全 文 ：［收稿日期］ 20111104(006)
［基金项目］ 北京中医药大学自主选题项目(JYBZZ-XS023)
［第一作者］ 戴玮，硕士，从事中药药效物质基础研究，Tel:
13699269586，E-mail:daiwei@ iccas． ac． cn
［通讯作者］ * 乔延江，博士，教授，博士生导师，从事中药质量
控制、中药新药研究与开发、中药信息学研究，
Tel:010-84738620，E-mail:yjqiao@ 263． net
基于化学发光法的禹州漏芦光毒性评价
戴玮1，2，刘勇1，2，刘永刚1，2，翟文文1，2，乔延江1，2*
(1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102;
2. 北京中医药大学中药基础与新药研究北京市重点实验室，北京 100102)
［摘要］ 目的:建立化学发光检测药物光毒性的方法，对禹州漏芦提取物进行光毒性评价。方法:将还原型辅酶Ⅰ二钠
盐与待测物混合后置于长波紫外线(UVA)光源下照射一定剂量后加入鲁米诺，计数发光值，以发光值反映光毒性强度。结
果:α-三联噻吩的发光值与照射剂量有关，在 1. 0 × 10 － 9 ～ 2. 5 × 10 － 2 g·L － 1存在量效关系，禹州漏芦提取物在高浓度时，所含
的有色物质会对荧光产生屏蔽效应，在使用本方法时应将提取物溶液进行适当稀释。结论:方法操作简单、灵敏度高，可以用
于药物光毒性的前期筛选。
［关键词］ 光毒性;化学发光法;α-三联噻吩;禹州漏芦
［中图分类号］ R285 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)06-0185-03
Phototoxicity Assessment of Radix Echinopsis based
on Chemiluminescence Method
DAI Wei1，2，LIU Yong1，2，LIU Yong-gang1，2，ZHAI Wen-wen1，2，QIAO Yan-jiang1，2*
(1. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China;
2. Beijing Municipal Key Laboratory for Basic Research of Chinese Medicine，
Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
［Abstract］ Objective: To establish a test model for phototoxic chemicals with the method of
chemiluminescence and assess the phototoxicity of different components of Radix Echinopsis． Method:Nicotinamide
adenine dinucleotide reduced (NADH)and photosensitive agents was irradiated with vitraviolet A (UVA) ，then
luminol was added to the test samples，and chemiluminescent value was counted and calculated by an ultra weak
chemiluminescence analyzer． Result:Chemiluminescent values of the α-terthienyl concerned with the increase of
UVA dosage，and there was a dose-effect relationship in the concentration range of 1. 0 × 10 － 9 -2. 5 × 10 － 2 g·L － 1 ．
Conclusion:This method is simple，accurate and sensitive． It can be used for pre-assessment of phototoxicity．
［Key words］ phototoxicity;chemiluminescence;α-terthienyl;Radix Echinopsis
光毒性是指药物吸收紫外光能量后在皮肤中释
放导致的皮肤损伤，即皮肤或全身接触或应用化学
物质后经紫外线照射所引起的一种皮肤毒性反应。
临床上报道多种药物都具有光毒性，其中也包括补
骨脂、白芷、蛇床子等常用中药［1-2］。禹州漏芦味
苦、性寒，归胃经，具有清热解毒、排脓止血、消痈下
乳的功效，一般用于诸疮痈肿、乳痈肿痛、乳汁不
通、瘰疬疮毒等症。禹州漏芦中含有大量噻吩类化
合物，其中 α-三联噻吩是主要的指标性成分。有研
究表明 α-三联噻吩结构中所含的不饱和共轭链具
有光敏活性，可导致光毒反应［3］，这使禹州漏芦的
