全 文 ：作者单位:100050 北京 首都医科大学口腔医学院口腔医学研
究所
通讯作者:汤晓飞，E-mail:tangxf0401@ sohu． com，电话:010-
57099311
中药漏芦对口腔鳞癌细胞中转录因子 Ets -1及
过氧化物还原酶 Prx1 表达的影响
陈慧 王春晓 张敏 葛丽华 汤晓飞
【摘要】 目的 通过检测中药漏芦乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract，EA)对口腔鳞癌细胞株 SCC15 中转
录因子 Ets-1 及过氧化物还原酶家族成员 Prx1 的表达水平的影响，初步探讨漏芦对口腔鳞癌细胞氧化应激作用的
分子机制，为指导口腔癌临床用药提供新的思路。方法 50μg /ml漏芦 EA处理口腔鳞癌细胞株 SCC15 48h后，采
用荧光定量 PCＲ和 Western Blot，检测药物处理组和对照组中 Ets-1 和 Prx1 的 mＲNA 与蛋白表达情况。结果 倒
置显微镜下观察，50μg /ml漏芦 EA处理 SCC15 细胞 48h后，细胞生长速度较对照组减慢，细胞形态变圆，部分出现
皱缩变圆甚至脱落。与对照组相比，药物处理组中 Ets-1 和 Prx1 的 mＲNA 相对表达量显著降低(P = 0． 002，P =
0. 025)，蛋白表达水平显著降低(P = 0． 030，P = 0． 042) ，差异有统计学意义。结论 漏芦可能通过抑制氧化应激相
关蛋白 Ets-1 和 Prx1 表达来抑制口腔癌细胞的生长。
【关键词】 漏芦;口腔癌;Ets-1;过氧化物还原酶
【中图号】 Ｒ739. 85 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-673X(2016)02-0083-04
Effect of Ｒadix rhapontici on the expression of transcription factor Ets-1 and Prx1 in oral cancer CHEN Hui，
WANG Chun-xiao，ZHANG Min，GE Li-hua，TANG Xiao-fei． Beijing Institute of Dental Ｒesearch，Capital Medical
University School of Stomatology，Beijing 100050，China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Ｒadix rhapontici on the expression of transcription factor Ets-1
and Prx1 in oral cancer． Methods SCC 15 cells were treated with 50μg /ml EA extract of Ｒadix rhapontic for 48h． The
cell morphology was observed under inverted microscope，mＲNA and protein expression of Ets-1 and Prx1 were detected by
quantitative real-time PCＲ and western blot，respectively． Ｒesults SCC15 cells grew slowly and cell morphology changed
from polygonal to round shape under inverted microscope after the cells were treated with EA extract of Ｒadix rhapontic for
48h． Compared with control group，the EA extract of Ｒadix rhapontic inhibited mＲNA and protein expression of Ets-1 and
Prx1 in SCC15 cells(P ＜ 0． 05)． Conclusion EA extract of Ｒadix rhapontic may inhibit the cell proliferation via
regulating Ets1 and Prx1 expression in oral cancer．
【Key words】 Ｒadix rhapontic;OSCC;Ets-1;Prx1
漏芦(Ｒadix rhapontic)为菊科植物祁州漏芦
