全 文 ：书·研究论文·
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(编号:LQ15H290001) ;浙江中医药大学科研基金资助(编号:2014ZY08)
通讯作者:骆海莺 Tel:(0571)87348152 E-mail:lyc1200@ 163． com
垂盆草总黄酮对肝纤维化大鼠肝组织 TGF-β 1 和 Smad7 表达
的影响
林远灿1 骆海莺2 陈红淑1 (1．浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006;2．南京军区杭州疗养院)
摘 要 目的:观察垂盆草总黄酮(SSTF)对 CCL4诱导肝纤维化大鼠肝组织 TGF-β 1 和 Smad7 蛋白及 mRNA表达的影响。方
法:60 只雄性 SD大鼠随机分为正常组、模型组、SSTF 低剂量组(100 mg·kg －1)、SSTF 中剂量组(200 mg·kg －1)、SSTF 高剂
量组(400 mg·kg －1)和秋水仙碱阳性药对照组，共 6 组，每组 10 只。CCl4皮下注射诱导大鼠肝纤维化模型，同时 SSTF灌胃干
预，7 周后处死大鼠。采用 Masson染色法检测大鼠肝脏组织病理学改变，Western blotting 法检测肝脏组织 TGF-β 1 和 Smad7
蛋白表达，实时定量 RT-PCR检测肝脏组织 TGF-β 1 和 Smad7mRNA 表达。结果:与模型组比较，SSTF 各剂量均能显著降低
CCL4诱导的肝纤维化程度(P ＜ 0． 05) ;中高剂量可以显著减少肝组织中 TGF-β 1 蛋白和 mRNA 表达(P ＜ 0． 05) ，并且明显增
加 Smad7 蛋白和 mRNA表达(P ＜ 0． 05)。结论:SSTF可有效地逆转实验性大鼠肝纤维化，其机制可能与下调肝组织中 TGF-β
1 蛋白和 mRNA表达，及增加 Smad7 蛋白和 mRNA表达有关。
关键词 垂盆草总黄酮;肝纤维化;转化生长因子 β 1;Smad7 蛋白
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-049X(2015)12-2021-04
Effects of Sedum Sarmentosum Total Flavonoids on the Expression of TGF-β1 and Smad 7 in Rats with He-
patic Fibrosis
Lin Yuancan1，Luo Haiying2，Chen Hongshu1(1． The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou
310006，China;2． Hangzhou Sanatorium of Nanjing Military Region)
ABSTRACT Objective:To investigate the inhibitory effects of Sedum Sarmentosum total flavonoids (SSTF)on hepatic fibrosis in-
duced by CCl4，and examine the effects on the expression of TGF-β 1 and Smad7． Methods:Sixty male SD rats were randomly divided
into the normal control group，the model group，100，200 and 400 mg·kg －1 SSTF groups and colchicine positive control group． The
experimental model of hepatic fibrosis in rats was established by the injection of CCL4 ． The liver histopathology was examined by Mas-
son stain，and the protein expression and mRNA of TGF-β 1 and Smad7 were assessed by RT-PCR and Western blotting． Results:
Compared with the model group，every SSTF group could significantly reduce the degree of liver fibrosis induced by CCL4(P ＜ 0． 05)．
The middle and high dose SSTF gouprs could significantly reduce the protein expression and mRNA of TGF-β 1 (P ＜ 0． 05) ，and sig-
nificantly increase the protein expression and mRNA of Smad 7 (P ＜ 0． 05)． Conclusion:SSTF exhibits anti-hepatic fibrosis effects in
