及洗脱实验 动态吸附:取
处理好的 D101 和 AB-8大孔吸附树脂各 5 g(湿树
脂) ，装于 1 cm × 20 cm 的柱内，加火棘果提取液
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化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
(总黄酮浓度 0. 899 8 g·L－1)于柱顶，以 2. 5 mL·
min－1的流速进行动态吸附，流出液每 2mL 收集一
管，按“1. 3. 2”方法测定滤液中总黄酮浓度，绘制
D101 和 AB-8两种树脂的泄露曲线。
动态解吸:取处理好的 D101 和 AB-8 大孔吸
附树脂各 5 g(湿树脂) ，装于 l cm × 20 cm 的柱
内，加火棘果提取液(总黄酮浓度 0. 899 8g·L－1)
于柱顶，以 2. 5 mL·min－1的流速进行动态吸附。
吸附后平衡 1 h，同等流速下先用适量水洗脱(盐
酸-锌粉定性鉴定反应阴性) ，再用 5 BV 70%乙醇
洗脱，流出液每 2mL 收集一管，按“1. 3. 2”方法测
定滤液中总黄酮浓度，绘制 D101 和 AB-8 两种树
脂的动态解吸曲线。
1. 5 D101 大孔树脂纯化工艺研究
1. 5. 1 上样液 pH对吸附率的影响 取预处理好
的 D101 大孔吸附树脂 6 份，每份 5 g(湿树脂)分
别装于 l cm × 20 cm的层析柱内，精密量取火棘果
提取液(总黄酮浓度 0. 899 8 g·L－1)6 份，置于具
塞三角瓶中，分别凋 pH 为 2、3、4、5、6、7，加于柱
顶，以 2. 5 mL·min－1的流速通过层析柱吸附，按
“1. 3. 2”方法测定流出液中总黄酮浓度，计算吸附
率。
1. 5. 2 上样液浓度对吸附率的影响 取预处理
好的 D101 大孔吸附树脂 4 份，每份 5 g(湿树脂)
分别装于 1 cm × 20 cm 的层析柱内，从火棘果提
取液中分别取 3、4、5、6mL 稀释到 25 mL，其浓度
分别为 0. 539 9 g·L－1、0. 719 8 g·L－1、0. 899 8 g·
L－1、1. 0798 g·L－1，分别调 pH=4，加于柱顶，以 2. 5
mL·min－1的流速通过层析柱吸附，收集流出液，按
“1. 3. 2”方法测定流出液中总黄酮浓度，计算吸附
率。
1. 5. 3 上样流速对吸附率的影响 取预处理好
的 D101 大孔吸附树脂 6 份，每份 5 g(湿树脂)分
别装于 1 cm × 20 cm 的层析柱内，取火棘果提取
液(总黄酮浓度 0. 899 8 g·L－1)调 pH = 4，加于柱
顶，分别以 0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3 mL·min－1的流速
通过层析柱吸附，收集流出液，按“1. 3. 2”方法测
定流出液中总黄酮浓度，计算吸附率。
1. 5. 4 洗脱剂浓度对解吸率的影响 取预处理
好的 D101 的大孔吸附树脂 6 份，每份 5 g(湿树
脂)分别装于 1 cm × 20 cm的层析柱内，火棘果提
取液(总黄酮浓度 0. 899 8g·L－1)5 份调 pH = 4，分
别以 2. 5 mL·min－1的速率进行上柱，以相同速率
用适量纯化水洗脱后(盐酸-锌粉定性鉴定反应阴
性) ，各层析柱分别用 10%、30%、50%、70%、
80%、95% 乙醇进行洗脱，洗脱速度 2. 0 mL·
min－1，收集洗脱液，按“1. 3. 2”方法测定洗脱液总
黄酮浓度，计算解吸率。
1. 5. 5 洗脱速率对解吸率的影响 取预处理好
的 D101 的大孔吸附树脂 5 份，每份 5 g(湿树脂)
分别装于 l cm × 20 cm的层析柱内，火棘果提取液
(总黄酮浓度 0. 899 8 g·L－1)6 份调 pH=4，分别以
2. 5 mL·min－1的速率进行上柱，以相同速率用适量
