全 文 ：[ 收稿日期] 2007-03-13
[ 基金项目] 山东省中医药科技项目(编号:2003-45)
[ 作者简介] 李秀荣(1963-),女 ,山东济南人 , 医学博士, 副主
任医师 ,主要从事血液病的临床与实验研究。
中药漏芦抽提剂逆转肿瘤多药耐药及诱导凋亡研究
李秀荣 ,焦中华 ,刘培民
(山东中医药大学附属医院 ,山东 济南 250011)
[ 关键词] 漏芦;抽提剂;逆转;肿瘤;多药耐药;细胞凋亡
[ 中图分类号] R285.5　　　　[ 文献标识码] A　　　　[ 文章编号] 1007-659X(2008)01-0074-03
　　为研究漏芦(RHU)在肿瘤治疗中的作用并探
讨其内在机制 ,验证其抑瘤和减毒增效的科学性 、有
效性 ,进行了漏芦抽提剂抑瘤 、诱导凋亡和逆转耐药
等方面的研究 ,报道如下 。
1　材料与含药血清的制备
1.1　材料
1.1.1　RHU抽提剂的制备　应用根粉碎乙醇提取
法 ,取祁州漏芦(购买济南数家药店及医院的漏芦样
品各20 g ,请中药鉴定教研室专家进行鉴定或成分
分析 ,证实为祁州漏芦后再大量购买)5 kg ,干燥粉
碎 ,用 95%的乙醇(5 kg ×8 倍量)热提 3 次 ,每次
3 h ,回收乙醇 ,70%乙醇热提 4次 ,合并 ,减压 ,浓缩
得粗提物 , 控制乙醇含漏芦生药量分别为 4 , 2 ,
0.5 g/ml三种梯度浓度的浸膏 , 4 ℃冰箱储存备用 。
1.1.2　动物　昆明种小鼠 ,雄性 ,体质量 20±2 g ,
山东中医药大学动物中心提供 。
1.1.3　瘤株　H22肝癌瘤株 ,山东省医学科学院药
物研究所提供;S180肉瘤株 ,山东中医药大学肿瘤实
验室提供 。人乳腺癌细胞耐阿霉素株(MCF-7/
ADR)和敏感细胞株 MCF-7细胞株 ,购自山东省医
学科学院基础所 。
1.1.4　药品　顺铂(DDP):济南齐鲁制药厂生产 ,
批号 0102037 ,规格为20 mg/支;环磷酰胺(CTX):
上海华联制药有限公司生产 ,批号 010211 ,规格为
200 mg/支;盐酸维拉帕米注射液(VRP):批号
980625 ,规格为5 mg/支 ,江苏连云港制药厂;盐酸
阿霉素(ADM):批号 970106 ,规格为10 mg/支 ,浙
江海正药业股份有限公司。
1.2　RHU抽提剂动物含药血清制备
取健康雄性昆明种大白鼠 , 体质量为 200 ～
240 g ,随机分成空白血清组(对照组)6 只 ,低 、中 、
高 3个剂量组各 6 只。3 个剂量组设置为 0.5 , 2 ,
4 g/ml。每鼠每天灌药 1 次 ,每次4 ml。空白组每
日给予等量生理盐水灌胃 ,于给药第 7天 ,灌药后
1 h(灌药前禁食 12 h)乙醚麻醉 ,腹主动脉无菌采
血 ,置无菌离心管离心10 min(1 500 r/min),无菌分
离血清。用0.22μm微孔滤膜过滤除菌 ,分装入小
瓶 ,每瓶 5 ～ 10 ml ,置-20 ℃冰箱保存备用。
2　方法
2.1　S180肉瘤移植瘤动物模型的建立
无菌条件下 ,取传代 1周的 S180荷瘤小鼠腹水 ,
立即置无菌离心管中 ,以无菌生理盐水按 1∶3比例
稀释成瘤细胞悬液 ,离心管外周以冰袋维持温度在
4 ℃左右 ,以此保持瘤细胞的活性。计数并调整细
胞浓度为 1×107/ml ,取20 g左右的雄性昆明种小鼠
70只 ,每鼠接种0.2 ml于右前肢腋窝皮下(含瘤细
胞数 2×106 个)。24 h后称重并随机分成 7 组 ,每
组 10只 。
2.2　H22肝癌移植瘤动物模型的建立
取传代后14 d的 H 22肝癌小鼠 ,脱颈椎处死 ,固
定于鼠板上 ,依次用碘酊 、乙醇消毒操作部位皮肤 ,
