全 文 ：324
辣木叶抗氧化活性研究
及活性成分含量测定
高秋玉，邓小宽，刘丽琼，何 淼，高 平*
(四川大学生命科学学院药用天然产物实验室，四川成都 610015)
收稿日期:2016－07－08
作者简介:高秋玉(1991－) ，女，在读硕士研究生，研究方向:天然药物化学，E－mail:848893521@ qq.com。
* 通讯作者:高平(1963－) ，女，博士，教授，研究方向:天然药物化学，E－mail:gaop@ scu.edu.cn。
摘 要:目的:确定辣木叶抗氧化有效部位，建立 HPLC测定辣木叶中新绿原酸和异槲皮苷含量的方法。方法:采用体
外方法评价辣木叶提取物四个部位石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、总奎宁酸和总黄酮的抗氧化活性;采用 HPLC，选
择 Sepax Sapphire C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈－0.05%磷酸溶液梯度洗脱，流速为 1 mL /min，检
测波长 330 nm，柱温 30 ℃。结果:以异槲皮苷为代表的黄酮类成分和新绿原酸等奎宁酸类成分清除能力最强，二者浓
度大于 800 μg /mL时，对 DPPH清除率达 80%以上，且对 DPPH和羟自由基清除率均高于石油醚和乙酸乙酯萃取物;
新绿原酸和异槲皮苷在检测范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为 98.84%、98.70%，ＲSD均小于 3.0%。结论:
辣木叶抗氧化有效部位为总奎宁酸和总黄酮;该方法简便可靠，可作为辣木叶中新绿原酸和异槲皮苷的定量分析
方法。
关键词:辣木叶，抗氧化活性，有效部位，HPLC，含量测定
Ｒesearch of antioxidative activity and determination of
active ingredients in Moringa oleifera Lam leaves
GAO Qiu－yu，DENG Xiao－kuan，LIU Li－qiong，HE Miao，GAO Ping*
(Laboratory of Medicinal Natural Products，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610015，China)
Abstract:Objective:To determine antioxidant effective parts and develop a HPLC method for simultaneous
determination of neochlorogenic acid and isoquercitrin in Moringa oleifera Lam leaves.Methods:The antioxidant
potency of four extracts of Moringa oleifera Lam leaves，which are petroleum ether extraction，ethyl acetate
extraction，total quinic acids and flavonoids，was evaluated in vitro systems. HPLC analysis was successfully
conducted by using a Sepax Sapphire C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)column，eluted with a gradient of acetonitrile
－ 0.05% phosphoric acid with a flow rate of 1 mL/min，and detected at 330 nm.The column temperature was set at
30 ℃.Ｒesults:Quinic acids like neochlorogenic acid and flavonoids represented by isoquercitrin showed strongest
scavenging capability. It showed that their scavenging activity of DPPH free radical reached 80%，when the
concentration was greater than 800 μg /mL. And both of them showed higher scavenging rate for DPPH and
hydroxyl radicals than petroleum ether and ethyl acetate extraction.Neochlorogenic acid and isoquercitrin showed
good linearity within the test ranges.The recoveries were 98.84%，98.70%，respectively and ＲSD was less than 3% .
Conclusions:The antioxidant effective parts in Moringa oleifera Lam leaves were total quinic acids and flavonoids.
The method is simple and accurate，and could be used to identify and evaluate the quantitative determination of
neochlorogenic acid and isoquercitrin in Moringa oleifera Lam leaves.
