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火棘果不同极性部位提取物体外
抗氧化研究
翁文江1，2，3，高 雪1，2，3，*
( 1.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室，重庆 400067;
2.重庆工商大学天然药物研究重庆高校市级重点实验室，重庆 400067;
3.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆 400067)
摘 要:目的:系统地评价火棘果粗分体系抗氧化活性，同时探究抗氧化能力与总多酚含量之间的关系。方法:用 75%乙
醇冷浸提取火棘果，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水分为四个不同极性部位，然后测定了各部位萃取物对 DPPH自
由基、ABTS +自由基的清除能力，并且测定了总还原力、FＲAP值和总多酚含量，同时考察总酚含量与抗氧化活性的关系。
结果:火棘果提取物的不同极性部位均有抗氧化活性，其中水、乙酸乙酯和正丁醇部位提取物表现出较好的抗氧化活性，
石油醚部位的抗氧化活性最弱; 各部位提取物的抗氧化活性与总多酚含量呈现较好的相关关系。其中，水部位提取物对
DPPH和 ABTS +自由基清除率最高，IC50值分别为( 0.76 ± 0.03) mg /mL和( 1.71 ± 0.10) mg /mL;乙酸乙酯部位 FＲAP 值最
大，为( 382.20 ±4.72) μmolFe2 + /g干样;正丁醇部位总酚含量最高，为( 2763 ±3.91) mgGAE/100g干样。
关键词:火棘果，抗氧化活性，总多酚含量
Study on antioxidant activity in vitro about different solvent extracts
of fruits of Pyracantha fortuneana
WENG Wen－jiang1，2，3，GAO Xue1，2，3，*
( 1.Chongqing Key Lab of Catalysis ＆ Functional Organic Molecules，Chongqing Teachnology and Business University，
Chongqing 400067，China; 2.Chongqing Key Laboratory of Natural Medicine Ｒesearch，Chongqing Technology and
Business University，Chongqing 400067，China; 3.School of Environment and Biological Engineering，
Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China)
Abstract: Objective: To evaluatethe antioxidant activity of fruits of Pyracantha fortuneana comprehensively，and
explore the relationship between the antioxidant activity and total polyphenol content.Methods: Extracting fruits of
Pyracantha fortuneana with 75% ethanol，petroleum ether，ethyl acetate，n － butanol and water extracts were
obtained.All extracts were evaluated by DPPH free radical and ABTS + free radical scavenging activity，the total
reducing power，the fluorescence recovery after photobleaching experiment ( FＲAP) and the total polyphenol
content.Conclusions: All extracts of fruits of Pyracantha fortuneana exhibited antioxidant activities. The water，
n－butanol and ethyl acetate extracts both exhibited preferable antioxidant activity，the petroleum ether extract had
the weakest antioxidant activity.Antioxidant activities of both extracts were generally positively related with the total
polyphenol content.The water extract showed the highest radical scavenging rate on DPPH and ABTS +，the IC50
were ( 0.76 ± 0.03) mg /mL and ( 1.71 ± 0.10) mg /mL.The ethyl acetate extract showed the highest value of FＲAP
with( 382.20 ± 4.72) μmolFe2 + /g.The highest content of total phenolics was from n－ butanol extract with ( 2763 ±
3.91) mg GAE/100g.