置于超净工作台中(事先以紫外线灯消毒30 min),
以无菌操作剥取肿瘤 ,选择生长良好无坏死及液化
的肿瘤组织 ,剔除纤维包膜和坏死组织 ,在无菌平皿
中剪碎 ,置组织研磨器中 ,加入少量4 ℃生理盐水轻
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第 32 卷　第 1 期
2008 年 1 月 　　　　　　　　　
山东中医药大学学报
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY OF TCM　 　　　　　　　　Vol.32 , No.1Jan.2008
DOI :10.16294/j.cnki.1007-659x.2008.01.026
轻研磨 ,过滤 ,制成瘤细胞悬液 ,调整细胞浓度为 1
×107/ml ,取昆明种小鼠 70 只 ,每鼠于右腋窝皮下
接种0.2 m l(含瘤细胞数 2 ×106 个)。接种后24 h
随机分为 7组 ,每组 10只 。
2.3　细胞培养
复苏人乳腺癌细胞系 MCF-7 、MCF-7/ADR ,分
别接种于50 ml培养瓶内 ,加入 DMEM 培养液(含
10%胎牛血清 ,青霉素 、链霉素各100 U/ml)8 ml ,置
于37 ℃、饱和湿度含 5%CO2的 CO2 细胞培养箱中
无菌培养。细胞呈贴壁生长 ,每 5 ～ 7 d传代一次 ,
实验时取对数生长期细胞进行实验 。
2.4　分组及给药剂量
动物实验中 ,中药 RHU 抽提剂的给药剂量以
生药量计算。①空白对照组:不做任何处理 ,每日灌
服0.5 ml生理盐水 ,连续10 d;②荷瘤对照组:肿瘤
接种后24 h ,每日灌服0.5 ml生理盐水 ,连续10 d;
③环磷酰胺组:50 mg/kg体质量腹腔注射 ,每天 1
次 ,连续3 d;④RHU 低剂量组:12.5 g/kg体质量 ,
每日灌服 1 次 , 连续 10 d;⑤RHU 中剂量组:
50 g/kg体质量 ,每日灌服 1 次 ,连续10 d;⑥RHU
高剂量组:100 g/kg体质量 , 每日灌服 1 次 , 连续
10 d;⑦RHU中剂量+CTX组:RHU 灌服方法及剂
量同 RHU 中剂量组 , CTX腹腔注射方法及剂量同
环磷酰胺组。 ⑧DDP 组:按1 mg/kg体质量隔日腹
腔注射0.2 ml/只 ,共 2次 。
体外细胞培养分为:①10%正常大鼠血清对照
组;②低剂量 RHU 鼠血清组:培养液中加入 10%已
制备低剂量 RHU 鼠血清;③中剂量 RHU 鼠血清
组;④高剂量 RHU 鼠血清组;⑤中剂量 RHU 鼠血
清+ADM(5 mg/ml)组;⑥ADM(5 mg/ml)组;⑦
VRP(7 mg/ml)+ADM(5 mg/ml)组 。
2.5　统计方法
计量资料均以均数±标准差表示 ,用 t 值法进
行组间差异显著性检验 ,统计方法采用 SPSS 11.0
软件进行统计。
3　结果
3.1　RHU 抽提剂的抑瘤作用
结果见表 1 ,表 2。
3.2　RHU 对机体一般生命体征的影响
检测了不同用药组荷瘤小鼠的肺体比 、肝体比 、
脾体比 、胸腺体比及用药前后的体质量变化 。结果
表明:RHU 可有效减低肿瘤对机体重要脏器的损
伤 ,保护机体免疫力 ,增加荷瘤小鼠体质量 ,其作用
与剂量具有一定关联性 ,中 、低剂量可提高实验荷瘤
动物的脾体比 、胸腺体比数值 ,增加体质量 ,而高剂
量则发挥免疫抑制作用 ,并有一定的肺 、肝损伤 。
表 1　各组对 S180肉瘤小鼠移植瘤
重量的影响(x±s , n=10)
瘤重(m/g) 抑瘤率(%)
正常对照组 　　- 　-
模型组 1.75±0.45 　-
CTX 组 0.92±0.15■■ 47.4
