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辣木叶总黄酮响应面法微波萃取工艺优化及其体外降糖效果观察



全 文 :天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2015,27:979-985
文章编号:1001-6880(2015)6-0979-07
收稿日期:2014-08-20 接受日期:2014-11-19
基金项目:教育部《长江学者和创新团队发展计划》创新团队项目
(IRT0848);四川省科技计划(2015SZ0106)
* 通讯作者 Tel:86-853-2885753;E-mail:kywang@ sicau. edu. cn
辣木叶总黄酮响应面法微波萃取工艺
优化及其体外降糖效果观察
吉莉莉1,汪开毓1* ,罗晓波2,赵 玲1,黄小丽1,周 燕1
1四川农业大 学动物医学院动物疫病与人健康四川省重点实验室,雅安 625014;
2四川省自然资源科学研究院,成都 610015
摘 要:利用响应面法优化微波萃取辣木叶总黄酮工艺。选取乙醇浓度、微波功率、提取时间、液料比为影响因
素,总黄酮得率为评价指标。在单因素实验的基础上,通过 4 因素 3 水平 Box-Behnken 中心组合试验建立黄酮
得率的二次多项式回归方程,研究以上因素对总黄酮得率的影响。结果表明最佳提取工艺条件为:乙醇浓度
58%,微波功率 397 W,提取时间 8 min,液料比 59∶ 1,该条件下,总黄酮得率为 3. 45%,与预期基本相符。采用
HepG2 细胞研究辣木叶总黄酮体外降糖效果,检测该细胞 24 h 的葡萄糖摄取量。结果表明:在高糖环境下,辣
木叶总黄酮能促进 HepG2 细胞对葡萄糖的消耗;相同质量浓度下,经微波萃取的总黄酮降糖活性较回流提取得
到的强。
关键词:辣木叶;总黄酮;微波萃取;响应面法;体外降糖
中图分类号:TQ460. 1 文献标识码:A DOI:10. 16333 / j. 1001-6880. 2015. 06. 007
Optimization of Extraction of Total Flavones from Moriga oleifera Leaves
by Response Surface Methodology and Its in vitro Hypoglycemic Activity
JI Li-li1,WANG Kai-yu1* ,LUO Xiao-bo2,ZHAO Lin1,HUANG Xiao-li1,ZHOU Yan1
1Sichuan Agricultural University Department of Veterinary Medicine ,Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of
Sichuan Province,Ya’an 625014,China;2Sichuan Province Natural Resources Science Academy,Chengdu 610015,China
Abstract:The conditions for microwave-assisted extraction of total flavones from leaves of Moriga oleifera were optimized
by response surface analysis. On the basis of single-factor experiments,the relationship between main extraction condi-
tions including ethanol concentration,microwave power,extraction time and liquid-solid ratio were modeled using a 4-fac-
tor,3-level Box-Behnken experimental design. The established model was analyzed by response surface methodology to
obtain the optimal extraction conditions. The optimal extraction conditions were as follows:ethanol concentration of 58%,