(Ｒhapinticum uniflorum(L．)DC．)的干燥根，分布于
陕西、辽宁、山西及吉林等省。传统医学认为其具有
清热解毒，消痈下乳，舒筋通脉的作用［1］。近年来，
学者们对漏芦的药效作用及作用机制进行了探讨，
发现其具有消炎、镇痛、保肝、抗氧化等作用［2］。除
此之外，国内外已陆续有文献报道漏芦的抗肿瘤作
用，但目前尚未见有漏芦与口腔癌发生发展的相关
报道。
ETS (V-ets erythroblastosis virus E26)基因家族
是最大的信号依赖转录调控因子家族之一。Ets-1
(E26 transformation specific-1，Ets-1)是 ETS 家族中
最具代表性的成员，与肿瘤细胞的增殖、转移密切相
关。过氧化物还原酶(peroxiredoxins，prxs)是特异性
巯基类抗氧化酶，广泛存在于原核和真核生物的细
胞质与细胞核中，通过催化和脂质氢过氧化物还原，
以达到使细胞免受氧化损伤的作用。过氧化物还原
酶 1(peroxiredoxin1，prx1)是该家族中最重要的成员
之一，在多种恶性肿瘤组织中表达增高，如食道癌、
肺癌、乳腺癌、口腔癌等，可能与口腔鳞癌的生长、复
发及转移相关，一些研究表明 Prx1 与恶性肿瘤的增
殖及侵袭能力高度相关。本课题组前期研究表明，
漏芦可抑制口腔癌细胞增殖，Prx1 在口腔鳞癌组织
中表达增高，与鳞癌细胞生长及氧化应激具有相关
性［3］。本研究旨在检测中药漏芦 EA 对氧化应激相
关的两种蛋白转录因子 Ets-1 及过氧化物还原酶家
族重要成员 prx1 表达的影响，初步探讨漏芦对口腔
癌作用的分子机制，以期为漏芦在口腔癌临床治疗
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提供实验依据及新的思路。
材料和方法
1. 实验材料
人 OSCC细胞株 SCC15 由首都医科大学口腔医
学院北京口腔医学研究所提供。漏芦乙酸乙酯提取
物(ethyl acetate extract，EA)由中国医学科学院药用
植物研究所黄林芳教授提供。改良 Eagle 培养基 /
F12 混合培养基(DMEM/F12) (Gibco，美国) ，胎牛
血清(HyClone，美国) ，Trizol (Life，美国) ，高产量
cDNA逆转录试剂盒(北京康为世纪生物科技有限
公司，中国) ，SYBＲ Green 荧光定量 PCＲ 试剂盒
(with ＲOX) (北京康为世纪生物科技有限公司，中
国) ，qPCＲ 引物合成(上海生工生物公司，中国) ;
Prx1 抗体(Abcam，美国) ;HＲP 标记的二抗(碧云天
公司，中国) ;ＲIPA(组织蛋白抽提试剂) (碧云天公
司，中国) ，BCA 蛋白定量试剂盒(碧云天公司，中
国) ，PVDF 膜(Millipore，美国) ，Western Show 预
染蛋白 Marker(Fermentas，加拿大) ，Western blot 封
闭液Ⅱ(北京康为世纪生物科技有限公司，中国)。
2. 细胞培养
OSCC细胞株 SCC15 细胞常规培养于含 10%胎
牛血清、104U /L 青霉素、104U /L 链霉素的 DMEM/
F12 培养基中。置 37℃、5% CO2 饱和湿度孵箱内
培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。实验
分两组，实验组加漏芦 EA 50μg /ml(漏芦 EA 贮存
液的配制:以 DMSO 溶解，配成浓度为 50mg /ml 的
贮存液，4℃恒温保存。用时稀释成所需浓度。)处
理 48h，设置对照组(对照组与实验组中含有同样剂
量的 DMSO)。
3. 实时荧光定量 PCＲ检测
实验按照试剂盒说明进行:①用 Trizol 试剂分
别提取各组细胞总 ＲNA。用核酸蛋白分析仪测定
其在波长 260、280nm 处的吸光度值(A 值) ，检测
ＲNA浓度和纯度;② cDNA 合成:用反转录试剂盒
合成 cDNA，反应体系 20μl，42℃，30min，85℃，
5min;③ ＲT-PCＲ 反应:设计合成目的基因 Ets1 及
Prx1 引物(Ets-1-F，5’-actccaagcagcaaagaaatga-3’;
Ets-1-Ｒ，5’-atcacccagtcccgaacat-3’Prx1-F，5’-gggtattc
ttcggcagatca-3’rx1-Ｒ，5’-tccccatgtttgtcagtgaa-3’)。反
应体系为 2 × UItraSYBＲ Mixture(With Ｒox Ⅰ)
10μl，浓度为 10μmol /L 的上下游引物各 1μl，DNA