纯化水洗脱后(盐酸-锌粉定性鉴定反应阴性) ，各
层析柱用 70%的乙醇进行洗脱，洗脱速率为 0. 5
mL·min－1、1. 0 mL·min－1、2. 0 mL·min－1、3. 0 mL·
min－1，4. 0 mL·min－1，收集洗脱液，按“1. 3. 2”方法
测定洗脱液中总黄酮浓度，计算其解吸率。
1. 5. 6 洗脱剂用量对解吸率的影响 取预处理
好的 D101 的大孔吸附树脂 6 份，每份 5 g(湿树
脂)分别装于 1 cm × 20 cm的层析柱内，火棘果提
取液(总黄酮浓度 0. 899 8 g·L－1)调 pH = 4，分别
以 2. 5 mL·min－1的速率上柱，以相同速率用适量
纯化水洗脱后(盐酸-锌粉定性鉴定反应阴性) ，各
层析柱分别用 3BV、4BV、5BV、6BV、7BV、8BV 的
70%的乙醇进行洗脱，洗脱速率为 2. 0 mL·min－1，
收集洗脱液，按“1. 3. 2”方法测定洗脱液中总黄酮
浓度，计算其解吸率。
2 结果与讨论
2. 1 火棘果总黄酮提取结果
采用溶剂提取法、索氏提取法、超声循环提取
法三种方法提取火棘果粉末中总黄酮，并进行了
对比，结果见表 1。
表 1 不同提取方法的比较
Table 1 comparison of extraction rates
with different extraction methods
提取方法
乙醇体积分数
/%
料液比
提取时间
/min
提取率
/%
溶剂提取法 70 1 ∶15 90 10. 87
索氏提取法 70 1 ∶15 360 12. 16
循环超声提取法 70 1 ∶15 30 14. 80
由表 1 可知，超声循环提取法采用物料循环，
超声场固定分布，达到快速提取的目的，与溶剂提
取法和索氏提取相比，超声提取技术大大缩短提
296
第 5 期 黄 荣，等:火棘果总黄酮的提取和纯化研究
取时间，而且提高了火棘果中总黄酮的提取效率，
适用于工业化生产。
2. 2 火棘果总黄酮定量测定方法结果
实验中发现用不同方法测定黄酮的结果差异
较大，NaNO2-Al(NO3)3 分光光度法干扰严重
［4］，
选择以 A1C13 为显色体系
［5］来测定火棘果中总黄
酮的含量，以芦丁为对照品加 1. 0% A1C13，采用
紫外分光光度法测定。
2. 2. 1 测定波长的选择 取芦丁对照品溶液，以
溶剂为空白，于 200-600 nm波长范围内光谱扫描，
由光谱图表明，芦丁在波长 410 nm 和 272 nm 处
有最大吸收。另取火棘果总黄酮提取液，在相同
条件经紫外扫描，发现在 276 nm 处有最大吸收
峰，在 410 nm 处没有最大吸收，故确定检测波长
为 276 nm。
2. 2. 2 稳定性与重复性实验 准确吸取火棘果
样品按“1. 3. 3”方法制备的样品溶液，按“1. 3. 2”
方法测定吸光度，每隔 30 min测定 1 次，连续测定
6 次，结果 3 h内 ＲSD=2. 03%，表明样品溶液在 3
h基本稳定。准确吸取 6 份火棘果同批样品按照
“1. 3. 3”的方法制备样品溶液，按照“1. 3. 2”操作
方法测定其吸光度，结果 ＲSD = 2. 15%，表明该方
法重复性良好。
2. 2. 3 精密度与回收率实验 准确吸取芦丁对
照品溶液 1 mL，共 6 份，按照“1. 3. 2”方法测定其
吸光度，结果为 ＲSD = 1. 53%，表明该方法精密度
良好。取已知含量的火棘果样品，分别加入一定
量的芦丁对照品，按“1. 3. 3”的方法制备样品溶
液，按照“1. 3. 2”方法测定其吸光度，计算回收率，
结果见表 2。
表 2 样品加标回收率实验结果(mg，n=6)
Table 2 recovery and precision data on sample(mg，n=6)
样品含量 加入量 测得量 回收率 /% 珔X /% ＲSD%
0. 402
0. 403
0. 395
0. 399
0. 408
