全 文 ：毛大丁草醇提物的抗肿瘤作用及其分子机理研究
唐小江　黄华容1　方铁铮　陈　琪　佘志刚1　许实波
(中山大学生命科学学院 , 1 化学化工学院　广州　510300)
　　提　要　目的:研究毛大丁草醇提物(GPC-2)的抗肿瘤作用及其分子机理。方法:建立小鼠肝癌和 S180肿瘤模型 , 观察抗肿瘤
效果 ,测定 GPC-2 对 HepG2 的半数杀伤浓度(IC50)、凋亡及 p53 和 bcl-2 基因表达的影响。结果:GPC-2 对小鼠肝癌和 S180肉瘤均有
明显的抑制作用 ,但可引起荷瘤小鼠胸腺缩小。 GPC-2 对 HepG2 的 IC50为 58μg/ ml。 GPC-2 可抑制 bcl-2 基因的表达 , 引起人肝癌
细胞 HepG2的凋亡 。结论:GPC-2 可能通过抑制 bcl-2 的表达引起细胞凋亡 , 进而抑制肿瘤的生长。
　　关键词　毛大丁草;抗肿瘤;细胞凋亡;p53;bcl-2
　　毛大丁草(Gerbera piloselloides Cass.)民间有用作治疗肝炎
和肝癌 ,我们从毛大丁草中筛选出具有抗肿瘤活性成分(中华
人民共和国发明专利 ,申请号:01107652.6),并对其抗肿瘤作用
的机理进行了研究。
1　材料和方法
1.1　试验药物　毛大丁草采自罗霄山脉禾山段 , 经醇提 、减压
浓缩后得浸膏(简称 GPC-2 ,其化学成分与结构鉴定另外报道),
临用时用 DMSO 溶解后 , 再用生理盐水稀释。
1.2　试剂与器材　RPMI 1640 培养基为 GIBCO 公司产品 , 碘
化丙啶(propidium iodide , PI)、M TT、DMSO 、胰蛋白酶均购自
Sigma公司 , p53 和 bcl-2 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物
工程公司。胎牛血清(FBS)购自天津川页生化制品有限公司。
EPICSXL 型流式细胞仪 , 美国 Coulter公司产品。
1.3　动物及瘤株　S180瘤株 、HepA 小鼠肝癌瘤株 ,由中山大学
肿瘤研究所提供 ,本室传代保种。人肝癌细胞 HepG2 由中山大
学生物医学中心提供。 KM 小鼠 , 雄性 , 体重 18 ～ 22g , 清洁级 ,
由广州中医药大学实验动物中心提供。
1.4　小鼠体内抑瘤实验[ 1]
1.4.1　GPC-2 对小鼠 HepA 实体瘤的抑制作用　♂小鼠 50
只。取 HepA 肝癌荷瘤小鼠腹水 , 用预冷的生理盐水稀释至含
瘤细胞 1×1010/ L ,置冰上 , 每鼠左腋皮下接种 0.2ml。次日将
小鼠随机分成 5 组 , ip 药物或等体积生理盐水。
1.4.2　GPC-2对小鼠 S180实体瘤的抑制作用　瘤株为 S180 , 方
法同 1.4.1。
1.5　体外抗肿瘤实验　取 GPC-2 用 10%FBS RPMI1640 培养
液 5ml溶解成 2mg/ ml的待检液 , 然后稀释成 200 , 20 , 10 , 5 , 2.