Key words: fruits of Pyracantha fortuneana; antioxidant activities; total polyphenol content
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2015)01－0077－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 01． 008
收稿日期:2014－03－05
作者简介:翁文江( 1990－ ) ，男，在读硕士研究生，研究方向:环境生物
质资源化研究。
* 通讯作者:高雪( 1980－ ) ，女，博士，副研究员，研究方向: 天然产物
化学的研究。
基金项目:重庆市科技创新团队项目( KJTD201020) ;国家自然科学基
金资助( 21402017) 。
火棘(Pyracantha fortuneana)为蔷薇科苹果亚科 (Maloideae)火棘属(Pyracantha)多年生常绿灌木［1］。
火棘的药用曾记载于《滇南本草》和《本草纲目》，近
年来的研究表明火棘果实具有潜在的食用和药用开
发价值。据报道火棘果具有无毒、清除自由基、增强
免疫力、降低血脂和促进代谢等作用［2］，有关火棘果
清除自由基的研究多集中于总提物、火棘多酚和火
棘多糖等成分［2－4］。为了系统地评价火棘果总提物
不同极性部位的抗氧化活性，同时探究抗氧化能力
与其总多酚含量之间的关系，本文检测了火棘果不
78
同极性部位提取物清除 DPPH·、ABTS +·的活性，总
还原能力、FＲAP 法抗氧化能力以及总酚含量，获取
了火棘果不同极性部位提取物体外抗氧化基础数
据，分析了四种抗氧化检测方法的相关关系以及抗
氧化活性与总多酚含量的相关关系，可望为火棘果
开发植物性天然无毒抗氧化剂和功能性保健食品提
供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
火棘果 采自重庆城口县;1，1－二苯基苦基苯
阱(DPPH) 上海晶纯试剂有限公司;抗坏血酸(分
析纯) 阿拉丁公司;ABTS［2，2 －联氮－二(3 －乙
基－苯并噻唑－6－磺酸)二铵盐］ 上海山浦化工有限
公司;TPTZ(2，4，6－三吡啶基均三嗪) 东京化成工业
株式会社;福林酚 天津光复精细化工研究所;无水乙
醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、过硫酸钾、铁氰化钾、三
氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁等 国产分析纯。
Ｒe－2000 型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器
厂;明澈－D24UV 实验室超纯水机 Millipore 公司;
Acculab电子天平 德国赛多利科学仪器有限公司;
Infinite M200 型酶标仪 Tecan 公司;Biofuge Stratos
台式高速冷冻离心机 Thermo Fisher 公司;Gilson P
型微量移液器 四川吉尔森仪器有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 火棘果不同溶剂提取工艺 将新鲜摘取的干
净野生火棘果放入 60℃烘箱中烘干，粉碎，用 75%乙
醇冷浸提取 3 次，每次 7d。浸出液经过滤、减压浓
缩、干燥得到火棘果总提物。将总提取物溶于温水
中，依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取 2～3 次，
合并萃取液，最后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、
正丁醇部位和水部位的萃取物。将各组萃取物减压
浓缩后，真空冷冻干燥至恒重，密封置于冰箱冷藏
备用。
1.2.2 各相萃取物清除 DPPH 自由基活力的检测
采用 Blois 等［5］的方法并加以改进。用无水乙醇将
DPPH配制成 1mmol /L的溶液。在 1.5mL tuber 管中
分别准确加入 200μL 样品待测溶液和 200μL DPPH
溶液，混和均匀后，然后暗处室温下放置 30min，最后
在波长 517nm处测定吸光值，平行测定 3 次，用抗坏
血酸(VC)为阳性对照。按下列式子计算各待测样品
对 DPPH自由基的清除率:
清除率(%)=［1 －(Ai－Aj)/Ac］× 100
式中:Ai 为 200μL DPPH 试剂与 200μL 样品溶
液的混合液吸光度;Aj 为 200μL 样品溶液与 200μL
无水乙醇混合液的吸光度;Ac 为 200μL 无水乙醇与