模板 1μl，灭菌灭酶蒸馏水 7μl，反应液总体积 20μl。
反应条件均为:95℃预变性 10min，95℃变性 15s，
60℃退火延伸 1min，扩增 40 个循环。60℃延伸时
采集荧光信号。采用 2-△△Ct计算 Ets1 和 Prx1 基因
的表达。实验重复 3 次。
4. 蛋白质印迹
用 Trizol 试剂分别收集各组细胞，提取总蛋白
30μg，十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳
(sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis，
SDS-PAGE)电泳。电泳条件:浓缩胶恒压 80V，约
20min;分离胶恒压 120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底
部。转膜方法:湿转。转膜条件:按照电流 300mA
恒流转膜;0． 45μm 孔径 PVDF 膜，转膜时间 2h。
5%脱脂奶粉室温封闭 2h，一抗 Ets-1 稀释浓度
1∶ 500;Prx1 稀释浓度 1 ∶ 2000，4℃孵育过夜，Tris-
HCl 缓冲盐溶液(Tris-Buffered Saline Tween 20，
TBST)洗 5min × 7 次，二抗室温 40min，TBST洗 5min
× 7 次。ECL 反应、胶片曝光。Qantity one 凝胶成
像分析系统进行曝光采图。同时以 GAPDH 为内
参。实验重复 3 遍。
5. 统计学分析
应用 SPSS17． 0 for windows 统计软件对实验结
果进行正态性检验和方差齐性检验。采用两独立样
本 t检验，以 P ＜ 0． 05 作为差异有统计学意义。
结 果
1. 细胞形态学观察
在倒置显微镜下观察，对照组 SCC15 细胞呈不
规则多边形，折光性强。实验组细胞经浓度 50μg /
ml漏芦 EA处理 48h后，生长速度较正常组减慢，细
胞形态变圆，部分出现皱缩变圆甚至坏死脱落。高
倍镜下，实验组较对照组细胞形态异常，体积增大，
细胞间正常连接消失，细胞质内可见空泡，并见核固
缩、核碎裂(图 1)。
2. 中药漏芦 EA对 SCC15 细胞 Ets-1 和 Prx1 的
mＲNA表达的影响
采用 q-PCＲ法检测各组 Ets1 mＲNA 表达量并
进行统计学分析。实验结果显示，实验组经过
50μg /ml漏芦 EA 处理后 Ets-1 和 Prx1 mＲNA 相对
表达量降低，分别为 0． 46 倍、0． 51 倍，差异有统计
学意义(P ＜ 0． 05) (图 2)。
3. 中药漏芦 EA对 SCC15 细 Ets-1 和 prx1 蛋白
表达量的变化
采用 western blot的方法检测各组 Ets-1 和 Prx1
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图 1 倒置显微镜观察细胞培养 48h实验组与对照组细胞形态变化 A、B、C:对照组 SCC15 细胞培养 48 h的细胞形态 (倒置显微镜 × 40、
× 100、× 400)D、E、F:药物处理组 SCC15 细胞培养 48 h的细胞形态 (倒置显微镜 × 40、× 100、× 400)
图 2 50μg /ml漏芦 EA处理 48h后 OSCC15 细胞中 Ets-1 和
Prx1 的 mＲNA相对表达量变化
蛋白表达量。实验结果显示，实验组经过 50μg /ml漏
芦 EA处理后 Ets-1和 Prx1 蛋白相对表达量降低，采
用图像处理软件 Qantity one，进行灰度分析。结果显
示，Ets-1 较对照组降低 0． 63 倍，Prx1 较对照组降低
0． 73倍，差异具有统计学意义(P ＜0． 05) (图 3)。
讨 论
口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤，5 年生存
率徘徊在 50%左右［4］。因此，如何降低口腔癌发
病率，提高其疗效是目前亟待解决的难题。传统
中药是我国瑰宝，随着技术手段的不断进步，从基
因水平探究中药抗肿瘤的作用机制成为当前的研
究热点，其研究结果也给予了临床用药很大的指
导意义。
图 3 50μg /ml漏芦 EA处理 48h后 SCC15 细胞中 Ets-
1 和 Prx1 的蛋白表达变化
漏芦的干燥根为常用中药，分离后可得到包括
植物蜕皮激素、萜类、噻吩在内的 79 种化合物。研
究证明其具有抗氧化、调血脂、抗肿瘤、抗炎、镇痛等
广泛的药理活性［2］。漏芦水提物(ＲUWE)具有较