Key words:Moringa oleifera Lam leaves;antioxidant activity;effective parts;HPLC;quantitative determination
中图分类号:TS202.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2016)23－0324－04
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 23． 052
辣木(Moringa oleifera Lam)又名鼓槌树、马萝
卜、不死树等，属十字花目辣木亚目辣木科辣木属植
物，为多年生热带落叶乔木［1］。研究表明辣木叶富含
矿物质、氨基酸和维生素等营养物质成分［2－3］。另外，
辣木叶具有的消炎抑菌［4－5］、降血糖［6］、抗氧化［7］、治疗
溃疡［8］和疟疾［9］等医疗保健功能也引起了广泛关注。
目前，国内外关于辣木叶抗氧化活性研究局限
于粗提物上［10－11］，抗氧化成分不明确，基本没有质量
控制方面的报道［12］。为进一步确定辣木叶抗氧化有
效部位和制定其质量标准，本研究利用萃取和柱层
析方法对辣木叶提取物进行分离纯化，得到石油醚
萃取物、乙酸乙酯萃取物、总奎宁酸和总黄酮四个部
325
位，采用体外方法［13－14］评价该四个部位的抗氧化活
性，筛选得到有效部位，并建立 HPLC 测定活性成分
新绿原酸、异槲皮苷含量的方法，为辣木叶的质量评
价和合理开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
七水硫酸亚铁、水杨酸、维生素 C(VC)、30%过
氧化氢、乙醇、磷酸、石油醚、乙酸乙酯 均为分析
纯;乙腈 色谱纯，成都市科龙试剂厂;1，1 －二苯
基－2－三硝基苯肼(DPPH) 成都艾科达化学试剂有
限公司;实验用 5 批辣木叶样品(S1.云南丽江，S2.云
南昆明，S3.云南西双版纳，S4.广西河池，S5.广东韶
关) ，经四川大学生命科学学院药用天然产物实验室
鉴定为辣木科植物辣木 Moringa oleifera Lam 的干燥
叶;新绿原酸、异槲皮苷对照品 成都植标化纯生物
技术有限公司，纯度大于 98%。
LC3000 型高效液相色谱仪 北京创新通恒科技
有限公司，UV3000 紫外检测器，P3000 高压输液泵;
BS124S 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公
司;KH5200E 型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器
有限公司;Ｒ201D 真空旋转蒸发仪 巩义英峪高科
仪器厂;SHZ 循环水式真空泵 巩义予华有限责任
公司;UV8100 型可见分光光度计 北京莱伯泰科仪
器有限公司;MCI 层析材料 成都科谱生物有限公
司，50～70 μm。
1.2 实验方法
1.2.1 辣木叶提取物的制备 辣木叶药材粉碎过 40
目筛，取 500 g，加入 50%乙醇连续浸提 3 次。合并 3
次浸提液浓缩至无醇味得到辣木叶提取物浸膏。得
到的浸膏加水稀释后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，
分别得到石油醚萃取物(Petroleum ether Extraction of
Leaves，记为 PEL)、乙酸乙酯萃取物(Ethyl acetate
Extraction of Leaves，记为 EEL)。取适量萃取后的辣
木叶水相经 MCI 柱层析，先用水洗脱除去糖、蛋白
等，再依次用 3 个柱体积 30%甲醇、3 个柱体积 50%
甲醇洗脱［15－16］，结合 HPLC检测分段收集得到高纯度
的总奎宁酸和总黄酮类成分，分别记为 LM1 和 LM2，
将其减压浓缩蒸干备用。
1.2.2 辣木叶提取物对 DPPH 自由基清除能力的测
定 将待测样品和维生素 C用 50%乙醇配成浓度为
6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1000 μg /mL 的
样品溶液，在 5 mL 离心管中加入 2 mL0.1 mmol /L
(50%乙醇配制)DPPH标准溶液和 2 mL待测样品溶
液，混合均匀，室温下避光静置 30 min 后，以 50%乙
醇为空白对照，在 517 nm 波长下测定吸光值［17－18］。
DPPH自由基清除率的计算公式如下:
清除率(%)=［1－(Aj－Ai)/A0］× 100
式中:Aj，2 mL DPPH标准溶液和 2 mL样品溶液
的吸光值;Ai，2 mL 50%乙醇和 2 mL 样品溶液的吸
光值;A0，2 mL DPPH 标准溶液和 2 mL 50%乙醇的
吸光值。
1.2.3 辣木叶提取物对羟自由基清除能力的测