200μL DPPH溶液的混合液吸光度。
1.2.3 各相萃取物清除 ABTS 自由基活力的检测
采用 Carrasco－ Castilla 等［6］的方法并加以调整。取
38.4mg ABTS 溶解于 10mL 水中形成 7mmol /L 的溶
液，然后加入 6.6mg 过硫酸钾固体，溶液颜色瞬间变
成蓝绿色，旋涡均匀后形成的混合溶液中过硫酸钾
的最终浓度为 2.45mmol /L，迅速将上述混合溶液置
于室温黑暗条件下 12～16h。测试样品之前，将上述
溶液用 pH7.4 的磷酸缓冲液稀释到在 734nm 处的吸
光度为 0.70 ± 0.002，得到待测 ABTS +·溶液。将
990μL ABTS +·液中加入10μL的样品溶液，旋涡均匀
之后孵育 5min 检测吸光值。用抗坏血酸(VC)为阳
性对照，ABTS +自由基清除百分比计算:
清除率(%)=［1 －(A－B)/C］× 100
其中，A:990μLABTS + 10μL 样品 /对照品混合
液的吸光度;B:990μL 磷酸缓冲液 + 10μL 样品 /对
照品混合液的吸光度;C:990μL ABTS + 10μL去离子
水混合液的吸光度。
1.2.4 各萃取部位总还原力的测定 采用 Liu S 和
马合木提·买买提明［7－8］的方法并稍加调整。取火棘
提取物溶液 100μL与 250μL 0.2mol /L pH6.6的磷酸纳
缓冲液和 250μL 1%的 K3Fe(CN)6 混合均匀，混合溶
液在 50℃水浴中孵育 30min。将 10%的三氯乙酸
250μL加入混合溶液后旋涡均匀，室温下 3000r /min
离心 20min。最后，取 250μL 上清液、250μL 蒸馏水
和 0.1%的 FeCl3 溶液 50μL混合均匀，在 700nm处检
测吸光度。用抗坏血酸(VC)为阳性对照。
1.2.5 各萃取部位 FＲAP 值检测 参考 Benzie 等［9］
的方法并加以改进。将 300mmol /L 醋酸盐缓冲液
(pH3.6)、20mmol /L FeCl3 溶液、40mmol /L HCl 配制
的 10mmol /L TPTZ 溶液按照体积比 10 ∶1 ∶1 混合均
匀，配制成 FＲAP试剂，备用。取 100μL 样品或对照
物和 1mL 预热至 37℃的 FＲAP混合、旋涡均匀，5min
后 593nm处检测吸光值，去离子水作为参照液。根
据以上相同步骤，用 FeSO4 标准溶液做出标准曲线。
通过吸光值求得标准曲线上相应 FeSO4 的浓度
(μmolFe2 + /L)，定义 FＲAP值为样品 FＲAP值等值于
每克干样品中 Fe2 +微摩尔数(μmolFe2 + /g干样品)。
1.2.6 总多酚含量(TPC)测定 根据福林酚比色法
原理，采用 Kim等［10］的方法并加以改进。取 50μL一
定浓度的样品液与 25μL福林酚试剂混合均匀，孵育
3min，然后加入 2%(w /v)的 Na2CO3 溶液 1mL，旋涡
均匀，常温暗室放置 60min 后于 756nm 读吸光值。
根据以上相同步骤，用没食子酸标准溶液做出测总
酚的标准曲线，样品总酚含量等值于每 100g 干样品
中五倍子酸的毫克数(mgGAE /100g干样品)。
1.3 数据处理与相关性分析
计算结果以均值 ±标准差(x ± s)表示，绘图采
用 Origin7.1 软件，相关性分析由 SPSSv19.0 软件分
析。抗氧化活性的相关性分析以样品浓度为
1.25mg /mL的数据带入。
2 结果与分析
2.1 清除 DPPH自由基能力
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙
醇溶液呈深紫色，具有单一电子，在波长为 517nm 下
具有最大光吸收，有自由基清除剂存在时，DPPH 的
单电子被捕捉而使其颜色变浅［11］。根据表 1 可知，
火棘果提取物清除 DPPH自由基的能力:在较低浓度
范围下，水相和乙酸乙酯部位萃取物清除 DPPH自由
基的能力相差不大，清除效果均较好，正丁醇部位次
之，效果最差的是石油醚部位提取物。水部位提取
79
表 1 不同溶剂提取物体外抗氧化实验清除自由基 IC50值、FＲAP值和总酚含量
Table 1 The results of antioxidant activity in vitro(IC50，FＲAP)and TPC of different solvent extracts
项目 石油醚部位 乙酸乙酯部位 正丁醇部位 水部位
清除 DPPH·IC50(mg /mL) 1.55 ± 0.02a 0.80 ± 0.01c 1.20 ± 0.05b 0.76 ± 0.03c