强的总抗氧化能力，可抑制 H202 或 Fe
2 +诱导的肝
线粒体脂质过氧化发生，且呈正比关系［5］。ＲUWE
可有效清除羟自由基，随着反应液中 ＲUWE 浓度的
增加，对活性氧的清除也呈上升趋势，表明 ＲUWE
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具有体外抗氧化活性。王会仓等［6］利用复方漏芦
汤治疗原发性肝癌 30 例，临床观察到其有抑制肿瘤
血管形成、诱导癌细胞凋亡、杀癌细胞、增强免疫等
多种抗癌作用。还有研究发现漏芦抽提液含药血清
(含药量 20%)对人乳腺癌耐药株 MCF-7 /ADＲ 细
胞作用时，可发挥直接抑瘤抗癌作用。本课题组前
期研究表明漏芦 EA对口腔鳞癌 SCC15 细胞增殖具
有一定抑制作用，发现 50μg /ml 漏芦 EA 处理
SCC15 细胞 48h、72h时作用效果最明显。本实验经
浓度 50μg /ml漏芦 EA处理 SCC15 细胞 48 h后，倒
置显微镜观察发现加药组细胞生长减慢，细胞形态
变圆，部分出现皱缩甚至坏死脱落。进一步证实漏
芦 EA对口腔癌细胞的生长有明显的抑制作用。为
探讨漏芦对口腔癌生长抑制的作用分子机制，我们
检测漏芦 EA 对氧化应激相关蛋白转录因子 Ets-1
及过氧化物酶家族成员 prx1 在 SCC15 细胞中表达
的影响。结果表明，50μg /ml 漏芦 EA 可明显抑制
SCC15 细胞 Ets-1 和 Prx1 的 mＲNA 和蛋白表达。
ETS 基因最早发现于美国 Frederick 的国家癌
症研究所分子肿瘤学实验室，ETS 转录因子有两个
主要的功能结构域，激活结构域和 DNA 结合结构
域。DNA结合结构域通过和富含嘌呤特异的 DNA
区域结合，调控靶基因的表达和功能，调节细胞的增
生、分化、凋亡及上皮间充质的相互作用等。Ets-1
是 ETS转录因子家族中第一个被发现的成员，位于
染色体 1 lq23． 3，调控着许多基因的表达。在正常
的生理过程中，Ets-1 参与了组织发育，细胞增殖、分
化、迁移、凋亡、氧化应激及新生血管的形成等［7］。
但同时 Ets-1 可以通过染色体移位、基因异常表达、
信号传导通路激活肿瘤形成、侵袭和转移过程中的
相关基因，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作
用［8］。Pande等［9］首次报道了 Ets-1 与口腔鳞癌的
发生发展密切相关，分别对正常口腔黏膜组织、癌前
病变、鳞癌组织进行免疫组化染色，发现其在口腔正
常粘膜中不表达，47%癌前病变中 Ets-1 染色阳性，
58%鳞癌组织中呈高表达，且在癌巢侵袭前缘免疫
染色较强，并且具有 Ets-1 免疫反应性的标本中大
多存在较强的间质着色，提示 Ets-1 的表达可能与
口腔鳞癌及其侵袭相关。Verschoor 等［10］首次报道
了 Ets-1 通过与细胞膜受体 Sxc-作用，使得胞内半胱
氨酸转化为谷胱甘肽(GSH) ，在氧化应激状态下，
通过调节 GSH水平，清除胞内活性氧，从而对肿瘤
细胞产生保护作用，抑制肿瘤细胞凋亡。Prx1 是过
氧化物还原酶家族的重要成员，其功能包括抗氧化
应激、清除过氧化物而保护细胞、以过氧化氢为第二
信使调节细胞内信号传递、调节细胞增殖等，其高表
达于多种恶性肿瘤中，如肺癌、口腔癌等。Yanagawa
等［11］对正常口腔黏膜及口腔鳞状细胞癌组织标本
进行研究发现，与正常组织相比，Prx1 在口腔鳞状
细胞癌中表达明显增高。我们前期研究发现 Prx1
在口腔白斑、鳞癌组织中表达增高，且 Prx1 在尼古
丁诱导的口腔鳞状细胞癌细胞中随着活性氧水平的
增高表达增高［12］。提示 Prx1 在口腔鳞癌的发生发
展中发挥重要作用，可能是口腔粘膜氧化应激损伤
密切相关。本实验首次检测中药漏芦 EA 对氧化应
激相关蛋白 Ets-1 及 Prx1 的表达，研究结果提示，漏
芦对口腔癌生长抑制作用可能是通过抑制 Ets-1 和
Prx1 的表达，抑制两者的抗氧化作用，从而抑制口
腔癌细胞的生长。
本研究通过检测漏芦 EA对氧化应激相关蛋白
转录因子 Ets-1 及过氧化物酶家族成员 Prx1 在口腔
癌细胞中表达的影响，首次在分子层面对传统中药
漏芦对口腔癌细胞的作用进行了初步探索，以期为
口腔癌临床药物的研发提供新的思路。
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(2015 年 10 月 25 日收稿)
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