microwave power of 397 W,extraction time of 8 min and liquid-solid ratio of 59∶ 1 (mL/g). Under these conditions,the
yields of total flavones were 3. 45%,which was consistent with the predicted value. Total flavones from M. oleifera leaves
were investigated for its hypoglycemic activity by measuring 24 hours glucose up take in cultured HepG2 cells. Overall,
our results suggested that the total flavones can enhance the glucose consumption in HepG2 cells under high glucose con-
dition;moreover,flavones extracted by microwave exhibited higher efficiency in glucose depletion than those extracted
from reflux extraction.
Key words:Moriga oleifera leaves;total flavones;microwave-assisted extraction;response surface methodology;hypogly-
cemic activity in vitro
辣木(Morniga oleifera Lam.)为辣木科、辣木属
植物,起源于印度北部的亚喜马拉雅山地带。印度
和非洲国家常用于治疗糖尿病、高血压、心血管病、
肥胖症等疾病[1,2]。近年来,辣木在我国广东、云
南、海南等都有引种栽培。2012 年辣木叶被中华人
民共和国国家卫生和计划生育委员会批准为新资源
食品。目前国内外对辣木叶提取物的研究,证明了
辣木叶黄酮类化合物有降低糖耐量、降血糖、降血脂
等作用[3-6]。
已报道的辣木叶黄酮提取有乙醇为溶剂的回流
提取法,耗时长,效率较低,且仅采用正交法优化提
取工艺[7,8]。微波萃取法用于黄酮类化合物提取
时,具有选择性高、节省时间、溶剂用量少,对环境安
全无害,提取效率高等优点[9]。响应面法与正交法
相比,能研究几种因素的交互作用,越来越广泛地运
用在解决多变量问题[10]。为此,本文以响应面法优
化辣木叶总黄酮提取工艺,并观察回流提取与微波
萃取总黄酮的体外降糖效果差异,为辣木叶资源开
发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
辣木叶粉,购自云南景洪云南省热带作物科学
研究所,石油醚 8 h 索氏回流去脂;芦丁,购自中国
生物制品检定所;DMEM 高糖培养基,购自 Thermo
生物化学制品(北京)有限公司;四甲基偶氮唑盐
(MTT),购自 Sigma 公司;胎牛血清,购自 Thermo 生
物化学制品(北京)有限公司;葡萄糖试剂盒,购自
南京建成生物工程研究所有限公司;HepG2 细胞
株,中国科学院成都生物研究所天然产物中心惠赠。
电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪,北京
祥鹄科技发展有限公司 XH-300UL 型;紫外可见分
光光度计,上海美谱达仪器有限公司,UV-1100 型;
酶标仪,BIO-RAD680 型;旋转蒸发仪,德国 IKA
RV05 型。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 标准曲线的建立
按照陈瑞娇[7]的方法建立芦丁对照品标准曲线。
1. 2. 2 回流提取辣木叶总黄酮及含量测定
按上法,准确称取样品 30 g,加入 70%乙醇,液
料比 20∶ 1,60 ℃回流提取 3 次,每次 1h。提取液滤
过,合并滤液,即得回流提取总黄酮(Flavones extract
by Reflux Extraction,FRE)。冷却至室温后,取滤液
1 mL,测定总黄酮浓度。
1. 2. 3 微波萃取辣木叶总黄酮及含量测定
准确称取样品,按试验设计的条件加入溶剂,置
微波提取仪中,仪器设定为微波功率恒定模式,磁力
搅拌。反应完成后滤过,即得微波萃取总黄酮(Fla-
vones extract by Microwave Extraction,FME)。冷却
至室温后取滤液 1 mL,按上法测定总黄酮浓度。
