全 文 ：中国农学通报 2011,27(27):239-244
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：国家自然科学基金“巴西橡胶树橡胶粒子膜蛋白复合物的研究”（31070608）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金“橡胶草野
生资源的调查和产胶性评价”(ITBBYB082)。
第一作者简介：李若霖，女，1985年出生，福建明溪县人，硕士，主要从事作物遗传育种及生物技术方面的研究。通信地址：571101海南省海口市城西
学院路4号中国热带农业科学院热带生物技术研究所，Tel：0898-66890587，E-mail：lruolin123@qq.com。
通讯作者：吴坤鑫，男，1969年出生，福建永定县人，副研究员，博士，主要从事作物遗传育种及生物技术方面的研究。通信地址：571101海南省海口
市城西学院路4号中国热带农业科学院热带生物技术研究所，Tel：0898-66890587，E-mail：kunxinwu@yahoo.com.cn。
收稿日期：2011-08-09，修回日期：2011-10-22。
橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化
李若霖 1,2，崔百明 3，王 颖 2，张秀春 2，陈雄庭 2，吴坤鑫 2
（1海南大学农学院，海南儋州 571737；
2中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带生物技术重点开放实验室，海口 571101；
3石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003）
摘 要：为探索适合橡胶草基因组DNA的提取方法和RAPD反应体系。采用改良CTAB法提取橡胶草
叶片总DNA，得到的DNA能满足RAPD分析需要。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTPs
浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD扩增结果的影响，建立了适合于橡胶草RAPD分子标记的最佳反
应体系，即20 μL体系中包括：模板DNA 30 ng、Taq DNA聚合酶1.75 U、dNTPs浓度0.25 mmol/L、Mg2+浓
度2.0 mmol/L、引物浓度0.5 μmol/L、10×PCR Buffer 2.0 μL。RAPD扩增反应程序为：94℃预变性5 min，
94℃ 30 s，37℃ 30 s，72℃ 70 s，45个循环，最后72℃延伸7 min。该反应体系具有较好的稳定性及可重复
性。
关键词：橡胶草；DNA提取；RAPD；反应体系
中图分类号：S576 文献标志码：A 论文编号：2011-2289
Extraction of Genomic DNA and Optimization of RAPD Reaction of Taraxacum kok-saghyz Rodin
Li Ruolin1,2, Cui Baiming 3, Wang Ying2, Zhang Xiuchun2, Chen Xiongting2, Wu Kunxin2
(1College of Agronomy, Hainan University, Danzhou Hainan 571737; 2Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology
/Ministry of Agriculture Key Biotechnology Laboratory of Tropical Crops, Haikou 571101;
3College of Life Science, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003)
Abstract: The purpose of this study was to obtain the best method for extracting genomic DNA from
Taraxacum kok-saghyz Rodin and to establish the best reaction condition of the RAPD amplification system.
The high quality genomic DNA of Taraxacum kok-saghyz Rodin could be obtained from young leaves by the
improved CTAB method. Some reaction conditions of PCR for RAPD were optimized by setting the gradient
with template DNA concentration, primer concentration, dNTPs concentration, Taq DNA polymerase
concentration and Mg2 + concentration through a single factor experiment. And the optimized reaction system
and program of RAPD were as follows. The reactions were performed in a volume of 20 μL, which
containing 30 ng DNA template, 1.75 U Taq DNA polymerase, 0.25 mmol/ L dNTPs, 2.0 mmol/L Mg2 + ,
0.5 μmoL/L random primer, 2.0 μL 10×PCR Buffer. The RAPD reaction was programmed by 1 cycle for 5 min
at 94℃, followed by 45 cycles for 30 s at 94℃, 30 s at 37℃, and 70 s at 72℃ and finally, followed by 1 cycle
for 7 min at 72℃. The reaction system was reproducible and highly reliable, and it could be effectively for
RAPD analysis in Taraxacum kok-saghyz Rodin.