定 利用 Fenton反应测定辣木叶提取物清除羟自由
基的能力［19－20］。取 1 mL 2.5 mmol /L FeSO4 于 5 mL
离心管中，加入 1 mL 5% H2O2，混匀后立即加入待测
样品溶液 1 mL，混匀静置 5 min 待反应;加入 1 mL
2.5 mmol /L水杨酸，于 37 ℃恒温水浴锅中反应 1 h
后，于 510 nm波长处测定吸光值，记为 Am。将样品
溶液用等量 50%乙醇代替，在相同条件下测定的吸
光值，记为 A0;用等量蒸馏水代替 H2O2，在相同条件
下测得的吸光值记为 An。羟自由基清除率的计算公
式如下:
清除率(%)=［1－(Am －An)/A0］× 100
1.2.4 HPLC同时测定新绿原酸和异槲皮苷含量
1.2.4.1 色谱条件 色谱柱:Sepax Sapphire C18色谱
柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm) ;流动相:乙腈(A)－
0.05%磷酸水溶液(B) ，梯度洗脱(0 ～15 min，10%
A;15～50 min，30% A) ;流速:1.0 mL /min;检测波长:
330 nm;进样量:5 μL;柱温 30 ℃。
1.2.4.2 对照品溶液的制备 分别精密称取新绿原
酸、异槲皮苷对照品 9.0 mg、5.2 mg，置于 25 mL容量
瓶中，加入 50%乙醇超声溶解并定容至刻度，配制成
质量浓度为新绿原酸 0.360 mg /mL、异槲皮苷
0.208 mg /mL的混合对照品溶液。
1.2.4.3 供试品溶液的制备 辣木叶药材粉碎过 40
目筛，取约 1.0 g，精密称定，置于 20 mL容量瓶中，加
入 50%乙醇 15 mL，超声处理 30 min，放冷，加 50%
乙醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 有机系微孔滤膜
过滤，取续滤液，待用。
1.2.4.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液适量，
用 50%乙醇分别配制成含新绿原酸 0.018、0.036、
0.09、0.18、0.27、0.36 mg /mL 和异槲皮苷 0.0104、
0.0208、0.052、0.104、0.156、0.208 mg /mL 的对照品溶
液，按 1.2.4.1 项条件下进行测定。
1.2.4.5 精密度实验 取配制好的浓度分别为新绿
原酸 0.09 mg /mL、异槲皮苷 0.052 mg /mL 的混合对
照品溶液，按 1.2.4.1 项条件，连续进样 6 次，记录峰
面积值。
1.2.4.6 稳定性实验 在室温下，考察辣木叶中这两
种成分的稳定性。选取新绿原酸 0.18 mg /mL和异槲
皮苷 0.104 mg /mL 的混合对照品溶液，按 1.2.4.1 项
条件，分别于 0、4、8、12、24 h进行测定，记录峰面积。
1.2.4.7 重复性实验 取同一批辣木叶原料，按
1.2.4.3 项下方法平行制备 6 份供试品溶液，进行
HPLC分析。
1.2.4.8 加样回收率实验 取同一批已知含量的辣木
叶样品约 1.0 g，精密称定，分别精密加入一定量新绿
原酸和异槲皮苷对照品溶液，按 1.2.4.3 项下方法制备
供试品溶液，按 1.2.4.1项条件测定，计算加样回收率。
1.2.4.9 样品含量测定 制备 5 批样品溶液，平行 3
份，测定其新绿原酸和异槲皮苷的含量。
2 结果与分析
2.1 辣木叶提取物对 DPPH 自由基清除能力的
测定
根据测定结果，计算各个样品对 DPPH自由基的
清除率，结果见图 1。
326
图 1 DPPH自由基清除率折线图
Fig.1 Line charts of DPPH free radical clearance rate
由结果可知，不同样品对 DPPH 自由基的清除
能力依次为 VC ＞ LM1 ＞ LM2 ＞ EEL ＞ PEL。低浓度
时，LM1、LM2 对 DPPH 的清除率明显高于 EEL 和
PEL，随着样品浓度增加，清除率呈现增长趋势，最后
趋于稳定，逐渐接近 VC。
2.2 辣木叶提取物对羟自由基清除能力的测定
根据测定结果，计算各个样品对羟自由基的清
除率，结果见图 2。
图 2 羟自由基清除率折线图
Fig.2 Line charts of hydroxyl radical clearance rate
由结果可知，不同样品对羟自由基的清除能力
依次为 VC ＞ LM2 ＞ LM1 ＞ EEL ＞ PEL。低浓度时，
LM1 和 LM2 对羟自由基的清除率高于 VC，随着浓
度升高，LM2 清除率接近 VC。结合“2.1”实验结
果，LM1、LM2 均表现出对 DPPH和羟自由基较强的
清除能力，且二者的清除能力仅稍弱于 VC，说明这
两个部位具有较强的抗氧化活性，具有极大的研究