清除 ABTS +·IC50(mg /mL) 6.9 ± 0.22a 3.43 ± 0.12b 2.11 ± 0.24c 1.71 ± 0.10d
FＲAP值 332.00 ± 10.65c 382.20 ± 4.72a 359.02 ± 5.16b 372.37 ± 5.49a
总酚含量(mgGAE /100g) 1987 ± 3.28d 2757 ± 0.81b 2763 ± 3.91a 2614 ± 1.49c
注:同一行标记字母不同，表示显著差异，p ＜ 0.05。
物和乙酸乙酯部位提取物清除自由基的能力强，IC50
均小于 1mg /mL，分别为(0.76 ± 0.03)mg /mL和(0.80
± 0.01)mg /mL。当浓度达到 2.5mg /mL时，水部位提
取物对 DPPH自由基清除率达到 93.45%，乙酸乙酯
部位提取物对 DPPH自由基清除率高达 94.79%。可
能的原因是清除 DPPH 自由基活性成分主要被富集
在水部位和乙酸乙酯部位。
图 1 不同溶剂提取物对 DPPH自由基的清除作用
Fig.1 DPPH·scavenging rate of different solvent extracts
2.2 清除 ABTS自由基能力
ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的
ABTS +，在抗氧化物存在时 ABTS + 的产物会被抑
制［12］，已广泛应用于天然药物、海洋生物、果蔬类等
的抗氧化能力的评价。火棘果各部位提取物表现出
的 ABTS +自由基清除活力对浓度呈正相关。其中，
水部位提取物清除 ABTS +自由基的 IC50值为(1.71 ±
0.10)mg /mL，正丁醇部位和乙酸乙酯部位提取物分
别为(2.11 ± 0.24)mg /mL 和(3.43 ± 0.12)mg /mL，石
油醚部位最弱，IC50值大于 5mg /mL，效果都要差于阳
性对照 VC。当浓度达到 5mg /mL 时，乙酸乙酯部位
提取物对 ABTS +自由基清除率为 78.50%，水部位提
取物清除率则为 86.34%。由表 1 和图 2 可以得出，
水相部位提取物对 ABTS +自由基清除能力最强，石
油醚部位最弱。出现这种结果的原因可能是火棘果
中清除 ABTS +自由基的活性成分极性大小较大，主
要富集于水部位和正丁醇部位。李伟等［4］研究发现
由于物质结构的差异，同一种多酚类物质对不同自
由基清除率有差异。因而推测引起火棘果不同极性
部位对两种自由基清除作用的差异可能与火棘果活
性成分结构的不同以及自由基的结构性质有关。
2.3 总还原力测定结果
在还原能力测定实验中，样品中的抗氧化剂的
存在将导致铁氰化钾中 Fe3 +得到一个电子被还原成
Fe2 +，Fe2 +进一步生成在 700nm处有最大吸光值的普
图 2 不同溶剂提取物对 ABTS自由基的清除作用
Fig.2 ABTS +·scavenging rate
of different solvent extracts
鲁士蓝，因此测定 700nm 处吸光值可以反应抗氧化
剂还原能力的大小［13］。一般地，样品在一定浓度范
围内，还原力强弱与抗氧化性溶液浓度呈正相关性。
由图 3 可知，VC 在较低浓度就表现出非常好的总还
原能力，火棘果各部位总还原能力最强的是水部位
萃取物，乙酸乙酯和正丁醇部位部位萃取物次之，石
油醚部位萃取物的总还原能力最弱，均弱于阳性对
照 VC。样品浓度低于 0.625mg /mL时，还原力相差不
大;样品浓度高于 1.25mg /mL时，总还原力值开始出
现差异，但乙酸乙酯部位和水部位依然差异不明显。
图 3 不同溶剂提取物的总还原能力
Fig.3 Ｒeduction abilities of different solvent extracts
2.4 FＲAP值测定结果
Fe3 +吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二
价铁形式，呈现出蓝色，并于 593nm处具有最大光吸
收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱，
FＲAP值越大，抗氧化活性越强。通过线性拟合，
FeSO4 标准曲线方程式为:Y = 1.1408X－0.004，Ｒ
2 =
0.9999，p ＜ 0.0001。各相提取物中抗氧化成分将 Fe3 +
－TPTZ还原成 Fe2 +－ TPTZ 复合物，吸光度明显随提
取物浓度的增加而增加。由表 1 可以得知，乙酸乙
80
酯部位和水部位提取物的 FＲAP值均较大，铁还原能
力强，石油醚部位提取物的 FＲAP 值相对较低，铁还
原能力弱。研究发现中药材山楂和山茱萸提取物的
FＲAP值分别为为 332.00 ± 3.23、311.10 ± 17.77［14］，效
