全 文 ：第 34 卷 第 5 期
2013 年 5 月
发 光 学 报
CHINESE JOURNAL OF LUMINESCENCE
Vol. 34 No. 5
May，2013
文章编号:1000-7032(2013)05-0650-06
微孔板结合化学发光法快速测定覆盆子中
总糖蛋白的抗氧化活性
雷利芳1，游 静2，曾华金2，杨 冉1* ，屈凌波1，3*
(1． 郑州大学 化学与分子工程学院，河南 郑州 450001;
2． 郑州大学 药学院，河南 郑州 450001; 3． 河南工业大学 化学化工学院，河南 郑州 450001)
摘要:在碱性条件下，覆盆子总糖蛋白对鲁米诺-过氢化氢、鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠和鲁米诺-硫酸铜-过
氧化氢化学发光体系具有明显的抑制作用。基于这一特点，本文将微孔板与化学发光法结合，在优化条件
下，建立了覆盆子总糖蛋白清除 H2O2、O
2 －和·OH自由基能力的快速检测方法，结果表明该方法具有样品用
量少、操作简单、检测速度快等优点，适用于药物中有效成分的活性检测及筛选。
关 键 词:微孔板;化学发光法;覆盆子;糖蛋白;抗氧化
中图分类号:R917 文献标识码:A DOI:10． 3788 / fgxb20133405． 0650
Rapid Determination of Antioxidant Activities of
Glycoprotein of Rubus chingii Hu． by Chemiluminescence Method
Coupled with Microwell Plate
LEI Li-fang1，YOU Jing2，ZENG Hua-jin2，YANG Ran1* ，QU Ling-bo1，3*
(1． School of Chemistry and Molecular Engineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China;
2． School of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China;
3． School of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)
* Corresponding Author，E-mail:yangran@ zzu． edu． cn，qulingbo@ zzu． edu． cn
Abstract:Based on the phenomenon that glycoprotein can obviously inhibit the chemical lumines-
cence (CL)signal of luminol-H2O2 system，luminol-pyrogallol-sodium hydroxide system and lumi-
nol-H2O2-copper sulfate system in basic medium，a simple and rapid chemiluminescence method int
egrated with microwell plate was developed for evaluating of the scavenge effects of glycoprotein of
Rubus chingii Hu． on hydrogen peroxide (H2O2) ，superoxide anion (O
2 －)and hydroxyl radical
(·OH)． The experiment data indicated the proposed method described in this paper has proved to
be fairly simple，reproducible and rapid and would be a valuable tool for fast screening of antioxidant
activity of herbal．
Key words:microwell plate;chemiluminescence method;Rubus chingii Hu．;glycoprotein;antioxidant activity
收稿日期:2013-01-05;修订日期:2013-03-22
作者简介:雷利芳(1988 －) ，女，河南汝州人，主要从事药物分析方面的研究。
E-mail:xiaolei2006@ 163． com，Tel: (0371)67756886
第 5 期 雷利芳，等:微孔板结合化学发光法快速测定覆盆子中总糖蛋白的抗氧化活性 651
1 引 言
糖蛋白(glycoprotein)是生物细胞的重要组成
部分，是一类由比较短且通常具有分支的寡糖与
多肽链某些特殊部位的羟基或酰氨基共价连接而
成的结合蛋白质。随着国内外科学工作者对糖蛋
白性质、结构、功能认识的不断深入，发现植物糖
蛋白除了具有凝集素、结构蛋白、酶、贮藏蛋白和
毒素等方面的作用外，还具有多种保健功能，如抗
糖尿病［1］、降血脂［2］、抗氧化［3-4］、免疫调节［5］、抗
肿瘤［6］等。因此，植物糖蛋白在新型特种药物及
功能性保健品开发方面具有广阔的应用前景，是