rats through down-regulating the expression of TGF-β 1 and up-regulating the expression of Smad7 in fibrotic liver tissue．
KEY WORDS Sedum Sarmentosum total flavonoids;Hepatic fibrosis;TGF-β1;Smad 7
肝纤维化是肝脏对各种损伤自我修复的反应，
是各种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程，其
组织病变表现为肝细胞外基质(extracellular matrix，
ECM)大量沉积。转化生长因子 β1(transforming
growth factor beta l，TGF-β1)是 TGF-β 亚型的一种，
是目前公认的最强的致肝纤维化的细胞因子之
一［1］。Smad7 是 TGF-β /Smad信号通路中重要组成
部分，其过度表达可以阻断 HSC 的激活和肝纤维化
的进展，使肝纤维化逆转成为可能。垂盆草总黄酮
(sedum sarmentosum total flavanones，SSTF)是从景天
科植物垂盆草全草中提取的黄酮类化合物，主要含
有槲皮素、山柰素、木犀草素、金丝桃苷。近年来研
究发现 SSTF具有保肝降酶、抗肿瘤、修复损伤肝细
胞、抑制肝星状细胞(HSC)活化等药理活性［2 ～ 5］。
为进一步探讨其对肝纤维化的作用，本实验应用
SSTF作用于大鼠肝纤维化模型，进行肝组织病理学
检查，并检测肝组织中 TGF-β1 和 Smad7 蛋白和
mRNA的表达，来研究 SSTF是否具有抗肝纤维化作
用及其可能的调控机制。
1 材料与方法
1． 1 动物
SD雄性大鼠，SPF级，体质量 250 ～ 270 g，生产
许可证号:SCXK(沪)2013 -0016，由上海西普尔-必
凯实验动物有限公司提供，浙江中医药大学实验动
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中国药师 2015 年第 18 卷第 12 期 China Pharmacist 2015，Vol． 18 No． 12
物中心饲养。
1． 2 药品和试剂
垂盆草总黄酮(纯度为68． 7%，由浙江中医药
大学药学院提取:先 80%乙醇提取，再经大孔树脂
与聚酰胺进行纯化所得;其中槲皮素含量不低于
6． 8%，山柰素含量不低于2． 3%，异鼠李素含量不低
于3． 5%) ;四氯化碳(CCl4，南京青松化工有限公
司，批号:20110217) ;秋水仙碱(国药集团化学试剂
有限公司，批号:Lot No． 20140226)。
1． 3 肝纤维化模型的建立［6］
用灭菌的精制橄榄油配成的 40% CCl4橄榄油
溶液。除正常组外，于大鼠背部皮下注射 40% CCl4
橄榄油溶液，首次剂量 5 ml·kg －1，以后按 3 m1·
kg －1，每周注射 2 次，连续注药 7 周，正常组以等容
量的橄榄油皮下注射。
1． 4 分组及处理
大鼠随机分成正常组、模型组、SSTF 低剂量组
(100 mg·kg －1)、SSTF 中剂量组(200 mg·kg －1)、
SSTF高剂量组(400 mg·kg －1)和秋水仙碱阳性药
对照组(0． l mg·kg －1) ，共 6 组，每组 10 只。从造
模第 3 周开始，各给药组分别灌胃给予相应的药物
1 ml /100 g，正常组、模型组给予生理盐水 1 ml /100
g，qd，连续 5 周。末次给药当晚禁食不禁水 18 h，次
日空腹处死，取右叶部分肝组织以 4%多聚甲醛固
定，常规石蜡包埋待用。
1． 5 观察指标
1． 5． 1 大鼠一般状况观察 实验期间观察大鼠精
神状态、体质量、饮食和饮水量、毛色、活动灵敏度等
状况。
1． 5． 2 肝组织病理检测 实验结束，观察肝脏与周
围组织的粘连情况，肝脏质地、色泽等，取石蜡包埋
后肝组织 Masson 染色，备制肝脏组织病理，通过光
学显微镜观察病理形态学变化。
按病理切片中组织增生程度，用半定量分级法
分为:“－”:无明显胶原纤维增生;“+”:胶原纤维
明显增多，从汇管区或中央静脉呈星状向外延伸，无
纤维隔形成;“+ +”:胶原纤维明显增多并形成彼
此不连接的纤维隔;“+ + +”:胶原纤维连接成完
全的纤维隔，分割肝实质［7］。
1． 5． 3 Western blotting 检测肝组织中 TGF-β1 和
Smad7 蛋白的表达 取 100 mg 肝组织置于含 1 ml
RIPA 裂解液的 EP 管，冰上充分匀浆。12 000 r·
min －1离心 10 min，取上清。加上样缓冲液，100℃加
热 10 min 使蛋白变性。每孔加入 8 μl总蛋白，进行
SDS-PAGE 电泳，经硝酸纤维素膜转移。含 5%脱
脂奶粉的 TBS-T 封闭，之后特异性一抗 TGF-β1 和
Smad7 抗体(1∶ 800)4 ℃ 过夜孵育，洗涤，再加入
相匹配的二抗;反应信号经化学发光试剂发光，曝光
洗片，并以计算机图像扫描，用 quantity one 软件进
行图像分析，测定灰度值，用 β － action 作为内参，以
目的蛋白 /β － action 计算目的蛋白的相对表达量。
1． 5． 4 实时定量 RT-PCR检测肝组织中 TGF-β1 和