使用存在用药安全隐患。本研究采用体外化学发光
法，以 α-三联噻吩建立光毒性评价方法，并对禹州
漏芦不同极性提取物的光毒性进行了量化评价，旨
在建立光毒性筛选方法，为安全合理的使用禹州漏
芦提供理论依据。
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第 18 卷第 6 期
2012 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 6
Mar．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.06.061
1 材料
禹州漏芦于 2011 年 5 月购自宁波，由北京中医
药大学刘春生教授鉴定为菊科蓝刺头属植物蓝刺头
Echinops latifolius Tausch． 或华东蓝刺头 E． grijisii
Hance． 的干燥根，标本保存于北京中医药大学。本
实验所用试剂除特别注明外均为分析纯，水为超纯
水。α-三联噻吩为实验室自制(纯度≥98%)。1 ×
10 － 2 mol·L － 1 鲁米诺储备液:取 17. 6 mg 鲁米诺
(Sigma)于 10 mL 量瓶中，0. 1 mol·L － 1NaOH 溶液定
容，摇匀，使用时用 0. 1 mol·L － 1 NaOH 溶液稀释至
所需浓度。1 × 10 － 2 mol·L － 1还原型辅酶Ⅰ二钠盐
(NADH)储备液:取35. 47 mg还原型辅酶Ⅰ二钠盐
(阿拉丁)于 5 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，使用时
用水稀释至所需浓度。
BPCL 微弱发光测量仪(中国科学院生物物理
研究所) ，UVA 光源(北京炳洋科技有限公司) ，岛津
高效液相色谱仪(包括四元泵、自动进样器、柱温
箱、DAD 检测器)。
2 方法与结果
2. 1 光毒性评价方法的建立
2. 1. 1 发光动力学曲线 光敏物质吸收光子能量，
使氧分子与 NADH 反应，产生氧化型辅酶Ⅰ和活性
氧，活性氧与鲁米诺反应，生成激发态的二价阴离子
氨基肽酸盐(APD) ，APD 经非辐射性跃迁回到基
态，释放出光子，由微弱发光测量仪经光子计数、数
据处理等过程，得到发光值［4］。发光值与光敏物质
的量成一定量效关系。测试步骤为:在反应池中加
入 α-三联噻吩 200 μL 和 NADH 200 μL，混合均匀后
UVA 光源照射 60 min，加入鲁米诺 100 μL，记录发光
值，得到发光动力学曲线。同时，固定其他条件，不以
UVA 光源照射，记录发光值，得到暗室对照发光曲
线。固定其他条件，以乙醇代替 α-三联噻吩溶液，记
录发光值，得到空白对照发光曲线。如图 1 所示。
图 1 α-三联噻吩-NADH-鲁米诺体系化学发光动力学曲线
2. 1. 2 照射时间考察 在固定其他条件的情况下，
分别在照射 5，10，20，40，60，80，120 min 后，测量发
光值，考察照射时间对发光值的影响，以发光动力学
曲线峰值为发光值。结果显示:发光值随照射时间
增加而增加，在 60 ～ 80 min 时最高，120 min 时明显
减弱，故选择照射 60 min。
2. 1. 3 鲁米诺浓度考察 固定其他条件，在 1 ×
10 － 4 ～ 1 × 10 － 2 mol·L － 1比较鲁米诺浓度对发光值信
号的影响，当 NADH 摩尔浓度为 5 × 10 － 3 mol·L － 1，α-
三联噻吩为 0. 01 g·L － 1，照射 60 min 时，随着鲁米诺
浓度增加，发光值信号随之增加。为了得到较高信号
响应，选择鲁米诺摩尔浓度为 1 × 10 － 2mol·L － 1。
2. 1. 4 NADH 浓度考察 在鲁米诺摩尔浓度为 1 ×
10 － 2mol·L － 1，α-三联噻吩 0. 01 g·L － 1，照射时间 60
min 时，比较 NADH 浓度对发光值信号的影响，在 1 ×
10 － 4 ～ 1 × 10 － 2 mol·L － 1时当 NADH 浓度增加，发光
值信号逐渐增加，在 5 × 10 － 3 mol·L － 1时信号最大，
故选择 NADH 摩尔浓度为 5 × 10 － 3mol·L － 1。
2. 1. 5 稳定性考察 在优化条件下，配制 5 份
NADH 和 α-三联噻吩混合液，照射 60 min 后同时取
出，每隔 2 min，取一份混合液加入鲁米诺溶液，测量
最大发光值。5 次测量结果 RSD 2. 07%，表明在离
开紫外光源照射后 10 min 内测量，其发光值稳定。
2. 1. 6 量效关系考察 在优化条件下，考察 α-三
联噻吩质量浓度在 1. 0 × 10 － 9 ～ 2. 5 × 10 － 2 g·L － 1发
光值与浓度间关系，在此范围内 α-三联噻吩与发光
值正相关。
2. 2 不同极性提取物中 α-三联噻吩的含量测定
2. 2. 1 色谱条件 Agilent Extend-C18色谱柱(4. 6
mm × 150 mm，5 μm) ，流动相甲醇-0. 1% 醋酸溶液
