全 文 ：漏芦对油酸诱导ＨｅｐＧ２细胞脂肪累积的干预作用
章　斌１，刘　艳，张春凤，杨中林＊
（中国药科大学 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏 南京２１０００９）
摘　要：目的：通过体外肝细胞脂肪累积模型评价漏芦清除肝细胞脂肪累积的干预能力。方法：用油酸
诱导 ＨｅｐＧ２细胞脂肪累积建立模型；以噻唑兰染色吸光度（ＯＤ值）、甘油三酯（ＴＧ）含量变化为指标，结
合细胞内脂滴形态，评价漏芦对油酸诱导 ＨｅｐＧ２细胞脂肪累积的干预作用。结果：漏芦能显著降低油
酸诱导的肝细胞脂肪累积，其中２５０μｇ·ｍＬ
－１漏芦提取液对ＴＧ的清除率达到１４．２２％。结论：漏芦对油
酸诱导 ＨｅｐＧ２细胞脂肪累积具有干预作用。
关键词：漏芦；ＨｅｐＧ２细胞；脂肪累积；ＴＧ
中图分类号：Ｒ２８５．５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１３）０５－００１０－０３
收稿日期：２０１３－０１－３０
基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（ＰＡＰＤ）
作者简介：章斌（１９８６－），男，中国药科大学硕士研究生。
通讯作者：杨中林（１９５０－），女，中国药科大学教授，博士生导师，研究方向为中药炮制与中药制剂。
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　Ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ　ｏｎ　Ｏｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｆａｔ　Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＨｅｐＧ２Ｃｅｌｓ
Ｚｈａｎｇ　Ｂｉｎ，Ｌｉｕ　Ｙａｎ，Ｚｈａｎｇ　Ｃｈｕｎｆｅｎｇ，Ｙａｎｇ　Ｚｈｏｎｇｌｉｎ＊
（Ｃｈｉｎａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆａｔ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ
（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｆａｔ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＨｅｐＧ２ｃｅｌｓ　ｆｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｓｔｅａｔｏｓｉｓ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．ＭＴＴ　ｖａｌｕｅ，ｔｏｔａｌ　ｔｒｉ－
ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）ａｎｄ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｌｉｐｉｄ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ　ｏｎ　ＨｅｐＧ２
ｓｔｅａｔｏｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｇａｉｎｓｔ　ＴＧ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＨｅｐＧ２ｃｅｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ
１．０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＴＧ　ｒｅａｃｈｅｄ　１４．２２％ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　２５０μｇ·ｍＬ
－１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃ－