5 , 1.25 , 0.625 , 0.3125μg/ ml备用。将对数增长的 HepG2 人肝
癌细胞制备成 1×106/ml的靶细胞悬液。取 96 孔培养板 ,每孔
加入 200μl靶细胞悬液 ,置 37℃5%CO 2 条件下培养 24h。实验
组换新的含不同浓度 GPC-2 的培养基 , 对照组换等体积的含
10% FBS 的 RPMI 1640 培养液。每个样品设 4 个复孔 , 置
37℃5%CO 2条件下培养 48h ,弃上清液 , 直接于光学显微镜下
观察细胞形态。然后加入 MTT 液 200μl/孔 ,继续培养 4h , 弃上
清。加入 DMSO 200μl/孔 , 吹打 , 使结晶充分溶解 , 用酶标仪以
试验波长为 570nm ,参比波长为 450nm 测定 OD 值。绘制剂量
反应曲线 ,计算半数杀伤浓度(IC50)。
1.6　分子机理研究
1.6.1　流式细胞测定 DNA 含量　分别取经 G2 处理和对照
HepG2 细胞约 1×106个 , 经 PBS 离心冲洗两次 , 70%乙醇固定
过夜 , PBS 离心冲洗去乙醇 , 加入 0.125%的胰酶和 0.01%ED-
TA , 2min后收集细胞 , 4%甲醛固定 , -20℃保存备用。临用时
加入 PI(终浓度为 50μg/ ml), 4℃暗染 30min , 用流式细胞仪测
定 DNA 含量。
1.6.2　DNA 琼脂糖凝胶电泳[ 2] 　分别收集 GPC-2 处理和对
照组细胞 1×106 个 , 按酚 、氯仿 、异戊醇抽提 ,乙醇沉淀等常规
方法提取细胞总 DNA , 1.5%琼脂糖凝胶电泳 , 紫外灯下观察
DNA 条带。
1.6.3　对人肝癌 HepG2 细胞 p53 和 bcl-2 基因表达的影响　
取 HepG2 约 1×106 个 ,加入 6 预先放有盖玻片的孔培养板 , 分
别加入 GPC-2 和培养液 , 24h 后取玻片进行免疫组化染色 , 采用
常规 ABC 法 , 具有操作步骤按说明书进行 , 根据颜色判断 p53
(突变型)和 bcl-2 基因表达情况。苏木素复染细胞核 , 以细胞核
出现棕黄色颗粒为阳性细胞。
2　结果
2.1　GPC-2 对小鼠 HepA 实体瘤的抑制作用　结果见表 1。
GPC-2三个剂量组均有显著的抑瘤作用 ,胸腺指数下降 , 脾指数
上升。 高 、中剂量组肝指数上升。 400mg/ kg 抑瘤率达 63.
07%,但动物的体重出现负增长。
　　表 1　 GPC-2对 HepA实体瘤的抑制作用及对免疫器官重量的影响( x ±s)
组别 剂量(mg/ kg)
鼠数
(只)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
胸腺指数
(‰)
脾指数
(‰)
肝指数
(%)
体重增加
(g)
对照 　 10 1.618±0.621 — 3.45±0.60 7.13±1.80 6.53±0.58 2.44±1.07
Cy 40 10 0.110±0.050 96.94＊＊ 1.37±0.39＊＊ 2.89±0.67＊＊ 5.59±0.38＊＊ -1.87±1.40＊＊
GPC-2 100 10 1.324±0.650 18.18＊＊ 3.21±0.60＊＊ 8.69±1.27＊＊ 6.75±0.32＊＊ 1.46±1.36＊＊
200 10 0.683±0.462 57.77＊＊ 2.10±0.54＊＊ 7.90±1.86＊＊ 6.76±0.39＊＊ 0.56±1.35＊＊
400 10 0.597±0.253 63.07＊＊ 1.90±0.57＊＊ 8.00±2.07＊＊ 7.15±0.42＊＊ -0.10±1.38＊＊
　　与对照组比较 ＊＊P<0.01(下同)
24 中药药理与临床 2003;19(2)
[ 基金项目]广东省中医药局科研课题(101028)
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2003.02.014
2.2　GPC-2 对小鼠 S180实体瘤的抑制作用　结果见表 2。三个
剂量组均有显著的抗肿瘤作用 , 100mg/ kg 抑瘤率达 47.42%。
胸腺指数均下降 , 100mg/kg 组脾 、肝指数上升。
　　表 2　 GPC-2对 S180实体瘤的的抑制作用及对免疫器官的影响( x ±s)
组别 剂量(mg/ kg)
鼠数
(只)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
胸腺指数　
(‰)　
脾指数　
(‰)　
肝指数　
(%)　
体重增加　
(g)　
对照 　 10 2.066±0.463 - 4.22±1.15 8.19±2.04 7.14±0.68 5.45±2.43
Cy 20 10 0.592±0.370 71.31＊＊ 1.86±0.48＊＊ 5.95±1.90＊＊ 7.39±1.03 1.15±3.35＊＊
GPC-2 25 10 1.654±0.620 19.92＊＊ 3.14±0.72＊＊ 7.67±1.95 7.17±0.78 4.54±1.95＊＊