1. 2. 4 响应面法优化实验
在单因素实验的基础上,以乙醇浓度、微波功
率、提取时间、液料比等因素为考察变量,以总黄酮
得率 F为响应值,应用 Design-Expert8. 0. 6 软件,优
化微波提取辣木叶总黄酮的工艺条件。响应面分析
因素与水平设计见表 1。
表 1 响应面分析因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface design
水平
Levels
X1 醇浓度
Ethanol
concentration(%)
X2 微波功率
Microwave
power(W)
X3 提取时间
Extraction
time(min)
X4 液料比
Liquid-to-solid
ratio(mL /g)
-1 50 300 6 50∶ 1
0 60 400 8 60∶ 1
1 70 500 10 70∶ 1
1. 2. 5 辣木叶总黄酮体外降糖实验[11]
1. 2. 5. 1 细胞培养
将 HepG2 细胞接种于培养瓶中,加入含 10%热
灭活胎牛血清、100 U /mL 青霉素-链霉素双抗的
DMEM 高糖培养液,置 37C、5% CO2、饱和湿度的
CO2 培养箱中培养。每隔 2 d 更换 1 次培养液,3 d
后传代,传代数 1 ∶ 4。取对数生长期的细胞进行试
验。
1. 2. 5. 2 FRE 和 FME 对 HepG2 细胞葡萄糖消耗
作用及 MTT毒性试验
将冷冻干燥的 FRE和 FME 粉末配制成高浓度
水溶液,微孔滤膜滤过后,用无血清 DMEM 培养液
稀释至所需浓度待用。将处于良好生长状态的
HepG2 细胞,用 0. 25%胰蛋白酶液消化后,以 1 ×
105 个 /mL细胞接种于 96 孔培养板中,置于 CO2 培
养箱中培养,待细胞贴壁后,弃去原培养液,换无血
清培养液饥饿 12 h后,加入含样或不含样的高糖培
养液。将 96 孔培养板中细胞分为空白对照组、样品
组,每个组重复 6 孔,孵育 24 h 后用葡萄糖试剂盒
(氧化酶法)测定各孔培养液中葡萄糖的浓度,采用
式(2)计算葡萄糖的消耗量。
GC = G0-G24 (2)
式(2)中,GC:葡萄糖的消耗量,mmol /L;G0:0 h
培养液中葡萄糖浓度,mmol /L;G24:24 h 培养液中
089 天然产物研究与开发 Vol. 27
葡萄糖浓度,mmol /L;
同时进行 MTT毒性试验,在葡萄糖消耗试验孵
育结束,按文献[11]方法测定细胞存活性与数量。
1. 3 统计学分析
数据以 SPSS19. 0 软件分析,各组间差异采用
LSD分析。
2 结果与分析
2. 1 标准曲线
根据各浓度芦丁对应的吸光值,计算得到标准
曲线 C = 0. 0817A + 0. 0018,相关系数 R2 = 0. 9998。
2. 2 回流提取辣木叶黄酮得率
回流后的提取液滤过,总黄酮得率为 2. 05%,
与陈瑞娇的结果 3. 59%差异较大,可能因种植地
点、采摘时间、烘干方式不同等因素造成。
2. 3 单因素实验
2. 3. 1 乙醇浓度的影响
称取 5 份辣木叶粉,每份 1g ,于微波萃取仪中
提取。分别加入 50%、60%、70%、80%、90%乙醇,
微波功率 200 W,提取时间 6 min,液料比 50∶ 1,结果
见图 1a。由图 1a可见,乙醇体积分数在 60%时,提
取率最大,而乙醇浓度增加,提取率降低,这是因为
黄酮糖苷是由甙元成分和糖组成,甙元成分不易溶
于水,而糖又易溶于水,乙醇与水达到最佳比例时,
提取量最大。所以选择体积分数为 60%。
2. 3. 2 提取时间的影响
称取 5 份辣木叶粉,每份 1 g ,加入 60%乙醇,
微波功率 200 W,液料比 50∶ 1,分别按提取时间 6、
8、10、12、14 min。结果见图 1b。由图 1b可见,随时
间延长,总黄酮得率升高,当提取时间为 8 min 时,
达到最高,低于 8 min时,提取不完全,而高于 8 min
时,由于温度随时间升高,部分黄酮类化合物可能被
破坏,而导致得率下降。因此,选择提取时间为 8
min。
2. 3. 3 微波功率的影响
称取 5 份辣木叶粉,每份 1 g ,加入 60%乙醇,
液料比 50 ∶ 1,分别于微波功率 100、200、300、400、
500 W,提取 8 min。结果见图 1c。由图 1c 可见,随
着提取功率增加,总黄酮得率增加,功率达到 400 W
时最高,高于 400 W时则下降。这可能是过高功率
对黄酮类化合物活性成分产生破坏导致得率下降。
因此,选择提取功率为 400 W。
3.0
2.7
2.4
2.1
1.8
1.5