ｕｍ　ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ　ｒｅｖｅａｌｓ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆａｔ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　Ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ；ＨｅｐＧ２Ｃｅｌｓ；Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ；ＴＧ
　　非酒精性脂肪性肝病（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ，
ＮＡＦＬＤ）的发病率近年来不断攀高，且起病渐趋低龄化，已
经成为发达国家和地区的常见病之一，在我国亦有望成为
慢性肝病的首要病因［１－２］。研究证明，游离脂肪酸可以产生
潜在的细胞毒性，并能引发脂质的过量累积。脂肪酸诱导
的 ＨｅｐＧ２细胞脂肪累积模型与脂肪肝的病理学特征具有
很大的相似性［３］。
漏芦［Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ（Ｌ．）ＤＣ．］，为菊科植物
祁州漏芦的干燥根。漏芦苦寒，归胃经，有清热解毒，消痈，
下乳，舒筋通脉的作用，可治疗乳痈肿痛，痈疽发背，瘰疬疮
毒，乳汁不通，湿痹拘挛［４］。有报道漏芦水煎液具有一定的
降胆固醇作用［５］。本文通过脂肪酸诱导的 ＨｅｐＧ２细胞脂
肪累积模型来评价漏芦水提液清除肝细胞脂肪累积的干预
能力。
１　材料
１．１　实验材料与试剂
漏芦饮片（产地江苏，购自南京先声药店，经本人鉴定
为菊科植物祁州漏芦Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ　ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ（Ｌ．）ＤＣ．的
干燥根）；人肝癌细胞系（ＨｅｐＧ２）（中国药科大学国家新药
筛选中心惠赠）。
血脂康胶囊（批号：Ｚ１０９５００２９，北京北大维信生物科技
有限公司）；辛伐他汀片（批号：Ｈ２００１０４５４，哈药集团三精制
药股份有限公司）；ＤＭＥＭ 高糖培养基（批号：９９１０３０，美国
Ｇｉｂｃｏ公司）、胎牛血清（ＦＢＳ）（批号：ＮＷＣ０３８８，美国 Ｈｙ－
ｃｌｏｎｅ公司）；油红Ｏ（批号：Ｏ０６２５，美国Ｓｉｇｍａ公司）、二甲
基亚砜（ＤＭＳＯ）、异丙醇、乙醇（分析纯；南京化学试剂有限
公司）、胰蛋白酶（批号：２７２５００１８，美国Ｇｉｂｃｏ公司）；牛血清
蛋白（ＢＳＡ）（批号：７３８３２８，瑞士Ｒｏｃｈｅ公司）；ＭＴＴ（批号：
—０１—
０７９３，美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司）；总甘油三酯（ＴＧ）测定试剂盒
（批号：００６３０４，北京北化康临床试剂有限公司）；Ｗｅｓｔｅｒｎ及
ＩＰ细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）。
１．２　仪器与设备
ＴＧＬ－１６型高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；
ＢＳ１２４Ｓ型电子天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；超
净工作台（苏州艾可林净化设备有限公司）；ＨＥＲＡ? ＣｅＬＬ
１５０型恒温培养箱（Ｋｅｎｄｒｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｅｒｍａ－
ｎｙ）；ＲＴ－６０００型酶标分析仪（深圳书社生命科学股份有限
公司）；ＨＨ－４型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；ＣＯ－
ＩＣ　ＸＤＳ－１Ｂ型倒置光学显微镜（重庆光电仪器有限公司）；
ＹＸＱ·ＳＧ４１·２８０型电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用