Smad7 mRNA 的表达 用 RNA isoPlus 提取肝脏组
织总 RNA，总 RNA用 PrimeScript RT reagent kit反
转录成 cDNA，使用 SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒
进行 PCR 扩增。TGF-β 1 引物序列:上游 5’-CT-
GCTGACCCCCACTGATA-3’，下游 5’- CTGTATTC-
CGTCTCCTTGGTCC-3’) ，扩 增 片 段 为 525bp。
Smad7 引 物 序 列:上 游 5 ’-GATACCCGATG-
GATTTTCTCAA-3’，下游 5’-AGGGCTCTTGGACA-
CAGTAGAG-3’，扩增片段长度 605 bp。GAPHD(内
参) ，上游 5’- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’;
下游 5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’) ，扩增
片段长度 655bp。所有反应信息资料由 Bio-Rad iQ5
PCR仪收集，Ct 值通过计算机软件来测量和计算，
转录水平通过公式 2-△△CT计算［8］。
1． 6 统计学处理
采用 SPSS13． 0 统计软件进行数据分析，计量数
据以 珋x ± s表示，采用单因素方差分析处理，组间两
两比较用 LSD检验，等级资料采用 Ridit 分析处理。
P ＜ 0． 05为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 对大鼠一般状况的影响
正常组大鼠精神状态良好，皮毛光滑，食欲良
好，饮水正常，每周体质量增长正常，大便成形，小便
正常，实验结束无死亡;模型组对照组随着造模时间
的推移，体质量基本不增或缓慢下降，精神萎靡，活
动减少，皮毛失去光泽、紊乱并易脱落，食欲下降，饮
水减少，大便不成形，小便偏黄，实验结束时死亡 2
只;SSTF 组一般情况稍优于模型组，体质量增加减
慢，大鼠皮毛光洁，与正常组大鼠外表相似，实验结
束时高剂量组死亡 1 只，中、低剂量组各死亡 2 只;
秋水仙碱阳性组表现与药物干预组相似，实验结束
时死亡 1 只。
2． 2 肝组织学观察
主要观察 SSTF 对大鼠肝组织形态学的影响。
Masson胶原染色结果显示:模型组纤维化程度较正
常对照组显著增加(P ＜ 0． 01)。与模型组比较，
SSTF各剂量组及秋水仙碱胶组原纤维增生减少，纤
维化程度减轻(P ＜ 0． 05)。Masson 染色见图 1，肝
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纤维化分级见表 1。
A正常组;B模型组;C SSTF高剂量组;D SSTF中剂量组;
E SSTF低剂量组;F阳性组
图 1 肝组织切片 Masson染色(×100)
表 1 垂盆草总黄酮对肝纤维化大鼠肝组织
增生的影响 (n =8)
组别 剂量(mg·kg －1) — + + + + + +
正常对照组 － 8 0 0 0
模型对照组a － 0 1 2 5
秋水仙碱组b 0． l 1 3 4 0
SSTF 100b 0 3 4 1
200b 0 4 3 1
400b 1 4 3 0
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 01;与模型组比较，bP ＜ 0． 05。
2． 3 对肝纤维化大鼠肝组织 TGF-β1 和 Smad7 蛋
白表达的影响
Western blotting结果显示:与正常组比较，模型
组大鼠肝组织 TGF-β1 蛋白表达显著升高(P ＜
0． 01) ，Smad7 蛋白表达明显减弱(P ＜ 0． 01)。与模
型组比较，SSTF 中、高剂量组和秋水仙碱组肝组织
TGF-β1 蛋白表达显著降低(P ＜ 0． 05) ，Smad7 蛋白
表达明显增强(P ＜ 0． 05) ，而 SSTF 低剂量组 TGF-
β1 和 Smad7 蛋白表达差异无显著性统计学意义(P
＞ 0． 05)。见图 2，定量分析结果见表 2。
2． 4 对肝纤维化大鼠肝组织 TGF-β1 和 Smad7 mR-
NA表达的影响
2-△△CT统计结果(见表 3，图 3)显示，与正常对
照组比较，模型组大鼠肝组织中 TGF-β1mRNA 表达
1．正常对照组 2．模型对照组 3． SSTF低剂量组
4． SSTF中剂量组 5． SSTF高剂量组 6．秋水仙碱组
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 01;与模型组比较，bP ＜ 0． 05。
图 2 SSTF对肝组织 TGF-β1 和 Smad7 蛋白表达的影响
明显增强，差异有统计学意义(P ＜ 0． 01) ，Smad7
mRNA 表达显著减弱(P ＜ 0． 01)。与模型组比较，
SSTF低剂量对肝组织中 TGF-β1 和 Smad7 mRNA
表达的影响不明显(P ＞ 0． 05) ;SSTF中、高剂量和
表 2 垂盆草总黄酮对大鼠纤维化肝脏组织 TGF-β1
和 Smad7 蛋白表达的影响 (`珋x ± s，n =8)
