全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2010 年
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3 小结
1）试验结果表明，川贝总生物碱最佳提取条件
为 pH 值 1、乙醇体积分数 50％、超声时间 75 min、
料液比 1∶10。
2） 试验过程中， 样品经粉碎后再用超声波处
理，可明显提高川贝总生物碱的得率。 这主要是由
于超声波具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，破坏植
物药材的细胞，使乙醇渗透到药材的细胞中，从而
使药材中的化学成分溶于乙醇。
3） 游离的生物碱及其盐一般能溶于甲醇和乙
醇。 甲醇的沸点比乙醇低，极性比乙醇大，对生物碱
及其盐类的溶解性比乙醇好，但它对视神经的毒性
很大，故本试验用乙醇作溶剂。
参考文献：
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收稿日期：2009－08－26
基金项目：湖南省科技厅项目（07JJ6044）
作者简介：刘卫今（1970－），男，湖南衡阳人，副教授，硕士，主要从事微生物学教学与研究，（电话）0745-2851213（电子信箱）fred888＠163．com。
第 49 卷第 2期
2010 年 2月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 49 No.2
Feb．，2010
羊耳菊黄酮类化合物的提取与抑菌作用
刘卫今 1，2，葛 婷 2，刘胜贵 2，刘学端 1
（1．中南大学资源加工与生物工程学院，长沙 410083；2．怀化学院生命科学系，湖南 怀化 418008）
摘要：采用微波辅助提取法提取羊耳菊总黄酮，在单因素试验的基础上，通过正交试验对提取工艺进行
优化，并用所得的提取物对 9 种微生物的抑菌作用进行了试验研究。 结果表明，羊耳菊总黄酮提取的最
佳工艺为乙醇体积分数 60％、固液比 1∶25、微波作用时间 4 min、微波火力为解冻；羊耳菊总黄酮提取物
对大多数供试微生物有抑制作用， 其中对藤黄八叠球菌抑菌效果最好， 其最低抑菌浓度为 0．003 9 g ／
mL；对粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为 0．125 0 g ／ mL；对大肠埃希氏菌、鼠
伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌最低抑菌浓度为 0．500 0g ／ mL；而对普通变形杆菌及白假丝酵母菌
抑制作用不明显。
关键词：微波；羊耳菊；黄酮；提取；抑菌作用
中图分类号：R284．2 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2010）02－0426-04
Extraction of Flavonoids from Inula cappa and Its Antibacterial Activity
LIU Wei－jin1，2，GE Ting2，LIU Sheng－gui2，LIU Xue－duan1
（1．College of Resources Processing and Bioengineering， Central South University，Changsha 410083，China；
2． Department of Life Sciences，Huaihua University， Huaihua 418008，Hunan，China）
Abstract：With the microwave－assisted technology for extracting flavonoids from Inula cappa， and on the basis of a single
factor experiment， the extraction process was optimized by orthogonal experiment． The optimal process for extracting
flavonoids from Inula cappa was ethanol concentration of 60％， a solid－to－liquid ratio 1∶25， 4 min microwave function with
the firepower at the level of defrosted． The antibacterial activities of nine kinds of micro－organisms extracted from Inula cap-