继多糖之后天然活性成分研究的又一热点。
覆盆子是蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子
(Rubus chingii Hu．)的近成熟干燥果实，始载于
《名医别录》，具有“益肾、固精、缩尿”之功效。通
过家蝇寿命实验，对 100 个抗衰延寿古方进行筛
选研究表明，覆盆子为作用最为显著的 7 味中药
之一，因而覆盆子具有较强的延缓衰老的作
用［7］。现代药理学研究表明，覆盆子中所含的糖
蛋白具有明显清除 O2 －、·OH 和 H2O2 等自由基
的成分，可能是覆盆子延缓衰老的物质基础之
一［8］。然而，这些测定清除自由基的方法往往采
用传统的比色法，方法样品用量大，操作繁杂费
时，不利于样品的快速检测及高通量筛选。因此，
建立一种微量、简单可靠的测定覆盆子糖蛋白抗
氧化的方法，对于研究覆盆子延缓衰老的物质基
础及其作用机理具有非常重要的意义。
本文将微孔板与化学发光法结合，利用鲁米
诺-过氢化氢(luminol-H2O2)、鲁米诺-邻苯三酚-
氢氧化钠(luminol-pyrogallol-NaOH)和鲁米诺-硫
酸铜-过氧化氢(luminol-CuSO4-H2O2)化学发光体
系，对不同地方市售覆盆子中的总糖蛋白进行抗
氧化活性研究，为覆盆子抗衰老机理提供了实验
基础。
2 实 验
2． 1 主要仪器与试剂
实验中使用的仪器主要有 Centro XS3 LB 960
化学发光分析仪(Berthold technologies，Germany)，
可拆卸 96 孔聚苯乙烯板(Corning，UAS) ，PHS-3C
精密 pH 计(上海精科雷磁仪器厂) ，AL-104 电子
天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)等。覆
盆子购于全国各药材店(1-浙江Ⅰ，2-浙江Ⅱ，3-
广西Ⅰ，4-广西Ⅱ，5-福建Ⅰ，6-福建Ⅱ，7-江苏，8-
广东，9-吉林，10-辽宁，11-河南，12-四川)。
鲁米诺储备液(10 mmol·L －1)的配制:准确
称取 0． 177 2 g 鲁米诺(Sigma，USA)，用 0． 1 mol·
L －1的 NaOH溶液溶解并定容至 100 mL棕色容量
瓶中，避光保存，放置 3 d 后使用，使用时用水稀
释至所需浓度。
邻苯三酚储备液(0． 01 mol·L －1) :准确称取
0． 012 6 g邻苯三酚，超纯水定容至 10 mL，使用时
用水稀释至所需浓度。其它所用试剂均为分析
纯，水为超纯水。
2． 2 覆盆子总糖蛋白的提取［9］
称取覆盆子粉末 7． 0 g，加入 100 mL蒸馏水，
常温下于超声波提取 50 min，然后在 4 000 r /min
的转速下离心 10 min，取上清液，沉淀物再提取 1
次。合并两次的上清液，按 5 ∶ 1的体积比加入
Sevag试剂 V(氯仿)∶ V(正丁醇)= 5∶ 1) ，剧烈振
荡 20 min 后，在 4 000 r /min 的转速下离心 10
min，去除游离的杂蛋白，重复 3 次;然后加入 4 倍
体积的无水乙醇，于 4 ℃下过夜，次日在 4 000 r /
min的转速下离心 20 min 取沉淀;将沉淀用少量
水溶解后装入透析袋中，于 4 ℃下用蒸馏水透析
3 d，然后冷冻干燥备用。
2． 3 实验方法
化学发光分析流程图如图 1 所示。将 100 μL
样品溶液加入微孔板中，然后由通道 a 通入氧化
剂(过氧化氢溶液、邻苯三酚溶液等) ，迅速振荡
混均后再由通道 b 通入鲁米诺溶液，迅速振荡混
均后记录反应 10 s内的发光信号。将其中未加
入样品的体系所产生的化学发光强度定义为本
体发光值 I0，而将样品加入到发光体系中所得到
的化学发光强度定义为 I，则降低的化学发光值
a
b
检测器 计算机
振荡
图 1 化学发光仪流程图。a:氧化剂溶液;b:鲁米诺
溶液。
Fig． 1 Schematic diagram of the chemiluminescence system．
a:oxidizing solution． b:luminol solution．
652 发 光 学 报 第 34 卷
ΔI = I0 － I，以 ΔI作为定量分析的依据。
3 结果与讨论
3． 1 覆盆子糖蛋白的提取
按 2． 2 节方法进行覆盆子中总糖蛋白的提
取，结果如表 1 所示。覆盆子中总糖蛋白的含量
基本上保持一个水平，但可能由于覆盆子各产地
表 1 覆盆子总糖蛋白提取结果
Table 1 The extraction results of total glycoprotein from Ru-
bus chingii Hu．
样品 取样量 /g 糖蛋白量 /g 提取率 /%
1 7． 0 0． 14 1． 96
2 7． 0 0． 19 2． 68
3 7． 0 0． 14 2． 00
4 7． 0 0． 08 1． 14
5 7． 0 0． 10 1． 43
6 7． 0 0． 11 1． 49
7 7． 0 0． 09 1． 29
8 7． 0 0． 15 2． 16
9 7． 0 0． 15 2． 16
10 7． 0 0． 13 1． 88
11 7． 0 0． 19 2． 69
12 7． 0 0． 13 1． 90
的气候条件、采收时间、贮藏条件及贮藏时间的不同
而略显差异。覆盆子总糖蛋白的平均提取量为