组别 剂量(mg·kg －1) TGF-β1 蛋白表达 Smad7 蛋白表达
正常对照组 - 1． 000 ± 0． 002 1． 000 ± 0． 000
模型对照组 - 5． 034 ± 0． 776a 0． 097 ± 0． 400a
秋水仙碱组 0． 1 1． 288 ± 0． 094b 0． 795 ± 0． 120b
SSTF 100 4． 400 ± 0． 545 0． 233 ± 0． 180
200 1． 613 ± 0． 127b 0． 713 ± 0． 069b
400 1． 214 ± 0． 084b 0． 847 ± 0． 234b
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 01;与模型组比较，bP ＜ 0． 05。
表 3 垂盆草总黄酮对大鼠纤维化肝组织 TGF-β1
和 Smad7mRNA表达的影响 (珋x ± s，n =8)
组别
剂量
(mg·kg －1)
TGF-β1mRNA
表达
Smad7mRNA
表达
正常对照组 － 1． 001 ± 0． 004 1． 000 ± 0． 001
模型对照组 － 1． 650 ± 0． 114a 0． 157 ± 0． 370a
秋水仙碱组 0． 1 1． 089 ± 0． 099b 0． 795 ± 0． 195b
SSTF 100 1． 327 ± 0． 120 0． 333 ± 0． 280
200 1． 081 ± 0． 100b 0． 651 ± 0． 170b
400 1． 036 ± 0． 018b 0． 807 ± 0． 214b
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 01;与模型组比较，bP ＜ 0． 05。
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中国药师 2015 年第 18 卷第 12 期 China Pharmacist 2015，Vol． 18 No． 12
1．正常对照组 2．模型对照组 3． SSTF低剂量组
4． SSTF中剂量组 5． SSTF高剂量组 6．秋水仙碱组
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 01;与模型组比较，bP ＜ 0． 05。
图 3 SSTF对肝组织 TGF-β1 和
Smad7 mRNA表达的影响
阳性组对肝组织中 TGF-β1mRNA 表达明显减弱(P
＜ 0． 05) ，Smad7 mRNA 表达则增强(P ＜ 0． 05)。
3 讨论
现代医学认为 ECM 累积所形成的肝纤维化通
过及时有效的治疗是可以逆转的，但目前缺乏疗效
确切、不良反应少的抗纤维化西药，大多还处在实验
研究阶段［9］。国内外学者研究发现，中药在抗肝纤
维化治疗中具有明显的优势，很多单味中药及复方
在细胞、动物及临床实验中都观察到一定的抗肝纤
维化疗效，如丹参、三七、鳖甲等［10］。从有临床基础
的传统保肝中药中发掘防治肝纤维化的药物有着很
大潜力。SSTF是从垂盆草中提取的主要有效成分，
本实验研究表明 SSTF具有抗 CCL4诱导的大鼠肝纤
维化作用。
TGF-β1 是一类调节细胞生长和分化的多肽，是
目前研究最深入的致肝纤维化的细胞因子，其表达
水平的上调促进了肝纤维化的发生和发展［11］。它
既可促进 ECM的合成，又可抑制其降解，在 HSC 激
活过程中亦起重要作用。当肝脏受到炎症、病毒、化
学毒素损伤时，肝内的炎症细胞、枯否细胞、星状细
胞等自分泌或旁分泌 TGF-β1。TGF-β1 可使静息状
态下的 HSC 被激活或转化为纤维母细胞，并能刺激
这些细胞向损伤部位迁移、增殖和产生胶原。同时
活化的 HSC 能自分泌 TGF-β1，是肝纤维化后期
TGF-β1 的主要来源，在自分泌和旁分泌双重作用
下，TGF-β1 表达的上调导致在 HSC与 TGF-β1 之间
形成恶性循环引起细胞外基质不断产生。目前认
为，Smad 信号蛋白为 TGF-β1 的下游信号传导分
子，没有 Smads复合物生成，TGF-β1 无法诱导 HSC
转化及合成分泌胶原和 ECM，因此 TGF-β1 /Smad信
号转导通路也被认为是其发挥生物学效应的主要通
路。Smad7 近年倍受关注，其作为 TGF-β1 信号传
导的抑制因子，能够抑制 TGF-β1 信号转导通路，介
导细胞内负反馈，从而阻断 TGF-β1 介导的肝纤维
化。
本研究观察了 SSTF对 CCL4诱导的肝纤维化大
鼠肝组织中 TGF-β1 和 Smad7 蛋白及 mRNA表达的
影响，结果显示 SSTF 中高剂量组较模型组 TGF-β1
蛋白及 mRNA 表达水平显著降低(P ＜ 0． 05) ，
Smad7 蛋白及 mRNA 表达明显水平增加(P ＜
0． 05) ，同时肝组织中纤维化程度也较模型组减轻，
特别是 SSTF高剂量组，其疗效优于秋水仙碱组。
综述所述，SSTF 具有抗肝纤维化作用，其机制
可能与抑制 TGF-β1 在肝组织中的表达，上调 Smad7
的表达，阻止 TGF-β1 活化 HSC，减少 ECM 的沉积，
进而减轻肝纤维化的程度有关。
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