Key words: Taraxacum kok-saghyz Rodin; extraction of DNA; RAPD; reaction system
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0 引言
橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin，简称TKS），
又称俄罗斯蒲公英（Russian dandelion），为菊科蒲公英
属的多年生草本植物，适宜在较寒冷的地区生长。目
前在中国新疆地区存在大量的橡胶草野生种质、哈萨
克斯坦及欧洲也有分布[1-2]。在橡胶草的根部天然橡胶
的含量可以达到其干重的 20%，从根部提取的天然橡
胶与巴西橡胶树所产天然橡胶的结构和性能相似，在
进行萃取橡胶的同时还可以获得大量的乙醇[3-5]。橡胶
草可生长在北方温带的广大地区，且当年栽培，当年收
获，是极好的橡胶树的替代产胶作物。同时，橡胶草是
草本植物，生活周期短，易于转基因操作，也是研究植
物产胶机理的理想的模式植物。因此，在原材料、能源
日趋紧张的今天，橡胶草作为工业原料和生物能源的
来源，已引起了国际上的广泛关注。目前美国和欧盟
计划将橡胶草作为本国天然橡胶生产的战略作物[5]。
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随
机扩增多态性DNA）技术，是由William[6]和Welsh[7]在
1990年提出的一种DNA分子标记技术。RAPD因为
具有操作简单快速、通用性广、灵敏度高且无需了解物
种基因组信息等优点，现已广泛应用于植物种质资源
遗传多样的研究、遗传连锁图的建立、基因定位以及导
入外源基因的追踪等[8]，尤其在对遗传背景所知甚少
的物种上具有特殊优势。例如，在香蕉（Musa spp.）、
核 桃（Juglans regia L.）、淮 山（Dioscorea opposite
Thunb.）、百合（ Lilium spp.）等植物中有利用RAPD技
术进行种质资源分析的研究报道[9-12]。由于RAPD反
应过程中涉及的反应因子较多，且对试验程序和条件
变化较敏感。因此，不同物种的RAPD反应体系需要
进行系统的探索和优化[13-14]。本研究旨在探索橡胶草
基因组 DNA的最佳提取方法以及建立橡胶草的
RAPD反应体系，为RAPD技术应用于橡胶草种质资
源遗传多样性和亲缘关系的鉴定等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 时间与地点
实验于2010年在中国热带农业科学院热带生物
技术研究所进行。
1.2 材料及主要试剂
1.2.1 实验材料 实验所用橡胶草样品于2009年7月和
2010年8月采自新疆伊犁地区。
1.2.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、
dNTPs等 PCR试剂，随机引物、β-巯基乙醇、EDTA、
CTAB、PVP-40购自上海生工生物工程技术服务有限
公司；Marker DL2000、Marker DL15000购自 TaKaRa
公司；乙醇、氯仿、异戊醇等其他试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 基因组DNA的提取
（1）高盐低 pH法 [15]提取基因组DNA。称取橡胶
草叶片0.5 g放入预冷的灭菌研钵中，加入液氮充分研
磨，将粉末转移到 15 mL离心管，加入 5 mL提取液
（100 mmol/L NaAc， 50 mmol/L EDTA-Na2，
500 mmol/L NaCl，2% PVP-40，2% SDS，pH 5.5），迅速
混匀，65℃水浴 30 min；4℃、11000 r/min离心 20 min，
弃沉淀；加入1/3体积的3 M KAc（pH 4.8），混匀，-20℃
静置20 min；4℃、11000 r/min离心5 min，弃沉淀；取上
清液，加入7/10体积的异丙醇，-20℃放置30 min；4℃、
10000 r/min离心 5 min，收集沉淀；用 70%乙醇洗涤 2
次，超净台中晾干 DNA，加入 100 μLddH2O溶解沉
淀，-20℃保存备用。
（2）修改的SDS法[16]提取基因组DNA。称取橡胶
草叶片 0.5 g，放入预冷的灭菌研钵中，加入液氮充分
研磨，将粉末转移到 15 mL离心管，加入 5 mL SDS抽
提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L
EDTA-Na2，500 mmol/L NaCl，0.5% β-巯基乙醇），加入