(85∶ 15) ，流速 0. 8 mL·min － 1，检测波长 352 nm，柱
温室温［5］。
2. 2. 2 含量测定 取禹州漏芦粉末(50 目)每份
10 g 共 6 份，分别用 90%，70%，50%，30%，10%乙
醇和水超声提取，过滤，蒸干溶剂，加甲醇配制成 1
g·L － 1溶液。采用 2. 2. 1 色谱条件，测定不同极性提
取物中 α-三联噻吩含量，其中 30% 乙醇提取物、
10%乙醇提取物、水提取物中均未检出 α-三联噻
吩，而其余样品测定结果显示，随着提取溶剂极性增
加，α-三联噻吩含量明显降低。90% 乙醇提取物、
70%乙醇提取物、50%乙醇提取物中 α-三联噻吩质
量分数分别为 1. 38%，0. 55%，0. 11%。
2. 3 禹州漏芦提取物的光毒性评价 将 2. 2. 2 中
90%乙醇提取物、70%乙醇提取物及 50%乙醇提取
物分别配制成 1 g·L － 1溶液，采用 2. 1 中建立的方
法，测量其发光值。结果显示，在样品浓度较高时，
发光值结果与空白相似，远远低于与之相应浓度的
α-三联噻吩纯品。推测样品浓度较高时，虽然 α-三
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第 18 卷第 6 期
2012 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 6
Mar．，2012
联噻吩含量较高，但是溶液中其他成分对光的吸收
和释放均会产生一定影响，限制了该方法的应用。
化学发光法作为痕量分析方法，样品检测限较低，为
了能够得到准确的发光值信号，降低背景对测量的
干扰，在实验中需要将样品稀释至较低浓度。
将 2. 2. 2 中 90%乙醇提取物、70%乙醇提取物
及 50%乙醇提取物分别配制成 α-三联噻吩质量浓
度为 1 × 10 － 5 g·L － 1溶液，采用 2. 1 中建立的方法，
测量此 3 种溶液及质量浓度为 1 × 10 － 5 g·L － 1 α-三
联噻吩溶液的发光值。结果显示，α-三联噻吩溶液
的发光值最高，随着提取溶剂极性增加，样品发光值
相应减弱。
3 讨论
《人用药品注册技术要求国际协调会议指南》
和《FDA 光安全性检测指南》草案中建议以药物的
光化学性质来判断是否对其进行光安全性实验，也
就是说以药物是否吸收紫外线或可见光作为判断是
否进行光安全性实验的标准。目前的评价光毒性的
体外实验包括以光毒性筛查为目的的 3T3 成纤维细
胞中性红摄取法［6-7］、人三维皮肤模型光毒性实验
及以光毒性机制研究为目的的红细胞溶血实验、组
氨酸光氧化实验等［8-9］。这些方法费用昂贵，操作
复杂且实验条件要求较高。体外化学发光法是将还
原型辅酶Ⅰ二钠盐与待测物混合置于 UVA 光源下，
照射一定剂量后加入化学发光剂鲁米诺，记录发光
值，以发光值反映光毒反应的强度。化学发光是将
化学反应产生的化学能转化为光能的反应过程，由
于发光强度与光照剂量、被测物结构、浓度间存在一
定内在联系，所以本方法可以反映药品的光化学性
质，而且本方法费用较低、操作简单，可以应用于判
断是否进行光安全实验的前期筛选。
我国的中草药有悠久的应用历史，在研究中发现
某些中药中所含的化学成分可以导致光毒反应，如:
补骨脂中的补骨脂素、贯叶连翘中的金丝桃素、白芷
中的欧前胡内酯等。噻吩类成分是禹州漏芦中主要
的脂溶性成分，此类成分大多含有 1 ～ 3 个噻吩环，环
与环间通过 α-碳原子相连，且带有含炔基的侧链，是
植物中的天然光敏剂［10］。特别是具有较强光敏作用
的 α-三联噻吩，已被证明存在于多种菊科植物中，其
中也包括一些药用植物，这使此类植物在应用时存在
导致光毒性的风险，应引起重视，合理使用。
3. 3 提取物中成分复杂，虽然在浓度较高时所含的
光敏物质浓度较高，但是受其他成分的影响，发光图
与空白近似。当提取物浓度稀释至一定比例后，其
他成分含量降低，而化学发光法作为痕量分析方法，
在光敏物浓度较低时，仍有较强发光信号。在使用
化学发光法评价混合物光毒性时，应采用稀溶液，避
免出现假阴性结果。
将禹州漏芦不同极性提取物配制成含有 1 ×
10 － 5 g·L － 1 α-三联噻吩的溶液后，测量其发光值，结
果显示提取物发光值均低于 α-三联噻吩纯品且随
着提取溶剂极性降低，发光值明显升高。推测是由
于提取物中其他成分对荧光产生了屏蔽效应，同时
禹州漏芦中含有的其他噻吩类成分也具有一定光敏
作用，随着提取溶剂的变化，组成与含量相应改变，
导致发光值出现差异。
本方法从光毒反应机制出发评价药物是否存在
产生光毒的可能性，而药物在应用过程中影响因素
较多，因此仅用于药物光毒性的前期筛选，对于药物
在实际应用中是否会导致光毒反应则需要结合动物
实验来进一步验证。
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［责任编辑 邹晓翠］
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戴玮，等:基于化学发光法的禹州漏芦光毒性评价