Yi
el
d(
%

40% 60% 80 100
乙醇体积分数
Ethanol%concentration(%)
a b
c d
4% 6% 8 10% 12% 14% 16
3.1
3.0
2.9
2.8
2.7
2.6
3.5
3.3
3.1
2.9
2.7
2.5
提取时间
Extraction%time(min)
0 100% 200% 300% 400% 500% 600
微波功率
Microwave%power(W)
0 30:1 40:1 50:1 60:1 70:1 80:1
液料比
Liquid鄄to鄄solid(mL/g)
3.5
3.3
3.1
2.9
2.7
2.5




Yi
el
d(
%





Yi
el
d(
%





Yi
el
d(
%

图 1 乙醇浓度(a)、提取时间(b)、微波功率(c)及液料比(d)对总黄酮得率的影响
Fig. 1 Effects of ethanol concentration (a),extraction time (b) ,microwave power (c)and liquid-to-solid ratio (d)on the extrac-
tion yield of flavones
2. 3. 4 液料比的影响
称取 5 份辣木叶粉,每份 1 g ,分别按照 30∶ 1、
40∶ 1、50∶ 1、60∶ 1、70∶ 1 加入 60%乙醇,微波功率 400
W,提取 8 min,结果见图 1d。由图 1d 可见,当液料
比为 60∶ 1 时,总黄酮得率最高。因为液料比不足
时,微波加热速度快,温度过高,破坏黄酮类化合物;
过高时,微波加热时间增长,未达到提取最佳温度或
保持时间不足使提取不完全。因此选择液料比为
60∶ 1。
2. 4 响应面法对辣木叶总黄酮微波提取工艺参数
的优化
试验方案及结果见表 2
189Vol. 27 吉莉莉等:辣木叶总黄酮响应面法微波萃取工艺优化及其体外降糖效果观察
将所得试验数据进行多元回归拟合,得到辣木
叶黄酮得率 Y 与微波提取各因素变量的二次回归
方程模型为:
Y = 3. 48-0. 087X1-0. 11X2 + 0. 039X3 +
0. 012X4-0. 05X1X2 + 0. 027X1X3 + 0. 057X1X4-
0. 14X2X3-0. 1X2X4 + 0. 006536X3X4-0. 27X
2
1-
0. 25X22-0. 29X
2
3-0. 26X
2
4
表 2 响应面试验方案与结果
Table 2 Design and results of response surface analysis
试验号
No.
X1 X2 X3 X4
黄酮得率
Extraction
Yield (%)
1 1 0 0 -1 2. 84
2 1 0 0 1 2. 95
3 0 0 0 0 3. 49
4 -1 0 0 -1 3. 08
5 0 0 1 1 2. 96
6 0 0 0 0 3. 49
7 1 -1 0 0 2. 90
8 0 -1 0 1 3. 12
9 0 1 0 1 2. 90
10 0 0 1 -1 2. 98
11 -1 0 0 1 2. 97
12 0 1 -1 0 3. 00
13 1 0 -1 0 2. 81
14 0 0 -1 -1 2. 87
15 0 1 1 0 2. 82
16 1 1 0 0 2. 79
17 0 0 -1 1 2. 83
18 -1 -1 0 0 3. 00
19 0 1 0 -1 3. 04
20 0 0 0 0 3. 51
21 -1 0 1 0 3. 01
22 0 -1 -1 0 2. 79
23 -1 0 -1 0 3. 05
24 1 0 1 0 2. 87
25 0 0 0 0 3. 48
26 -1 1 0 0 3. 09
27 0 -1 1 0 3. 18
28 0 0 0 0 3. 45
29 0 -1 0 -1 2. 82
各因素按影响大小排序为微波功率 X2 >醇浓
度 X1 >提取时间 X3 >液料比 X4。为了检验方程的
有效性,对微波提取总黄酮的数学模型进行方差分
析,并对各因子的偏向回归系数进行检验,结果见表
3。
由表 3 可见,该模型极显著(P < 0. 0001);方程
一次项中醇浓度 X1 为影响极显著(P < 0. 001),提
取时间 X3 为影响高度显著(P < 0. 01),其余为不显
289 天然产物研究与开发 Vol. 27
著(P > 0. 05);方程二次项因素均为影响极显著(P
< 0. 001);交互项 X1X2、X1X4 为影响显著(P <
0. 05),X2X3、X2X4 为影响高度显著(P < 0. 01),