pa were studied． The results showed that the minimal inhibitory concentration （MIC） of the Inula cappa flavonoids to the
Sarcina lutea was the best with a ratio of 0．003 9 g/mL； MIC of Enterococcus faecalis， Bacillus subtilis and Staphylococcus
aureus was 0．125 0 g/mL； MIC of Escherichia coli， Salmonella typhimurium and Salmonella paratyphi A was 0．500 0 g/mL；
but no obvious inhibitory effect on Proteus valgaris and Candida albicaus．
Key words： microwave； Inula cappa； flavonoids； extract； antibacterial activity
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.02.072
第 2 期
黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界中的
低分子天然植物成分。 大量的药理试验研究表明，
黄酮类化合物有降脂、抗癌、抗血栓、抗氧化、抗衰
老、抗心率失常等作用。 此外，黄酮类化合物也是重
要的功能食品添加剂、天然抗氧化剂、天然色素、天
然甜味剂等， 同时还具有保鲜和护肤美容等作用。
随着研究的不断深入，黄酮类化合物对微生物的抑
制和杀灭作用也逐渐引起了人们的关注，因而广泛
用于医药、食品等行业［1－4］。
本试验以芦丁为对照品，将单因素分析和正交
试验相结合， 研究了微波法辅助提取羊耳菊（Inula
cappa）总黄酮的最佳工艺，并用紫外分光光度法来
测定总黄酮的含量。 此外，还对羊耳菊黄酮化合物
的抑菌活性进行了研究，以期为羊耳菊的深入开发
利用做一些基础工作。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试验样品 羊耳菊（Inula cappa），采自湖南
省怀化市。 将羊耳菊根洗净，于 60℃恒温箱中烘干
至恒重，用组织粉碎机粉碎。
1．1．2 供试菌种 大肠埃希氏菌 （Escherichia col-
i）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、粪肠
球菌（Enterococcus faecalis）、藤黄八叠球菌（Sarcina
lutea）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、
枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）、 白假丝酵母菌
（Candida albicaus）、 普通变形杆菌 （Proteus val-
garis）、甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi），
均由怀化学院微生物学实验室提供。
1．1．3 培养基 LB液体培养基： 蛋白胨 10 g，NaCl
10 g，酵母粉 5 g，用 1 mol ／ L NaOH 调 pH 值为 7．0，
去离子水定容至 1 000 mL；LB 固体培养基： 在 LB
液体培养基中加 16 g的琼脂粉。
1．2 方法
1．2．1 标准回归方程的建立 芦丁标准溶液的配
制、最佳吸收波长的确定和标准回归方程的建立参
照文献［5］的方法进行。
1．2．2 提取物制备 称取羊耳菊干粉 2 g 置于 250
mL 锥形瓶中，加入 70％乙醇溶液 30 mL，浸泡 12 h
后 ，在解冻档微波下处理 3 min，冷却 ，于 8 000
r ／ min 离心 10 min，去除沉淀，浓缩，加 30％乙醇定
容至 50 mL备用。
1．2．3 样品总黄酮含量的测定 精确量取 1 mL 样
品溶液至 25 mL 容量瓶中， 加入 5％的 NaNO2溶液
1 mL，摇匀，放置 6 min，加 5％Al（NO3）3溶液 1 mL，
摇匀，放置 6 min，加 4％ NaOH 溶液 10 mL，然后用
30％乙醇稀释至刻度，摇匀，放置 15 min，用紫外分
光光度计对样品提取液、 芦丁标准液进行扫描，在
两者都有最大吸光度的波长处测定吸光度，根据回
归方程计算样品中总黄酮含量。
1．2．4 单因素试验
1） 乙醇体积分数对总黄酮提取效果的影响
按照提取物制备方法 ， 分别用 40％ 、50％、60％、
70％、80％、90％乙醇溶液 30 mL 浸泡 2 g 羊耳菊干
粉，在解冻档微波条件下提取 3 min，按含量测定方
法测定吸光度，求得总黄酮得率。
2） 固液比对总黄酮得率的影响 按照提取物