50 10 1.352±0.394 34.55＊＊ 2.88±1.00＊＊ 8.38±1.56 7.26±0.60 4.03±2.10＊＊
100 10 1.086±0.344 47.42＊＊ 3.47±0.63＊＊ 8.78±1.56＊＊ 7.65±0.53＊＊ 3.97±2.14＊＊
2.3 　体外抗肿瘤实验　光学显微镜观察到 GPC-2 处理的
HepG2 细胞生长受到抑制 , 并出现贴壁生长细胞典型的凋亡形
态变化现象 ,即细胞由梭状逐渐变成圆形 , 细胞透明度和细胞
粘附力降低。对肿瘤细胞的半数杀伤浓度 IC50为 58μg/ ml。
2.4　DNA 含量的变化　GPC-2 引起凋亡细胞的百分率随着药
物浓度升高而升高 ,或在同一浓度药物处理下随作用时间延长
而升高。对照组凋亡峰(%)为 15.15±1.22 , GPC-2 100μg/ml
和 25μg/ ml凋亡峰(%)分别为 74.32±2.24 和 56.02±1.89。
2.5　DNA 琼脂糖凝胶电泳　GPC-2 处理 HepG2 细胞 20h 后 ,
10μg/ml 组未见明显的” ladder” , 但 100μg/ ml组可见典型的
“ DNA ladder” 。
2.6　对人肝癌 HepG2 细胞 p53 和 bcl2 基因表达的影响　与对
照组比较 , 经 GPC-2 处理后 p53 基因(突变型)表达变化不明
显 ,但 bcl2 基因表达减少。
3　讨论
　　GPC-2对小鼠肝癌和 S180肉瘤均有显著的抗肿瘤作用 , 但
可引起动物胸腺缩小。 100mg/kg 以上剂量还可以引起脾指数
升高和肝指数升高 , 400mg/ kg 时可引起动物体重出现负增长 ,
其它各剂量均可引起动物体重增加变慢 , 说明 GPC-2 有一定的
毒性 ,较安全又有效的剂量为 100mg/ kg 左右。
　　GPC-2 可引起细胞形态改变并有凋亡小体形成 , 流式细胞
仪检测 DNA 含量时出现明显的凋亡峰 , 高剂量时出现” DNA
ladder”等凋亡细胞的典型的形态和生化特征 ,表明 GPC-2 的抗
肿瘤作用的分子机理与诱导细胞凋亡有关。
　　基因水平的研究表明 , GPC-2 并不引起 p53 基因表达的明
显改变。 p53 是一个重要的与肿瘤细胞凋亡有关的基因 , 有野
生型和突变型两种存在形式。野生型 p53 基因对细胞凋亡有促
进作用 ,而突变型 p53 基因的作用相反 , 可以抑制细胞凋亡[ 3] 。
由于野生型 p53蛋白很不稳定 , 我们采用免疫组化的方法测定
的是突变型的 p53 蛋白。因此 ,本实验还不能确定 GPC-2 是否
引起野生型 p53 基因表达增强。但 GPC-2 对 HepG2 肝癌细胞
的 bcl-2 基因的表达有一定的抑制作用 , 提示其凋亡作用与抑制
Bcl-2 基因的表达有关。 bcl-2 基因被看作是细胞凋亡调控的最
后共同通路之一[ 4] , bcl-2 能抑制许多抗肿瘤药诱导细胞凋亡 ,
降低其细胞毒性 , 但并不影响药物对肿瘤细胞增殖的抑制作
用。本实验提示 GPC-2 的抗肿瘤作用与抑制 bcl-2 基因的表
达 ,促进细胞的凋亡有关。由于细胞凋亡涉及的因素很多 ,
GPC-2的抗肿瘤作用的分子机理我们仍然在研究中。
参考文献
1　唐小江 ,祝寿芬.山大黄多糖的抗肿瘤及免疫增强作用.中药药理
与临床, 1999;15(4)∶27～ 29
2　Morgenbeaser SD , Willams BO , Jacks T , et al.p53-dependent apopto-
sis produced by Rb-def iciency.Natu re.1992;371∶21～ 22.
3　Deb S , Jackson CT , Subler MA , et al.Modulation of cellular and viral
promotrt s by mutan t human p53 proteins found in tunor cell.J Vi rol ,
1992;66∶6164～ 6170
4 Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death.J Cell Biol ,
1993;75∶241
水半夏提取物的抗炎抗过敏作用研究
钟正贤　陈学芬　周桂芬　黄　平
(广西中医药研究所　南宁　530022)
　　提　要　目的:探讨水半夏提取物的抗炎抗过敏作用。方法:采用小鼠棉球肉芽肿和小鼠腹腔毛细血管通透性实验观察抗炎
作用;以 2.4-二硝基氯苯所致小鼠耳廓皮肤迟发型超敏反应 、小鼠被动皮肤过敏反应和组织胺所致局部皮肤三重反应 , 探讨抗过敏
作用。结果:水半夏提取物能减轻小鼠棉球肉芽组织重量和抑制毛细血管通透性;对组织胺所致过敏反应 、迟发型超敏反应和小鼠
被动皮肤过敏反应均有明显的抑制作用。结论:水半夏提取物具有抗炎和抗过敏作用。
　　关键词　水半夏;抗炎;抗过敏
25中药药理与临床 2003;19(2)
广西自然科学基金资助项目(桂科自 9811009)