意义。
2.3 HPLC同时测定新绿原酸和异槲皮苷含量
2.3.1 色谱条件的选择 分别对乙腈－0.05%磷酸
水、甲醇－0.05%磷酸水等多种洗脱系统进行考查，发
现采用前者梯度洗脱时，各峰的分离度较好，保留时
间适中，基线较平稳。选择 330 nm 作为检测波长，
这是基于所测化合物在该波长处吸收相对最大，且
杂质干扰较少。色谱图见图 3。结果证明，在该色谱
条件下，样品中目标物出峰时间和对照品的出峰时
间一致，且与其他杂峰分离良好。
2.3.2 线性关系考察 以对照品溶液浓度(X)为横
坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得新绿原
酸、异槲皮苷的回归方程分别为:Y1 = 1025.3582 ×
104X1 － 39809，r1 = 0.9995;Y2 = 660.8132 × 10
4X2 －
13976，r2 = 0.9995。结果表明，新绿原酸、异槲皮苷分
图 3 混合对照品(A)和供试品(B)HPLC图
Fig.3 HPLC chromatograms of the reference
substances(A)and sample(B)
注:1:新绿原酸;2:异槲皮苷。
别在 0.018～0.36、0.0104～0.208 mg /mL与峰面积积分
值线性关系良好。
2.3.3 精密度实验 测得新绿原酸、异槲皮苷峰面
积的 ＲSD 分别为 1.29%、1.30%，表明仪器精密度
良好。
2.3.4 稳定性实验 计算新绿原酸、异槲皮苷的
ＲSD分别为 0.23%和 1.69%，表明对照品溶液在 24 h
内稳定性良好。
2.3.5 重复性实验 考察新绿原酸、异槲皮苷峰面
积 ＲSD分别为 1.4%和 1.5%，表明该方法的重复性
良好。
2.3.6 加样回收率实验 新绿原酸、异槲皮苷的平
均加样回收率分别为 98.84%、98.70%，ＲSD 分别为
2.52%、2.82%，表明上述实验方法的准确度较高。
2.3.7 样品含量测定 测定结果见表 1。
表 1 不同产地辣木叶中新绿原酸和异槲皮苷含量(n = 3)
Table 1 Content determination results of neochlorogenic acid
and isoquercitrin in Moringa oleifera Lam leaves
from different regions(n = 3)
样品编号 新绿原酸(mg /g) 异槲皮苷(mg /g)
S1 0.048 ± 0.001 0.027 ± 0.003
S2 0.035 ± 0.002 0.030 ± 0.002
S3 0.035 ± 0.001 0.031 ± 0.001
S4 0.038 ± 0.004 0.033 ± 0.002
S5 0.040 ± 0.003 0.049 ± 0.003
3 结论
实验过程中，辣木叶提取物用石油醚、乙酸乙酯
萃取后得到的水相经分离纯化，鉴定得到其中主要
化学成分为新绿原酸、隐绿原酸等奎宁酸类和异槲
皮苷、紫云英苷等黄酮类化合物，据此结果在 MCI 柱
层析过程分段收集得到总奎宁酸 LM1 和总黄酮
LM2。采用体外方法对得到的辣木叶提取物四个部
327
位进行活性评价，结果 LM1、LM2 对 DPPH 和羟自由
基的清除率大大高于 EEL、PEL，表现出较强的抗氧
化活性，仅稍弱于 VC，从而得出辣木叶抗氧化有效部
位为总奎宁酸和总黄酮，但还需对其中的抗氧化活
性单体成分继续追踪研究。
基于抗氧化实验结果，选取辣木叶中奎宁酸成
分新绿原酸和黄酮成分异槲皮苷作为质量控制指标
成分。本实验建立了 HPLC 同时测定不同产地辣木
叶中新绿原酸和异槲皮苷含量的方法，该法简便、准
确，为制定辣木叶质量标准提供参考。
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931－938.
海南推行米粉预包装销售制度
近日，海南省食品药品监管局推行米粉预包装销售制度，明确要求今年年底前，所有米粉生产企业必须执行这一制度。
该局要求，所有获得食品生产许可证的米粉生产企业，在 9 月 30 日前实施米粉预包装销售;所有米粉生产小作坊，在 12 月
30 日前实施米粉预包装销售;集体用餐食堂、旅游餐饮接待单位，要使用获证企业生产的预包装米粉，批发、零售商要销售预包
装米粉。同时，该局倡议成立米粉质量诚信联盟，鼓励符合条件的米粉生产企业和小作坊积极加入，接受公众监督。目前已有 2
家企业牵头成立了质量诚信联盟，对产品质量做出公开承诺，并率先实施米粉预包装销售。
“推行米粉预包装销售制度，不仅可以避免产品运输、销售过程中米粉受到致病微生物污染，实现产品可追溯;而且便于消
费者了解产品生产日期、保质期等信息，同时还有利于促进米粉生产企业、小作坊积极改善生产条件，提高产品质量。”海南省局
有关负责人说。
来源:慧聪食品工业网