0. 406
0. 2
0. 2
0. 2
0. 2
0. 2
0. 2
0. 594
0. 601
0. 596
0. 597
0. 608
0. 602
96. 0
99. 0
101
99. 0
102. 5
98. 0
99. 3 2. 30
由表 2 可知该方法回收率良好，可用于火棘
提取物中总黄酮的测定。
2. 3 大孔树脂的筛选
2. 3. 1 静态吸附及洗脱试验 选择 5 种大孔树
脂进行静态吸附及洗脱试验，其结果见表 3。
表 3 不同型号大孔树脂对火棘总黄酮的吸附性能的比较
Table 3 Comparison of adsorption property of total flavonoids in fruits of pyracantha fortuneana by different resins
树脂型号
剩余液总黄酮
浓度 /g·L－1
吸附量
/mg·g－1
吸附率 /%
解吸液中总黄酮
浓度 /g·L－1
解吸率 /%
D101 0. 2621 3. 19 70. 87 0. 1459 84. 36
AB-8 0. 2664 3. 17 70. 39 0. 1298 81. 97
D141 0. 5574 1. 71 38. 05 0. 05826 68. 06
HPD-100 0. 4890 2. 05 45. 65 0. 05836 56. 83
HPD-100A 0. 4321 2. 34 51. 98 0. 07059 60. 37
从表 3 可见，5 种树脂中 D101 和 AB-8树脂对
火棘总黄酮的吸附率相近，解吸率也差不多，为进
一步确定最适合纯化树脂，故同时选择 D101 和
AB-8树脂进行动态研究。
2. 3. 2 D101 和 AB-8 动态吸附试验及洗脱实验
D101 和 AB-8动态吸附和洗脱实验结果见图 1、
图 2。
由图 1、图 2可以看出两种树脂中 D101的泄露
时间点较 AB-8前，但达到饱和吸附后，D101的吸附
量较 AB-8大。由动态解吸曲线可知，D101 大孔吸
附树脂动态解吸率明显大于 AB-8，可减少洗脱溶剂
的用量。结合动态吸附试验，选择 D101 大孔吸附
树脂树脂作为火棘果总黄酮的纯化树脂。
图 1 AB-8和 D101 泄露曲线的比较
Fig. 1 Comparison of leak curve with AB-8 and D101 resin
396
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
图 2 AB-8和 D101 动态解吸曲线的比较
Fig. 2 Comparison of dynamic desorption
curve with AB-8 and D101 resin
2. 4 D101 大孔树脂纯化工艺研究
2. 4. 1 上样液 pH 对吸附率的影响 pH 值可直
接影响黄酮的存在形式，进而影响吸附效果。黄
酮上样液的 pH(2-7)对树脂吸附性能的影响见图
3。由图 3 可见，最适宜是 PH 为 4. 0。故采用 PH
为 4 的上样液实验。
图 3 上样液 pH对吸附率的影响
Fig. 3 Effect of sample solution PH on the adsorption rate
2. 4. 2 上样液浓度对吸附率的影响 上样液浓
度对树脂吸附性能的影响见图 4。由图 4 可见，随
上样液质量浓度的降低，洗脱率逐渐下降，综合考
虑选择上样液质量浓度 0. 899 8 g·L－1。
图 4 上样液浓度对吸附率的影响
Fig. 4 Effect of sample solution concentration
on the adsorption rate
2. 4. 3 上样流速对吸附率的影响 上样流速对
树脂吸附性能的影响见图 5，由图 5 可见，吸附速
率对火棘总黄酮的吸附率影响较小，从节约时间
的角度考察，采用 2. 5 mL·min－1的上样流速。