X1X3、X3X4 为不显著。模型失拟项(P = 0. 1049)
表示模型选择合适。同时回归方程相关系数 R2 =
0. 9852,说明模型相关度很好。所以,可以使用该模
型来分析响应值的真实变化,可以用其确定最佳提
取工艺条件。
表 3 回归模型参数检验
Table 3 Parameter estimate of regression model
来源
Sources
平方和
SS
自由度
Df
均方
Mean square
F值
F value
P值
P value
显著性
significance
模型 mode 1. 46 14 0. 1 66. 79 < 0. 0001 **
X1 0. 091 1 0. 091 58. 57 < 0. 0001 ***
X2 2. 575E-003 1 2. 575E-003 1. 65 0. 2196
X3 0. 015 1 0. 015 9. 66 0. 0077 **
X4 1. 637E-003 1 1. 637E-003 1. 05 0. 3229
X1X2 9. 976E-003 1 9. 976E-003 6. 4 0. 0240 *
X1X3 3. 023E-003 1 3. 023E-003 1. 94 0. 1855
X1X4 0. 013 1 0. 013 8. 33 0. 0119 *
X2X3 0. 081 1 0. 081 51. 73 < 0. 0001 **
X2X4 0. 048 1 0. 048 30. 87 < 0. 0001 **
X3X4 4. 796E-005 1 4. 796E-005 0. 031 0. 8633
X21 0. 47 1 0. 47 300. 56 < 0. 0001 **
X22 0. 42 1 0. 42 272. 08 < 0. 0001 **
X23 0. 53 1 0. 53 339. 62 < 0. 0001 **
X24 0. 44 1 0. 44 284. 76 < 0. 0001 **
残差 residual error 0. 031 14 1. 559E-003
失拟项 lack of fit 0. 02 10 1. 975E-003 3. 80 0. 1049
绝对误差 pure error 2. 077E-003 4 5. 192E-004
总离差 total error 1. 48 28
注:* 差异显著(P < 0. 05);**差异高度显著(P < 0. 01);***差异极显著(P < 0. 001)。
Note:* means significant difference (P < 0. 05);** means highly significant difference (P < 0. 01);*** means extremely significant difference (P <
0. 001).
为了进一步研究相关变量交互作用以及确定最
优点,通过 Design Expert8. 0. 6 软件绘制响应面曲线
图进行可视化分析。结果见图 2。由响应面立体图
可知,响应值存在最大值,经软件分析计算,得到辣
木叶总黄酮的最佳提取条件:醇浓度 58. 45%,微波
功率 397. 15 W,提取时间 8. 13 min,液料比 59∶ 1,理
论提取率为 3. 49%。对该条件下进行 5 次验证试
验,结果表明,总黄酮平均得率为 3. 45%,试验结果
与模型基本相符,说明该模型能较好地模拟和预测
辣木叶总黄酮得率。微波萃取与回流提取相比,总
黄酮得率由 2. 05%升至 3. 45%,增加了 68. 3%;提
取时间由 3 h 缩短至 8 min,仅为回流提取的
4. 44%。主要是因为微波萃取是利用微波使细胞内
部的温度迅速升高,压力增高使细胞破裂,药材内有
效成分流出,并在较低的温度下溶于萃取液,使提取
时间更短,提取率更高[12]。
2. 5 辣木叶总黄酮体外降糖试验
2. 5. 1 FRE和 FME对 HepG2 细胞增殖的影响
以空白对照为 100%计算,细胞存活率如图 3
所示。MTT 毒性试验表明,FME 与 FRE 浓度在
0. 125 mg /mL时,对细胞增殖有一定影响,存活率分
别为 99. 47%及 99. 90%,其余浓度细胞存活率均大
于 100%,表现为促进细胞增殖。提取物冻干粉末相同
质量浓度下,FRE组细胞存活率均高于 FME组。
389Vol. 27 吉莉莉等:辣木叶总黄酮响应面法微波萃取工艺优化及其体外降糖效果观察
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6总