(0． 13 ±0． 03)g，平均提取率为 1． 90% ±0． 48%。
3． 2 化学发光动力学曲线
实验用 Centro XS3 LB 960 化学发光分析仪
系统研究了化学发光反应动力学性质。在碱性条
件下，糖蛋白对鲁米诺-过氢化氢、鲁米诺-邻苯三
酚-氢氧化钠和鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢化学发光
体系具有显著的抑制作用(图 2)。基于这一特
点，可以利用这些化学发光体系测定糖蛋白清除
H2O2、O
2 －和·OH 的能力。由图 2 可见，空白体
系的发光动力学曲线与样品体系的发光动力学曲
线基本一致，但发光强度却发生了明显的变化，表
明糖蛋白对这 3 个化学发光体系的发光强度有明
显的抑制作用。在鲁米诺-过氢化氢和鲁米诺-硫
酸铜-过氧化氢化学发光体系中，化学发光的差值
(ΔI)达到最大值分别在进样后的 8 s 和5 s;而在
鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠化学发光体系中，加
样后立即达到最大值。因此，分别选择加样后 8，
5，0 s的 ΔI值计算样品清除 H2O2、O
2 －和·OH能
力。若按每一样品记录测定时间为 10 s 计算，那
么每小时能测定的样品个数大约为 360，这为大
批样品的高通量筛选节约了大量的时间，也为抗
氧化测定提供了简便有效的方法。













 

 









 














 
700000
1
t / s
UR
L
800000
900000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1
t / s
UR
L 1500000
3000000
0
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
700000
1
t / s
UR
L
800000
900000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500000
2000000
2500000
a
b
c
（a） （b） （c）
a
b
c
a
b
c
图 2 化学发光动力学曲线。(a)鲁米诺-过氢化氢体系。a:40 μmol·L －1鲁米诺溶液加入 0． 48%过氧化氢溶液;b:a
加入 4． 4 μg·L －1糖蛋白溶液;c:a加入 9． 8 μg·L －1糖蛋白溶液。(b)鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠体系。a:0． 1
mmol·L －1鲁米诺溶液加入 0． 25 mmol·L －1邻苯三酚溶液加入 6． 0 mmol·L －1氢氧化钠溶液;，b:a加入 0． 04 μg·
L －1糖蛋白溶液;c:a加入 0． 22 μg·L －1糖蛋白溶液。(c)鲁米诺-硫酸铜-过氧化氢体系。a:5． 0 mmol·L －1鲁米
诺溶液加入 0． 07 μmol·L －1硫酸铜溶液加入 0． 24%过氧化氢溶液;b:a加入 4． 4 μg·L －1糖蛋白溶液;c:a加入
14． 8 μg·L －1糖蛋白溶液。
Fig． 2 Chemiluminscence signal． (a)luminol-H2O2 system． a:40 μmol·L
－1 luminol + 0． 48% H2O2 ． b:a + 4． 4 μg·L
－1
glycoprotein． c:a + 9． 8 μg·L －1 glycoprotein． (b)luminol-pyrogallol-NaOH system． a:0． 1 μmol L －1 luminol + 2． 5 ×
10 －4 mol·L －1pyrogallol + 6． 0 × 10 －3 mol·L －1 NaOH． b:a + 0． 04 μg·L －1 glycoprotein． c:a + 0． 22 μg·L －1 gly-
coprotein． (c)luminol-CuSO4-H2O2 system． a:5． 0 μmol·L
－1 luminol + 0． 07 μmol·L －1 CuSO4 + 0． 24% H2O2 ． b:
a + 4． 4 μg·L －1 glycoprotein． c:a + 14． 8 μg·L －1 glycoprotein．
第 5 期 雷利芳，等:微孔板结合化学发光法快速测定覆盆子中总糖蛋白的抗氧化活性 653
3． 2 实验条件的优化
为了获得最佳的检测灵敏度和最适合的声噪
比，对各个发光体系中的溶液浓度进行了考察，结
果如表 1 所示。从表中可以看出在鲁米诺-过氧
化氢体系中，当鲁米诺浓度为 40 μmol·L －1，过
氧化氢浓度为 0． 48%，且 pH值为 9． 2 时，样品清
除 H2O2 的能力最强;在鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化
钠体系中，当鲁米诺浓度为 0． 1 mmol·L －1，邻苯
三酚浓度为 0． 25 mmol·L －1和 NaOH浓度为 6． 0
mmol·L －1时，样品清除 O2 －的能力最强;而在鲁
米诺-硫酸铜-过氧化氢体系中，当鲁米诺浓度为
5． 0 μmol·L －1，CuSO4浓度为 0． 07 μmol·L
－1和