图 5 上样流速对吸附率的影响
Fig. 5 Effect of sample flow rate on the adsorption rate
2. 4. 4 洗脱剂浓度对解吸率的影响 不同浓度
(10% -95%)乙醇对火棘果粗提液总黄酮的洗脱
效果的影响见图 6。由图 6 可见，随着乙醇浓度的
升高，解吸率也随之升高，但用 95%乙醇洗脱时其
解吸率很大，说明 95%乙醇洗脱能力最强，但杂质
也可能被解吸，导致结果偏高。综合考虑成本、解
吸率等因素，故选择 70%乙醇作为洗脱溶剂。
图 6 洗脱剂浓度对解吸率的影响
Fig. 6 Effect of eluant concentration on desorption rate
2. 4. 5 洗脱速率对解吸率的影响 洗脱速率对
树脂解吸性能的影响见图 7，由图 7 可见，随着洗
脱速率的增加，解吸率减少，但洗脱速率减少，其
洗脱时间增长，综合考虑两因素的影响，故采用
2. 0 mL·min－1的洗脱速率。
图 7 洗脱速率对解吸率的影响
Fig. 7 Effect of eluant flow rate on desorption rate
496
第 5 期 黄 荣，等:火棘果总黄酮的提取和纯化研究
2. 4. 6 洗脱剂用量对解吸率的影响 洗脱剂用
量对树脂解吸性能的影响见图 8，由图 8 可见，当
洗脱液用量超过 5 BV 时，解吸率基本不再增加，
故选择 5BV70%乙醇溶液。
图 8 洗脱剂用量对解吸率的影响
Fig. 8 Effect of eluant amount on desorption rate
2. 5 最佳条件的纯化效果
取预处理好的 D101 的大孔吸附树脂 3 份，每
份 5 g(湿树脂)分别装于 1 cm × 20 cm 的层析柱
内，火棘果提取液(总黄酮浓度 0. 899 8 g·L－1)3
份调 pH=4，分别以 2. 5 mL·min－1的速率上柱，以
相同速率用适量纯化水洗脱，再用 5BV 的 70%乙
醇溶液以 2. 0 mL·min－1的速率洗脱，取上柱液、洗
脱液 25 mL，倒人恒重蒸发皿中水浴蒸干，于 60℃
烘箱中干燥至恒重，按步骤“1. 3. 2”的方法测定其
总黄酮的含量，纯化前总黄酮纯度 9. 00%，纯化后
总黄酮纯度 28. 11%(n = 3，ＲSD = 2. 34%)。树脂
纯化后总黄酮纯度提高了 3. 12 倍，表明纯化效果
较好。
3 讨 论
利用超声提取技术大大缩短提取时间，而且
提高了火棘果中总黄酮的提取效率，适用于工业
化生产。
实验中发现用不同方法测定黄酮的结果差异
较大，NaNO2-Al(NO3)3 分光光度法干扰严重，选
择以 A1C13 为显色体系，采用紫外分光光度法测
定火棘果提取物总黄酮含量方法简便，检测重现
性好，结果更为合理。
本实验用 5 种大孔吸附树脂对火棘果总黄酮
进行了纯化研究，采用静态和动态的吸附与解吸
试验确定了 D101 大孔吸附树脂为纯化火棘果总
黄酮的最佳树脂，并考察了上柱原液总黄酮浓度、
流速、pH 和洗脱剂等影响因素，最终得出了火棘
果总黄酮纯化的最佳条件为:调节火棘果提取液
总黄酮浓度为 0. 899 8 g·L－1，调 pH=4，以 2. 5 mL
·min－1的流速上样，以相同速率用适量纯化水洗
脱，再用 5BV的 70%乙醇溶液以 2. 0 mL·min－1的
速率洗脱，经树脂富集后黄酮的纯度为 28. 11%，
比纯化前的速度提高了 3. 12 倍。
火棘果乙醇提取物回收乙醇后会产生不溶
物，影响纯化效果，但对不溶物进行含量分析后发
现含有黄酮类物质，故本研究对火棘果提取物适
量回收乙醇后进行上样。乙醇含量高也会影响树
脂的吸附能力。
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(责任编辑 罗 娟)
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