核子仪器厂）。微孔滤器（０．２２μｍ　Ａｃｒｏｄｉｓｃ　Ｓｙｒｉｎｇｅ　ＦｉＬｔｅｒ，
ＵＳＡ）；培养皿、培养板：（Ｃｏｒｓｔａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）。
２　方法
２．１　药液制备
２．１．１　漏芦细胞供试液制备　称取３０ｇ漏芦饮片，粉碎
后放入１　０００ｍＬ大烧杯中，分别加水煎煮３次，每次１０倍
量水，第一次煎煮前药材浸泡２ｈ。三次的提取液均过滤，合
并，浓缩，干燥得漏芦水提液粉末６．５ｇ。精密称取１０ｍｇ漏
芦水提液粉末，加９５％乙醇１００μＬ溶解，加９　９００μＬ　ＤＭＥＭ
高糖培养基，混匀，经０．２２μｍ微孔滤膜过滤，即得浓度为
１　０００μｇ·ｍＬ
－１的漏芦水提液储备液。上 述 储 备 液 用
ＤＭＥＭ高糖培养基依次稀释得到不同浓度的细胞供试样
品溶液。
２．１．２　血脂康样品溶液制备　精密称取血脂康粉末
０．０１０７ｇ，加１００μＬ无水乙醇溶解，再加ＤＭＥＭ高糖培养基
至１０ｍＬ，混匀溶解，过滤，即得１０００μｇ·ｍＬ
－１的血脂康药
液。ＤＭＥＭ高糖培养基稀释得到１５０μｇ·ｍＬ
－１的血脂康阳
性对照药样品溶液，备用。
２．１．３　辛伐他汀样品溶液制备　精密称取辛伐他汀片粉
末０．０２３３ｇ（含１ｍｇ辛伐他汀），加１０ｍＬ　ＤＭＥＭ 高糖培养
基溶解，过滤，即得１００μｇ·ｍＬ
－１的辛伐他汀阳性对照药样
品溶液，备用。
２．１．４　油酸造模剂溶液制备　取油酸１０μＬ，加０．３０６ｍＬ
０．１ＭＮａＯＨ，７０℃水浴溶解，即得１００ｍＭ 油酸液；精密称
取０．２８４４ｇ　ＢＳＡ，加ＰＢＳ配置成１０％的ＢＳＡ溶液；将油酸
液逐滴滴入ＢＳＡ液中，即得１０ｍＭ油酸储备液，过滤除菌，
备用。
２．２　细胞培养
ＨｅｐＧ２细胞用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基
培养。当细胞达８０％～９０％密度时传代。取对数生长期细
胞接种于９６孔培养板和２４孔培养板进行实验。
２．３　ＭＴＴ测定
细胞消化，计数，按８×１０４ 个／ｍＬ细胞密度接种于９６
孔板，２４ｈ后加样，继续培养２４ｈ，弃上清液，加 ＭＴＴ终质量
浓度为０．５ｍｇ·ｍＬ－１的无血清培养液２００μＬ，３７℃继续培
养，４ｈ后终止培养，弃上清液，加１５０μＬＤＭＳＯ，置摇床低速
振荡５ｍｉｎ，于４９２ｎｍ处测吸光度。
细胞存活率／％＝Ａ样品４９２ｎｍ／Ａ对照４９２ｎｍ×１００ （１）
式中：Ａ样品４９２ｎｍ为样品吸光度；Ａ对照４９２ｎｍ为
正常对照的吸光度。
２．４　ＴＧ检测
将 ＨｅｐＧ２细胞接种于２４孔板，孵育２４ｈ后取出，设置
对照组（ＢＣ）、模型组（ＭＣ）、阳性组（血脂康为ＰＣ１，辛伐他
汀为ＰＣ２）和漏芦提取液加药组，每组均设６个复孔。对照
组每孔加２％ＢＳＡ的ＤＭＥＭ高糖培养基溶液，模型组每孔
加１ｍｍｏｌ·Ｌ－１油酸的ＤＭＥＭ 高糖培养基溶液，阳性组及
各加药组加１ｍｍｏｌ·Ｌ－１油酸和相应浓度的药液。将２４孔
板置于３７℃、体积分数５％ ＣＯ２ 培养箱孵育２４ｈ后去除培
养液，用ＰＢＳ清洗两遍，再用ｗｅｓｔｅｒｎ及ＩＰ细胞裂解液充分
裂解细胞，６　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，取上清液，用ＴＧ试剂
盒测定ＴＧ含量，并计算各加药组对ＴＧ的清除率。
ＴＧ清除率／％＝（Ａ模型－Ａ加药）／Ａ模型×１００ （２）
式中：Ａ模型为模型组吸光度；Ａ 加药为加药组吸光
度。
２．５　油红Ｏ染色观察细胞内脂滴形态
细胞培养方法和给药方法同“２．４”项。获得的细胞小
心用ＰＢＳ洗２次；７５％酒精固定１５ｍｉｎ；ＰＢＳ洗２次；６０％异
丙醇媒染１～２ｍｉｎ；油红Ｏ工作液（油红Ｏ溶于异丙醇配成
０．５％油红Ｏ贮备液，以６∶４的比例将贮备液与蒸馏水混
匀后过滤２次，至液体澄清为止，即得油红Ｏ工作液）染色
３０ｍｉｎ；蒸馏水洗两次；光镜观察。
２．６　统计分析
采用Ｏｒｉｇｉｎ８．０数据分析软件对数据进行处理，实验结
果以（珚ｘ±ｓ）表示。采用ｔ检验法比较组间差异，Ｐ＜０．０５具
有显著性差异，Ｐ＜０．０１具有极显著性差异。
３　结果与分析
３．１　漏芦细胞毒理学评价
漏芦水提液对ＨｅｐＧ２细胞存活率的影响见表１和图１。