H2O2 浓度为 0． 24%时，样品清除·OH 的能力
最强。
表 2 测定糖蛋白的最佳条件
Table 2 The optimum conditions for determination of glycoprotein
化学发光体系 参数 考察范围 最适条件
luminol-H2O2 鲁米诺浓度 5 ～ 640 μmol·L －1 40 μmol·L －1
H2O2 浓度 0． 3% ～ 0． 72% 0． 48%
pH值 8． 6 ～ 10． 0 9． 2
luminol-pyrogallol-NaOH 鲁米诺浓度 0． 02 ～ 0． 6 mmol·L －1 0． 1 mmol·L －1
邻苯三酚浓度 0． 062 ～ 4 mmol·L －1 0． 25 mmol·L －1
NaOH浓度 0． 5 ～ 100 mmol·L －1 6． 0 mmol·L －1
luminol-CuSO4-H2O2 鲁米诺浓度 0． 5 ～ 10 mmol·L －1 5． 0 μmol·L －1
CuSO4 浓度 0． 02 ～ 0． 09 μmol·L －1 0． 07 μmol·L －1
H2O2 浓度 0． 09% ～ 0． 30% 0． 24%
3． 3 线性范围、精密度及检出限
在上述优化条件下，利用各化学发光体系对
不同市售覆盆子中糖蛋白进行了测定，结果见表
2。在上述 3 种化学发光体系中，发光强度 ΔI 均
与一定浓度范围内的糖蛋白呈线性关系。对浓度
为 50 μg·L －1的糖蛋白溶液分别用鲁米诺-过氢
化氢、鲁米诺-邻苯三酚-氢氧化钠和鲁米诺-硫酸
铜-过氧化氢体系平行测定 6 次，得到 3 种化学发
光体系的板内及板间标准偏差分别为2． 08%、
1． 77%、2． 13%和 5． 78%、3． 23%、3． 64%。
表 3 覆盆子糖蛋白的回归方程、线性范围、检出限及 IC50值
Table 3 Linear regression equations，linear ranges，detection limit and IC50 of glycoprotein of Rubus chingii Hu．
化学发光体系 样品 回归方程 R2
线性范围
(μg·L －1)
最低检测限
(μg·L －1)
IC50
(μg·L －1)
luminol-H2O2 1 ΔI = 56． 204lgC － 15． 034 0． 986 9 39． 0 ～ 666． 7 13． 0 143． 5
2 ΔI = 48． 6lgC － 7． 1738 0． 985 6 17． 3 ～ 666． 7 5． 8 150． 0
3 ΔI = 56． 659lgC － 20． 966 0． 993 1 39． 0 ～ 1 000． 0 13． 0 178． 9
4 ΔI = 59． 367lgC － 61． 421 0． 991 9 197． 5 ～ 4 444． 4 65． 8 753． 0
5 ΔI = 53． 686lgC － 17． 037 0． 984 8 26． 0 ～ 1 000． 0 8． 7 177． 3
6 ΔI = 50． 233lgC － 3． 4944 0． 994 4 17． 3 ～ 1 000． 0 5． 8 116． 1
7 ΔI = 35． 723lgC + 14． 507 0． 989 9 15． 3 ～ 1 953． 1 5． 1 98． 5
8 ΔI = 61． 837lgC － 25． 392 0． 987 3 39． 0 ～ 1 000． 0 13． 0 136． 1
9 ΔI = 66． 5lgC － 26． 727 0． 992 1 81． 4 ～ 488． 3 27． 1 142． 5
10 ΔI = 86． 195lgC － 78 0． 993 8 87． 8 ～ 1 000． 0 29． 3 305． 5
11 ΔI = 59． 76lgC － 25． 604 0． 995 4 58． 5 ～ 1 000． 0 19． 5 184． 1
12 ΔI = 75． 331lgC － 32． 484 0． 994 3 58． 5 ～ 444． 4 19． 5 124． 5
654 发 光 学 报 第 34 卷
续表 3
化学发光体系 样品 回归方程 R2
线性范围
(μg·L －1)
最低检测限
(μg·L －1)
IC50
(μg·L －1)
luminol-pyrogallol-NaOH 1 ΔI = 74． 696lgC － 34． 439 0． 986 9 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 1． 3
2 ΔI = 70． 038lgC － 23． 434 0． 996 6 43． 9 ～ 333． 3 14． 6 1． 1
3 ΔI = 82． 673lgC － 20． 993 0． 994 6 21． 9 ～ 250． 0 7． 3 0． 7
4 ΔI = 57． 268lgC － 7． 9396 0． 992 0 43． 9 ～ 500． 0 1． 46 1． 0
5 ΔI = 95． 168lgC － 24． 567 0． 987 0 21． 9 ～ 250． 0 7． 3 0． 6
6 ΔI = 56． 17lgC － 4． 1193 0． 989 2 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 0． 9