SDS到终浓度为 2%（w/v），迅速混匀，置于 65℃水浴
中 15 min；加入 3 mL的 5 M KAc，每隔 5 min摇动 1
次，共20 min；取出离心管，冷却至室温，12000 r/min离
心 20 min，取上清液；加入 15 mL预冷异丙醇，轻缓摇
匀，在-20℃下静置 30 min以上；4℃、6500 r/min离心
10 min，去上清液；加 750 μL T5E10缓冲液（50 mmol/L
Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0），溶解 DNA粗提
物；加入1 μL的10 μg/μL RNase，并在37℃水浴锅中温
育 60 min；加入 1/10体积的 3 M NaAc（pH 5.2）和 2体
积无水乙醇，小心混匀，-20℃冰箱中静置60 min以上，
析出DNA；用玻璃钩勾出DNA放入1.5 mL离心管中，
70%乙醇洗涤 2次；倒去乙醇，超净台中晾干DNA，加
入 100 μL ddH2O溶解沉淀，DNA完全溶解后-20℃保
存备用。
（3）修改的CTAB法[17]，略改动。称取橡胶草叶片
0.5 g，放入预冷的灭菌研钵中，加入液氮充分研磨，将
粉末转移到 15 mL离心管，加入 5 mL 2×CTAB提取
buffer（2% CTAB，1% β-巯基乙醇，1.4 M NaCl，20 mM
EDTA-Na2，2% PVP-40，100 mM Tris-Cl，pH 8.0），快速
颠倒混匀，于65℃水浴30~60 min，期间颠倒离心管2~
3次；取出离心管，冷至室温，加入 1体积氯仿，轻缓颠
倒充分混匀；室温，10000 r/min离心15 min，取上清；加
入1体积氯仿再抽提1~2次，取上清，加入1/10体积的
3 M NaAc（pH 5.2）和 1体积预冷异丙醇，混匀后-20℃
静置30 min以上；4℃，11000 r/min离心15 min，沉淀用
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李若霖等：橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化
75%乙醇洗 2次（4℃，10000 r/min离心 5 min），倒去乙
醇，超净台中晾干DNA；加入 100 μL TE（10 mmol/L
Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶解后加入1 μL的
10 μg/μL RNase，在 37℃温育 60 min；加入 TE 至
1000 μL，分别加1 V Tris-苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）
和 1 V 氯仿：异戊醇（24:1）各抽提 1 次，每次
10000 r/min离心10 min，吸取上清液，加入1/10体积的
3 M NaAc（pH 5.2）和 1体积预冷异丙醇，-20℃静置
1 h；4℃、11000 r/min离心 15 min，70%乙醇洗涤 2次；
倒去乙醇，超净台中晾干DNA，加入 100 μL ddH2O溶
解沉淀，DNA完全溶解后-20℃保存备用。
1.3.2 橡胶草DNA浓度及纯度测定
（1）凝胶电泳检测。以λDNA作浓度对照，取
2 μL DNA样品，1.0%（w/v）琼脂糖凝胶（含 0.5 μg/mL
EB），电压 4 v/cm电泳 40 min，用BIO-RAD凝胶成像
仪（GeL Doc XR System）观 察 ，拍 照 保 存 。
（2）紫外分光光度法检测。分别测定 OD260、
OD280、OD230的值，判断有无蛋白质、RNA等杂质，从而
确定DNA的纯度。
1.3.3 RAPD-PCR反应体系的优化 主要通过比较了
模板DNA量、引物浓度、Taq DNA聚合酶量、Mg2+浓度
和dNTP浓度这5个主要影响因素，以寻找适合橡胶草
RAPD-PCR扩增反应的最佳反应条件。基准反应体
系（总体积 20 μL）：1.25 U Taq DNA 聚合酶，
0.25 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，50 ng模板DNA，
0.5 μmol/L引物。在上述反应体系及扩增条件的基础
上设置单因素优化试验，筛选出最佳反应体系。
（1）dNTP浓度优化。在模板DNA量、引物浓度、
Taq DNA聚合酶量、Mg2+浓度等其中国条件不变的情
况下，设计 0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 mmol/L等 5个