果均要弱于火棘果不同极性部位提取物。说明火棘
果有较好的铁离子还原能力。
2.5 总多酚含量测定结果
植物多酚是植物体内最普遍存在的次生代谢物
质，是植物次生代谢物质唯一的分子水平上的防御
物质，植物多酚的研究对于揭示植物的化学防御和
微生物、植食动物的协同进化机制具有重要意义［15］。
没食子酸标准曲线方程:Y = 0.0182 + 2.9582X，Ｒ2 =
0.9995，p ＜ 0.0001。火棘果提取物的总酚含量见表
1。从表 1 中正丁醇部位、乙酸乙酯部位、水部位萃
取物总酚含量均较多，石油醚部位含量最少。其中
正丁醇部位总酚含量最大((2763 ± 3.91)mgGAE /
100g 干样品)，是总酚含量最小的石油醚部位
( (1987 ± 3.28)mgGAE /100g 干样品)的 1.4 倍。研
究结果表明，火棘果中总酚类物质的极性较大，大部
分富集于正丁醇部位和乙酸乙酯部位。
2.6 抗氧化活性方法间相关性分析
运用 SPSS软件进行分析，进行了四种抗氧化检
测方法的相关性分析，结果见表 2，DPPH·清除法、
FＲAP 法和总还原力的相关性好，相关系数均在
0.855 以上，其中，FＲAP法与 DPPH·清除法和总还原
力法的相关性最好，分别为 0.935、0.941。总体看来，
火棘果提取物对 DPPH·、ABTS +·、PＲAP和总还原力
体系抗氧化活性基本一致，但又略有差异。出现差
异的原因可能是由于粗提物的活性成分比较复杂，
且不同抗氧化检测方法的机理不同［11－13］所致。
表 2 四种检测方法相关性分析
Table 2 Correlation analysis of four methods and TPC
项目 DPPH· ABTS +· FＲAP 总还原力
DPPH· － 0.577* 0.935＊＊ 0.855＊＊
ABTS +· 0.577* － 0.604* 0.830＊＊
FＲAP 0.935＊＊ 0.604* － 0.941＊＊
总还原力 0.855＊＊ 0.830＊＊ 0.941＊＊ －
注:* 表示在 0.05 水平上显著相关，＊＊表示在 0.01 水平上显
著相关。表 3 同。
2.7 总多酚含量与抗氧化活性相关性分析
根据表 3，DPPH·清除法、ABTS +·清除法、FＲAP
法和总还原力法测定的抗氧化活性与总多酚含量之
间均存在相关关系，其中，FＲAP 法、总还原力法测定
的抗氧化活性与总多酚含量的相关系数分别为
0.847 和 0.944(p ＜ 0.01)，而 DPPH 法、ABTS 法测定
结果与总多酚含量的相关性相对较弱(p ＜ 0.05)，相
关系数均小于 0.75。综上所述，总多酚含量与四种
抗氧化检测模型存在较好的相关关系，说明各部位
提取物中的抗氧化活性物质主要是多酚类物质。多
酚类物质含有的酚羟基具有提供质子氢的能力，能
够淬灭和还原自由基，终止自由基链式反应，从而起
到抗氧化的作用。研究发现蓝莓叶提取物总酚含量
与抗氧化活性相关性及显著［16］，火棘果提取物的研
究结果与之相似。
表 3 火棘果抗氧化活性与总多酚含量的相关关系
Table 3 Correlation analysis of the antioxidant activity and TPC
项目 DPPH· ABTS +· FＲAP 总还原力
总多酚含量 0.677* 0.741* 0.874＊＊ 0.944＊＊
3 结论
由于不同抗氧化检测方法的反应机理不同，为获
得可靠的结论，本实验运用 DPPH·清除法、ABTS +·清
除法、FＲAP法和总还原力法对火棘果不同极性溶剂
提取物的抗氧化能力进行了系统的评价。火棘果四
种不同极性部位提取物表现出对 DPPH·、ABTS +·、
FＲAP和总还原力良好的抗氧化活性，且相关性基本
一致，但略有差异。火棘果水部位对 DPPH·、ABTS +·
的清除活性最强，IC50 值分别为 0.76mg /mL 和
1.71mg /mL;乙酸乙酯部位 FＲAP 值最高，但与水部
位相差不大。
大量的实验研究表明，酚类化合物是天然植物
提取物中具有抗氧化活性的主要物质基础［7－8］。本
实验对总多酚与抗氧化活性的相关性分析结果表
明，火棘果不同极性部位提取物的抗氧化能力与总
多酚含量存在较好的相关关系(p ＜ 0.05)，也提示火
棘果中除多酚类化合物外，还存在其他具有抗氧化
活性的物质。
本研究综合评价了火棘果总提物不同极性部
位的体外抗氧化活性，同时探究了抗氧化能力与总
多酚含量之间的关系，可望为火棘果的进一步开发
和利用提供科学的实验数据和理论依据，为深入挖
掘火棘果在食品、医学等领域的应用提供参考
价值。
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