制备方法，以不同的固液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶
30、1∶35、l∶40，W/V，g∶mL，下同），用 70％乙醇溶液浸
泡 12 h，微波提取 3 min，按含量测定方法测定吸光
度，求得总黄酮得率。
3） 微波火力对羊耳菊总黄酮提取效果的影响
按照提取物制备方法，在 70％乙醇溶液，固液比为
1∶15 的条件下，采用低火、解冻、中低火、中火、中高
火、高火不同的微波火力进行提取，按含量测定方
法测定吸光度，求得总黄酮得率。
4）微波提取时间对总黄酮提取效果的影响 按
照提取物制备方法，按固液比 1∶15 加入 70％乙醇溶
液浸泡 12 h， 分别用微波解冻档处理 1、2、3、4、5、6
min，按含量测定方法测定吸光度，求得总黄酮得率。
1．2．5 提取工艺的正交试验 采用微波辅助提取
法，设计正交试验考察乙醇体积分数、固液比、微波
火力、微波提取时间 4 个因素，每个因素取 3 水平，
运用 L9（34）作正交试验设计优选出最佳提取条件。
用亚硝酸钠－硝酸铝比色法测定总黄酮含量。
1．2．6 抑菌试验
1）菌悬液制备 将供试菌种分别接种于 LB 固
体培养基上，37℃活化培养 24 h 后， 在无菌操作条
件下，用麦氏比浊法，取活化后的菌落与无菌生理
盐水配成菌悬液浓度为 0．5McFarlaod 单位的标准
接种物 （即 1×108 CFU ／ mL）， 再用无菌生理盐水按
10倍稀释法将标准接种物配成 1×106 CFU ／ mL 的菌
悬液。
2）最低抑菌浓度（MIC）测定 在无菌条件下，
用 LB 培养基将羊耳菊提取物稀释到各含 1 mL 的
倍比系列试管中，使各管提取液浓度分别为 0．500 0、
0．250 0、0．125 0、0．062 5、0．031 3、0．015 6、0．007 8、
0．003 9、0．002 0、0．001 0 g ／ mL， 然后向各管中加入
0．1 mL 的含 1×106 CFU ／ mL 的菌悬液， 将培养物置
于 37℃恒温培养箱中培养 24 h，观察培养物生长情
况，以能抑制细菌生长的最小药物浓度为最小抑菌
浓度（MIC）。
刘卫今等：羊耳菊黄酮类化合物的提取与抑菌作用 427
湖 北 农 业 科 学 2010 年
2 结果与分析
2．1 乙醇体积分数对羊耳菊总黄酮得率的影响
不同乙醇体积分数下羊耳菊总黄酮得率的测
定，结果（图 1）表明，随着乙醇体积分数的增加，总
黄酮得率也逐渐增加， 但是当乙醇体积分数超过
60％的时候，总黄酮的得率反而降低。原因可能是随
着乙醇体积分数的增大， 提取物中杂质含量增加，
而有效成分含量降低，影响得率。 因此，初步确定最
佳浸提剂为 60％的乙醇。
2．2 固液比对羊耳菊总黄酮得率的影响
不同固液比下羊耳菊总黄酮得率的测定结果
（图 2）表明，固液比在 1∶10 至 1∶25 的范围内，总黄
酮得率呈上升趋势， 固液比为 1∶25 时得率最高，往
后得率虽有下降但变化不大。 在实际操作中，固液
比较小时，溶剂未能与羊耳菊粉充分接触，得率较
低；而固液比过大时，由于溶液量较大，需消耗更多
的能量来用于自身温度的升高，而且随着固液比的
增大，回收溶剂时耗时长耗能多。 所以，适宜的固液
比为 1∶25。
2．3 微波火力对羊耳菊总黄酮得率的影响
在不同微波火力条件下羊耳菊总黄酮得率的
测定结果（图 3）表明，微波火力从低火到解冻总黄
酮得率上升，在解冻档达到最大值，随后，微波火力
增加得率反而下降。 其原因可能是由于微波火力过
高时，乙醇沸腾的时间相对较长，从而使溶液挥发
过多造成总黄酮溶出量减少，同时使黄酮类化合物
产生分解，导致总黄酮得率下降。
2．4 微波提取时间对羊耳菊总黄酮得率的影响
不同微波提取时间下羊耳菊总黄酮得率的测
定，结果（图 4）表明，随微波提取时间的延长，总黄
酮得率增加，当提取时间为 4 min 时，黄酮得率达最
大，随后随时间增加得率反而下降。 原因可能是时
间过短，羊耳菊总黄酮提取不完全；时间过长，微波
的强热效应使部分黄酮类化合物活性成分降解或
异构化，从而导致提取物有效成分含量降低，黄酮
得率下降。 因此，初步确定 4 min为最佳提取时间。
2．5 羊耳菊总黄酮最佳提取条件的确定
在上述单因素试验的基础上，每个因素取 3 个
水平做正交试验，因素与水平见表 1。
正交试验结果见表 2。 由表 2 极差（R）分析可
以看出，影响羊耳菊总黄酮得率的因素主次顺序为
C＞B＞A＞D。 且认 A2B3C2D2提取条件最好，即乙醇体
积分数为 60％、 固液比为 1∶25、 微波提取时间为 4
min、微波火力为解冻。 通过验证试验，在此条件下
羊耳菊总黄酮得率为 49．43 mg ／ g。
2．6 最低抑菌浓度（MIC）测定结果
羊耳菊总黄酮提取液对 9 种供试菌的抑菌作
用结果见表 3。 由表 3 可知，在 9 种供试菌种中，羊
表 1 提取因素与水平
水平
1
2
3
A（乙醇体积
分数）//%
50