dNTP浓度梯度，确定最适合 RAPD反应的浓度。
（2）Mg2 +浓度优化。在模板DNA量、引物浓度、
Taq DNA聚合酶量、dNTP浓度等其中国条件不变的
情况下，设计 1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 mmol/L
等7个Mg2+浓度梯度，确定最适合RAPD反应的浓度。
（3）引物浓度优化。在模板DNA量、Mg2 +浓度、Taq
DNA聚合酶量、dNTP浓度等其中国条件不变的情况
下，设计0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75 mmol/L等 6
个引物浓度梯度，确定最适合RAPD反应的浓度。
（4）Taq DNA聚合酶量优化。在模板DNA量、引
物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度等其中国条件不变的情
况下，设计 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mmol/L等
7个Taq DNA聚合酶量梯度，确定最适合RAPD反应
的量。
（5）模板DNA量优化。在Taq DNA聚合酶量、引
物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度等其中国条件不变的情
况下，设计 5、10、30、50、70、100、150 ng等 7个模板
DNA量梯度，确定最适合RAPD反应的量。
对上述因素进行优化时，每个因素重复 3次。
PCR扩增程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 S；
37℃退火30 S；72℃延伸70 S；循环45次；最后72℃延
伸7 min。
1.3.4 RAPD-PCR产物检测 PCR结束后，在PCR管中
加入2 μL 10×loading buffer，混匀，取8 μL混合液上样
于 1%琼脂糖凝胶（含 0.5 μg/ml EB），电压 4 v/cm电泳
40 min后，BIO-RAD凝胶成像仪观察，拍照保存。优
化结果以背景低，谱带清晰，数目适中，稳定可重复的
组合为最佳反应条件。
2 结果与分析
2.1 DNA的提取
以新鲜橡胶草叶片为材料，分别采用高盐低 pH
法、SDS法和CTAB法提取DNA，每种方法设置3次重
复。将所提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图
1。电泳结果显示CTAB法所得DNA均有 1条清晰明
M1 M2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 1、M2分别为Marker15000、Marker2000；1~4分别为λDNA 50、100、150、200 ng；5~7为CTAB法提取的橡胶草基因DNA；
8~10为SDS法提取的橡胶草基因组DNA；11~13为高盐低pH法提取的橡胶草基因组DNA
图1 3种不同方法提取橡胶草基因组DNA电泳图
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亮的主带，无拖尾或弥散现象，完整性好；SDS法提取
所得DNA主带较弱，有拖尾现象，DNA也有部分的降
解，存在少量RNA；高盐低 pH值法提取所得DNA沉
淀呈黄褐色，电泳的主带最弱，提取所得的DNA最少。
由图1可以估算出各种方法提取的橡胶草基因组
DNA的浓度，就每克样品（鲜重）的产率而言，CTAB
法的产率约为38.7 μg/g，SDS法的产率约为24.0 μg/g，
高盐低pH值法的产率约为8.3 μg/g。260、230、280 nm
下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物
的值。OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度，OD260/
OD230估计去盐的程度。对于DNA纯制品，其OD260/
OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。从表1可以看出，3种
方法的OD260/OD230>2，表明溶液中残存的盐离子和小
分子杂质较少，符合标准。高盐低 PH值法和 SDS法
的 OD260/OD280>2，表明可能有较多 RNA残留；改良
CTAB法的OD260/OD280在 1.8~1.9之间，RNA残留小。
通过电泳检测和分光光度法测定结果表明：改良