表１　漏芦水提液对ＨｅｐＧ２细胞存活率的影响
（珚ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 浓度（μｇ·ｍＬ－１） Ａ（４９２ｎｍ） 存活率（％）
对照组 — ０．７２４±０．０１１ —
１０　 ０．７６４±０．０４４　 １０５．５２
５０　 ０．７３２±０．０８１　 １０１．１１
１００　 ０．７１１±０．０５０　 ９８．２０
漏芦水提
液给药组
１５０　 ０．７４５±０．０４０　 １０２．９０
２００　 ０．７６１±０．０９６　 １０５．１１
２５０　 ０．７５９±０．０４７　 １０４．８３
５００　 ０．６０７±０．０３２＊＊ ８３．８４
１０００　 ０．４６９±０．０３９＊＊ ６４．７８
注：“＊＊”表示给药组与对照组比较具有极显著性差异（＊＊Ｐ＜０．０１）。
实验结果表明，高浓度的漏芦水提液具有一定的细胞
毒性，当质量浓度达到５００μｇ·ｍＬ
－１时，开始出现细胞毒性；
质量浓度在１０～２５０μｇ·ｍＬ
－１范围没有细胞毒性。因此，采
用２５０μｇ·ｍＬ
－１的漏芦水提液作为干预 ＨｅｐＧ２细胞脂肪累
积的上限质量浓度。
３．２　漏芦对ＨｅｐＧ２细胞ＴＧ累积的抑制作用评价
漏芦水提液对ＨｅｐＧ２细胞内ＴＧ含量的影响见表２和
—１１—
图２。
图１　漏芦水提液对ＨｅｐＧ２细胞存活率的影响
表２　漏芦水提液对ＨｅｐＧ２细胞内ＴＧ含量的影响
（珚ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
浓度
（μｇ·ｍＬ－１）
ＴＧ含量
（ｍｇ／１０７个细胞）
ＴＧ清除率
（％）
对照组 — １．８０８±０．４３１ —
模型组 — ７．１８９±０．５４７＊＊ １００
血脂康组 １５０　 ３．５９５±０．７９４＃＃ ２１．１１
辛伐他汀组 １００　 ３．３２１±０．９３５＃＃ ２２．７２
５０　 ７．１１３±０．８２６　 ０．４５
１００　 ７．０８０±０．５８０　 ０．６４
漏芦水提
液给药组
１５０　 ６．６４１±０．６５７　 ３．２２
２００　 ５．９６２±０．８８６＃ ７．２１
２５０　 ４．７６７±０．５９９＃＃ １４．２２
注：“＊＊”表示与对照组比较具有极显著性差异（＊＊Ｐ＜０．０１），“＃＃”表
示与模型组比较具有极显著性差异（＃＃Ｐ＜０．０１），“＃”表示与模型组
比较具有显著性差异（＃Ｐ＜０．０５）。
图２　漏芦水提液对ＨｅｐＧ２细胞内ＴＧ含量的影响
由表２和图２可知，随着漏芦水提液质量浓度的增加，
ＨｅｐＧ２细胞内ＴＧ值呈现逐渐下降的趋势。当漏芦水提液
的质量浓度达到２００μｇ·ｍＬ
－１时，在统计学上有显著差异
（＃Ｐ＜０．０５）；当漏芦水提液的质量浓度达到２５０μｇ·ｍＬ
－１
时，在统计学上有极显著差异（＃＃Ｐ＜０．０１），此时ＴＧ清除
率达到最大为１４．２２％。
３．３　油红Ｏ染色观察
通过光学显微镜进一步进行形态学观察（图３），结果显
示，随着漏芦水提液质量浓度的增加，ＨｅｐＧ２细胞内红色脂
滴含量呈现减少的趋势，且脂滴变小，颜色变浅。综上可
知，漏芦水提液可有效降低ＨｅｐＧ２细胞ＴＧ含量，对脂肪肝
具有一定的防治作用。
图３　ＨｅｐＧ２细胞油红Ｏ染色
４　讨论
研究表明，脂肪肝是由于肝细胞游离脂肪酸的摄入和
ＴＧ的代谢不平衡所引起的。在细胞水平上建立脂肪肝模
型能大大缩短实验周期，为功能成分的评价提供方便快捷
的途径。相对于正常肝细胞，肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）易于培养，
细胞特性稳定，能够用于在细胞水平上探讨脂肪肝的病理
机制。
漏芦有抗动脉粥样硬化、抗氧化、免疫调节、抗缺氧及
改善记忆障碍［６］等方面的药理作用，应用广泛。本研究结
果显示，在无细胞毒性质量浓度范围内，漏芦水提物具有一
定的降低脂肪累积的能力，在２５０μｇ·ｍＬ
－１的浓度时效应最
强，提示该药的脂肪消除能力具有剂量依赖性。
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（责任编辑：尹晨茹）
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