Y
ie
ld
(%
) 3.63.4
3.2
3.0
2.8
2.6总




Y
ie
ld
(%
)
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6总




Y
ie
ld
(%
)a b c
d e f
500
450 400 350 300 50 55
60 65
70
A:醇浓度
Ethanol%concentration
50 55
60 65
70
A:醇浓度
Ethanol%concentration
B:微波功率
Microwave%power
10
9 8 7 6C:提取时间
Extraction%time
10
9 8 7 6C:提取时间
Extraction%time
50 55
60
70
A:醇浓度
Ethanol%concentration
65
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6总




Y
ie
ld
(%
)
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6总




Y
ie
ld
(%
) 3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6总




Y
ie
ld
(%
)
500450400350300
B:微波功率
Microwave%power
500
450400350300
B:微波功率
Microwave%power
70 65 60 55 50D:料液比
Liquid鄄to鄄solid
70 65 60 55 50D:料液比
Liquid鄄to鄄solid
70 65 60 55 50D:料液比
Liquid鄄to鄄solid
7 8
9
10
6 C:提取时间
Extraction%time
图 2 不同变量交互作用对总黄酮得率影响的响应面和等高线图
Fig. 2 Response surface plot and contour line of factors interaction on extraction yield of total flavones
注:a.醇浓度和微波功率;b.醇浓度和提取时间;c.醇浓度和液料比;d.提取时间和微波功率;e.液料比和微波功率;f.提取时间和液料比
Note:a. Ethanol concentration and microwave power;b. Ethanol concentration and extraction time;c. Ethanol concentration and liquid-to-solid ratio;d.
Extraction time and microwave power;e. Liquid-to-solid ratio and microwave power;f. Extraction time and liquid-to-solid ratio
CK
FME
FRE
108
106
104
102
100
98
96
94





Ce
ll%
vi
ab
ili
ty
(%
)
0.3125 0.625 1.25
药物浓度
Drug%concentration(mg/mL)
图 3 FME及 FRE的细胞毒性
Fig. 3 Toxicity of FME and FRE
表 4 FRE和 FME对 HepG2 细胞葡萄糖消耗作用
Table 4 The effect of FRE and FME on the glucose consump-
tion of HepG2 cell
组别
Group
剂量
Dose
(mg /mL)
葡萄糖消耗量 GC
Glucose consumption
(mmol /L)
葡萄糖消耗量校正值
Glucose consumption
correction GC /MTT
(mmol /L)
CK - 1. 902 ± 0. 094 1. 886 ± 0. 095
FRE 0. 31 2. 179 ± 0. 169 2. 036 ± 0. 152*
0. 62 2. 558 ± 0. 112 2. 415 ± 0. 107
1. 25 2. 730 ± 0. 126 2. 733 ± 0. 126
FME 0. 31 2. 457 ± 0. 054 2. 359 ± 0. 065
0. 62 2. 756 ± 0. 058 2. 712 ± 0. 056*
1. 25 2. 999 ± 0. 082 3. 016 ± 0. 10*
*表示与对照组有显著差异(P < 0. 05)。
* means significant difference with the control group (P < 0. 05).
2. 5. 2 FRE 和 FME 对 HepG2 细胞葡萄糖消耗的
作用
由表 4 可见,三个浓度的辣木叶黄酮提取物均
有增加细胞对葡萄糖的消耗作用,并且与空白对照
组相比,用药组的葡萄糖消耗量显著增加(P <
0. 05)。用 MTT校正,扣除细胞增殖抑制对培养液
中葡萄糖消耗的影响后,均显著增加单位细胞的葡
萄糖消耗量。相同质量浓度时,由 FME 比 FRE 表
现出更强的降糖活性,说明了微波萃取方法可能提
取的降糖有效成分含量更高。
3 结论
本研究采用微波萃取法提取辣木叶总黄酮,对
提高辣木叶总黄酮的综合利用以及黄酮类化合物的
产业化具有理论指导意义。通过响应面分析对其提
取工艺进行优化,微波萃取的最优提取工艺为:乙醇
浓度 58%,微波功率 397 W,提取时间 8 min,液料比
59∶ 1(mL /g)。在此条件下,辣木叶总黄酮得率为
3. 45%。该方法传统的回流提取相比,具有耗时短,
提取率高的优势。
辣木叶黄酮能促进 HepG2 细胞对葡萄糖的消
耗,与空白组相比具有明显降糖效果,而微波萃取得
到的总黄酮比回流提取得到的总黄酮表现出更强的
489 天然产物研究与开发 Vol. 27
降糖活性。提示微波萃取法能不仅缩短提取时间,
且能提高辣木叶中降糖活性成分的提取率。
致谢:非常感谢中国科学院成都生物研究所天
然产物中心张国林老师课题组赠与 HepG2 细胞。
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