后的CTAB法产率高，完整性好，可满足RAPD分子标
记的需要。
2.2 RAPD-PCR反应体系的优化
2.2.1 不同 dNTP浓度对RAPD扩增的影响 从扩增的
结果（图 2）可以看出，dNTP浓度在 0.25 mmol/L时条
带较清晰，且条带最多，过低条带减少，浓度过高条带
弥撒有部分拖带现象。因此，确定在RAPD反应体系
中，0.25 mmol/L为最佳的dNTP浓度。
2.2.2 不同Mg2+浓度对RAPD扩增的影响 从扩增的结
果（图3）可以看出，Mg2+浓度在1.0~1.5 mmol/L时几乎
看不出有扩增条带；随着浓度增加，条带越来越多，但
是当Mg2+浓度大于 2.0 mmol/L时，条带数没有明显改
变并且出现部分拖带现象；结果显示，当Mg2+浓度在
2.0 mmol/L时条带最多，且最清晰。因此，确定在
RAPD反应体系中，2.0 mmol/L为最佳的Mg2+浓度。
2.2.3 不同引物浓度对RAPD扩增的影响 从扩增的结
果（图4）可以看出，当引物浓度过低，引物和模板结合
几率低，扩增反应不完全，条带少且模糊；引物浓度在
0.5 μmol/L时条带稳定、清晰；而随着引物浓度的增
加，扩增产物出现了弥散现象，条带逐渐变弱。因此，
确定在RAPD反应体系中，0.5 μmol/L为最佳的引物
浓度。
2.2.4 不同Taq酶量对RAPD扩增的影响 从扩增的结
果（图 5）可以看出，Taq酶用量较低时，扩增出来的条
带弱、不清晰；当Taq酶用量为 1.75 U时，可以获得良
好的扩增结果；继续增加Taq酶用量并不能明显提高
扩增产物的量，造成Taq酶的浪费，而且会使非特异性
扩增产物含量增加，主条带模糊。因此，确定在RAPD
反应体系中，1.75 U为最佳的Taq酶浓度。
2.2.5 不同模板DNA量对RAPD扩增的影响 从扩增
的结果（图 6）可以看出，DNA量从 5 ng至 150 ng均有
条带；其中在模板DNA量为 30 ng时获得的条带最多
最清晰；当DNA量大于 30 ng反而条带出现弥散。因
此，确定在 RAPD反应体系中，30 ng为最佳的模板
样品编号
CTAB法1
CTAB法2
CTAB法3
SDS法1
SDS法2
SDS法3
高盐低pH法1
高盐低pH法2
高盐低pH法3
OD260/OD230
2.12
2.16
2.05
2.15
2.21
2.22
2.02
2.2
2.05
OD260/OD280
1.83
1.85
1.86
2.11
2.13
2.14
2.23
2.17
2.22
DNA产率/(μg/g)
40
38
38
20
26
22
10
8
7
表1 橡胶草基因组DNA光密度比值及产率
1~7分别为1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 mmol/L
图2 不同dNTP浓度的扩增结果
1~5分别0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 mmol/L
图3 不同Mg2+浓度的扩增结果
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李若霖等：橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化
DNA量。
2.3 确定橡胶草DNA最佳RAPD反应体系
通过上述对橡胶草RAPD反应体系的单因素优化，
建立了橡胶草RAPD的最佳反应体系（总体积 20 μL）
为：1.75 U Taq DNA 聚合酶，0.25 mmol/L dNTP，
2.0 mmol/L Mg2 +，30 ng模板 DNA，0.5 μmol/L引物。
适合橡胶草PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃
变性 30 S；37℃退火 30 S；72℃延伸 70 S；循环 45次；
最后72℃延伸7 min。
3 讨论
（1）DNA的提取。RAPD扩增的效果与模板DNA的
提取质量（DNA的纯度和完整性）有着密切的关系[13-14]。
不同植物的基因组必须采取与之相适宜的提取方法。
有报道高盐低 pH法可以有效地提取玉米叶片基因组
DNA[15]。该法采用 pH 值为 5.5的酸性提取液避免多
酚类物质电离化及进一步氧化，同时利用PVP- 40结
合酚类物质，防止DNA褐化；高浓度K+利于SDS与蛋
白质及多糖形成复合物，复合物经离心除去，从而去除
蛋白质和多糖；并且由于高盐低 pH法的提取环境比
较温和，RNase并没有失去活性，在不加入外源RNase
就可以除去RNA；但是如果提取时间太短导致细胞裂