60
70
B（固液比）
//g∶mL
1∶15
1∶20
1∶25
C（微波提取
时间）//min
3
4
5
D（微波
火力）
低火
解冻
中低火
428
第 2 期
表 2 L9（34）正交试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T1
T2
T3
x1
x2
x3
R
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
93.49
95.23
94.56
31.16
31.74
31.52
0.58
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
91.54
95.73
96.01
30.51
31.91
32.00
1.49
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
92.48
97.02
93.78
30.83
32.34
31.26
1.51
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
94.45
95.11
93.72
31.48
31.70
31.24
0.46
总黄酮得率//mg/g
29．56
32．69
31．24
31．41
31．97
31．85
30．57
31．07
32．92
因素
耳菊总黄酮提取物对其中 7种菌具有抑制作用。 其
对藤黄八叠球菌的抑制作用最强， 最低抑菌浓度
（MIC）为 0．003 9 g ／ mL；对粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、
金黄色葡萄球菌的抑制作用次之， 最低抑菌浓度
（MIC）为 0．125 0 g ／ mL；对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙
门氏菌 、 甲型副伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度
（MIC）为 0．500 0 g ／ mL；而对普通变形杆菌和白假丝
酵母菌无明显抑制作用。
3 小结与讨论
微波辅助提取法的原理是微波射线辐射于溶
剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于极性的溶剂及
细胞内介电系数较大的极性分子吸收微波产生热
量，使胞内温度迅速上升发生汽化或膨胀，产生的
压力使细胞膜和细胞壁破裂，形成微小的孔洞和裂
纹。 孔洞或裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞
内，加快活性成分的溶出。 因此，与常规方法相比，
具有速度快、得率高、选择性强、操作简单、产物易
提纯等优点，在中药有效成分的提取中有良好的应
用前景［6，7］。
微波辅助提取羊耳菊总黄酮各因素影响的主
次顺序为微波提取时间＞固液比＞乙醇体积分数＞微
波火力。 正交试验得出最佳提取工艺为乙醇体积分
数 60％、固液比 1∶25、微波提取时间 4 min、微波火
力解冻。
对 9 种受试菌的抑菌效果进行比较，发现羊耳
菊总黄酮提取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果好于
革兰氏阴性菌。 因此，估计羊耳菊对革氏阳性菌引
起的疾病或许会有更好的疗效。 而对白假丝酵母菌
无明显抑制作用， 说明其对真菌的抑制作用较差。
本试验采用 2 倍稀释法测定羊耳菊总黄酮提取物
的 MIC 值较为敏感， 但其总黄酮提取物具有颜色，
所以本试验采用肉眼观察结合平板涂布等辅助手
段来判断其 MIC值。
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表 3 最小抑菌浓度（MIC）测定结果
菌 种
藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）
金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）
粪肠球菌（ Enterococcus faecalis）
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）
甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A）
普通变形杆菌（Proteus valgaris）
白假丝酵母菌（Candida albicaus）
最低抑菌浓度（MIC）//g/mL
0.003 9
0.125 0
0.125 0
0.125 0
0.500 0
0.500 0
0.500 0
—
—
注：“-”表示无抑菌作用。
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