7 ΔI = 86． 67lgC － 37． 445 0． 996 1 29． 3 ～ 333． 3 9． 8 1． 0
8 ΔI = 51． 33lgC － 21． 76 0． 998 1 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 2． 5
9 ΔI = 69． 949lgC － 39． 167 0． 993 8 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 1． 9
10 ΔI = 91． 68lgC － 72． 513 0． 980 2 65． 8 ～ 500． 0 21． 9 2． 2
11 ΔI = 51． 967lgC － 18． 249 0． 998 4 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 2． 1
12 ΔI = 56． 471lgC － 25． 985 0． 999 3 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 2． 2
luminol-CuSO4-H2O2 1 ΔI = 71． 509lgC + 26． 56 0． 983 8 13． 2 ～ 100． 0 4． 4 21． 3
2 ΔI = 75． 58lgC + 49． 522 0． 995 8 4． 4 ～ 33． 3 1． 5 10． 1
3 ΔI = 74． 69lgC + 17． 527 0． 993 5 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 27． 2
4 ΔI = 60． 111lgC － 32． 91 0． 982 6 43． 9 ～ 500． 0 14． 6 239． 5
5 ΔI = 50． 518lgC + 32． 705 0． 983 6 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 22． 0
6 ΔI = 71． 178lgC + 26． 143 0． 994 7 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 21． 4
7 ΔI = 60． 871lgC + 51． 549 0． 999 2 3． 9 ～ 29． 6 1． 3 5． 6
8 ΔI = 74． 662lgC + 16． 689 0． 995 6 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 27． 9
9 ΔI = 65． 967lgC + 31． 762 0． 993 4 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 18． 9
10 ΔI = 64． 129lgC + 17． 946 0． 983 2 17． 6 ～ 200． 0 5． 9 31． 6
11 ΔI = 74． 551lgC + 22． 074 0． 995 8 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 23． 7
12 ΔI = 78． 034lgC + 22． 654 0． 990 3 8． 8 ～ 100． 0 2． 9 22． 4
3． 4 糖蛋白清除自由基能力相关性分析
将上述所获得的 IC50值，采用 Spearman 等
级相关系数法(SPSS 19． 0 统计软件，USA)对覆
盆子中糖蛋白清除 H2O2、O
2 －和·OH 能力进行
相关性分析(表 3)。结果表明，在置信度为 0．
95 时，覆盆子总糖蛋白清除 H2O2 和·OH 的能
力显著相关(r = 0． 643，p = 0． 024) ，而清除
H2O2 和·OH的能力与清除 O
2 －的能力却没有
明显的相关性(r = － 0 ． 042，p = 0 ． 897;r = 0 ．
273，p = 0 ． 391) ，这一结果与其反应动力学曲线
相对应。在清除 H2O2 和·OH 自由基时，化学
发光类型表现为辉光型，而在清除 O2 －自由基时
却表现为闪光型。然而，由于糖蛋白结构比较
复杂，即使通过纯化分离得到分子量相对单一
的糖蛋白，也会由于蛋白质所连接糖的差异而
有所不同，因而对糖蛋白抑制化学发光的机理
研究还需进一步探索。
表 4 覆盆子糖蛋白清除自由基相关性结果
Table 4 The correlation results of scavenging free radical of
glycoprotein of Rubus chingii Hu．
清除 O2 － 清除·OH
清除 H2O2 － 0． 042 0． 643*
清除 O2 － — 0． 273
第 5 期 雷利芳，等:微孔板结合化学发光法快速测定覆盆子中总糖蛋白的抗氧化活性 655
4 结 论
将微孔板与化学发光法相结合，建立了一种
快速测定覆盆子中总糖蛋白清除自由基活性的方
法。与传统的比色法相比，该方法具有样品用量
少、操作简单、检则速度快等优点，适用于中药中
有效成分的抗氧化活性检测及药物活性的大批量
筛选。
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