解不彻底，就会影响DNA的产率[15]。高盐低 pH值法
提取橡胶草叶片所得DNA沉淀呈黄褐色，提取所得的
DNA较少，今后可能要适当延长提取时间以便提高
DNA的产率。
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55~65℃）条
件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出
核酸，但是SDS法可能对多糖及次生代谢物含量较高
植物的DNA提取效果不理想[18]。采用SDS法提取的
橡胶草基因组DNA的产率要高于高盐低 pH法，但是
电泳结果显示DNA发生部分降解，且存在较多RNA，
这可能是橡胶草叶片次生代谢物含量较高的缘故。
CTAB是一种阳离子去污剂，既能有效的裂解植
物细胞壁,又能有效地去除多糖类物质。该方法比较
适用于多糖类含量较多、不含酚类或含酚类较少的植
物DNA提取[17-18]。采用改良CTAB法，通过两次氯仿:
异戊醇（24:1）抽提，同时在提取液中加入β-巯基乙醇
和PVP-40 2种抗氧化剂，从而有效地避免了酚类物质
氧化，蛋白质污染，糖类及色素等物质干扰，从新鲜橡
胶草叶片提取获得的DNA产率最高、完整性好，可完
全满足RAPD扩增的需要。
（2）RAPD-PCR反应体系的优化。准确性和稳定
性是利用RAPD进行遗传分析的前提条件。RAPD分
子标记方法与其他一些分子标记方法相比较，操作简
单，试验时间短效率高，但是具有重复性较低的缺陷，
容易受到外界条件的影响，不同的DNA质量、不同的
仪器、不同的人操作和不同的反应体系等许多因素的
影响[13-14,19]。该研究采用单因子实验法分别将DNA浓
度、引物浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度设
1~6分别为0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75 μmol/L
图4 不同引物浓度的扩增结果
1~7分别为0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 U
图5 不同Taq酶量的扩增结果
1~7分别为5、10、30、50、70、100、150 ng
图6 不同模板DNA量的扩增结果
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定 5个梯度探讨其对PCR扩增的影响，实验发现不同
组分的浓度梯度对RAPD的条带数以及亮度的影响有
不同。由于Mg2+可以影响Taq DNA聚合酶的活性和扩
增的真实性及产物的特异性，因此Mg2+浓度是影响扩
增特异性主要的因子之一。Mg2+浓度降低能提高扩增
的严谨性，但是Mg2+浓度过低会使Taq DNA聚合酶失
活，得不到扩增产物。dNTP的量对循环数、扩增产物
的量有较大影响，浓度过高或过低均影响扩增条带效
果。浓度过高会使错误掺入率大大增加；浓度过低，则
会使反应速度下降，可能会导致无扩增产物或扩增产
物不稳定或者导致条带模糊。引物浓度对RAPD反应
的特异性扩增和扩增产物的量都有一定的影响。在引
物浓度较低时，由于引物的竞争抑制，基因组RAPD位
点有时不能全部测出，会造成差异的假象；而浓度高于
某一值时会使引物二聚体增加且会出现非特异性扩
增。Taq酶的活性和用量关系到扩增能否正常进行，是
PCR反应中最重要的因素之一。RAPD反应对模板
DNA用量的适宜范围较大[14]，但是模板分子数越多，则
错误扩增减少。DNA量较低可能导致扩增结果不稳定
及扩增条带模糊；浓度过高则可能使引物或dNTP过早
被耗尽，底物过量扩增而出现扩增结果不稳定的假象。
4 结论
分别采用高盐低pH法、SDS法和CTAB法提取相
同重量的新鲜橡胶草叶片的DNA，实验结果表明：高盐
低 pH值法提取所得DNA沉淀呈黄褐色，提取获得的
DNA量最少；改良SDS法提取所得DNA沉淀呈无色透
明，但是DNA有部分降解，且还存在少量RNA；而改良
CTAB法提取的基因组DNA数量最多、纯度高、完整性
好，均能进行PCR扩增，并获得多态性丰富、清晰的扩
增谱带，是橡胶草叶片基因组DNA提取的最佳方法。
通过 3次重复实验进行比较，最终确定橡胶草
RAPD的最佳反应体系，即 20 μL体系中包括：模板
DNA 30 ng，Taq DNA 聚 合 酶 1.75 U、dNTPs
0.25 mmol/L、Mg2 + 浓 度 2.0 mmol/L、引 物 浓 度
0.5 μmol/L、10×PCR Buffer 2.0 μL。
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