RHU低剂量组 1.52±0.18 13.1
RHU中剂量组 1.27±0.23■■ 27.4
RHU中剂量+CTX组 0.79±0.21■■ 54.9★
RHU高剂量组 1.46±0.16■ 16.5
　　与模型组比较■P<0.05 , ■■P<0.01;与其他用药组
比较★P<0.05
表 2　各组对 H22荷瘤小鼠瘤重和
抑瘤率的影响(x±s , n =10)
瘤重(m/ g) 抑瘤率(%)
正常对照组 　　- -
模型组 1.596±0.55 -
DDP组 0.845±0.132■■ 47.1
RHU低剂量组 1.410±0.88 11.7
RHU中剂量组 1.260±0.33 21.1
RHU中剂量+DDP 组 0.759±0.233■■ 52.4★
RHU高剂量组 1.320±0.141 17.3
　　与模型组比较■■P <0.01 , 与其他用药组比较★P <
0.05
3.3　对荷瘤小鼠生存期的影响
实验结果表明 ,临床常规剂量应用漏芦可明显
延长实验荷瘤动物的生存时间。
3.4　体外细胞培养 MTT 实验
RHU 抽提剂各剂量含药血清组 ,对人乳腺癌耐
药细胞株(MCF-7/ADR细胞系)具有较轻的杀伤作
用 ,与 ADM 合用 , 可明显增强 ADM 对 MCF-7/
ADR细胞系的杀伤作用 ,细胞死亡率 96 h平均为
ADM 的1.72倍 ,这一结果与耐药逆转剂维拉帕米作
用结果相似(ADM+VRP 组为 ADM 组的1.78倍)。
表明 RHU抽提剂含药血清与 ADM 合用 ,可明显增
强ADM 对乳腺癌耐药细胞株的杀伤作用 ,具有明
显耐药逆转作用 ,结果见表 3。
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2008 年 1月　 　　　　　　李秀荣等:中药漏芦抽提剂逆转肿瘤多药耐药及诱导凋亡研究　　　　　　　　第 32 卷第 1 期
表 3　RHU 抽提剂含药血清对MCF-7/ ADR细胞系的耐药逆转作用影响
死亡率(%)
24 h　　　 48 h　　　 72 h　　　 96 h　　　
正常大鼠血清组 0 0 0 0
低剂量含药血清组 11.0 17.6 21.9 17.4
中剂量含药血清组 10.3 12.5 17.4 15.6
高剂量含药血清组 12.8 28.2 18.5 24.5
中剂量含药血清+ADM 组 48.9 67.0 63.8 55.0
ADM 组 26.5 42.6 36.0 32.4
ADM+VRP 组 52.2 67.4 64.0 57.8
3.5　细胞凋亡率变化
结果显示:RHU 含药血清组可使 MCF-7/ADR
细胞呈现凋亡特有的亚 G1 峰 ,凋亡率与药物剂量
存在量效关系 ,随剂量增加 ,细胞凋亡率显著增加
(P <0.05或 P<0.01), RHU 含药血清与 ADM 合
用时 , 诱导肿瘤细胞凋亡作用明显增强 ,与单用
ADM 组相比有显著性差异 。结果表明:RHU 抽提
剂可诱导耐药肿瘤细胞株凋亡 ,阻断肿瘤细胞有丝
分裂 ,使其停滞于 G2-M 期 ,与化疗药合用 ,能加强
化疗药物对耐药细胞株的诱导凋亡作用。结果见表
4。
表 4　RHU含药血清对 MCF-7/ ADR细胞诱导凋亡及细胞周期的影响 %
细胞周期
G 0-G1　　　 S　　 G 2-M　　 APO
正常大鼠血清(对照组) 55.2 40.5 　　　4.3 　　　　2.5
低剂量含药血清 59.8 31.5 8.7 8.9★
中剂量含药血清 43.5 36.7 19.8 15.6★
高剂量含药血清 32.5 36.8 30.7 28.5★★
正常大鼠血清+ADM 组 58.7 32.9 8.4 9.5★
中剂量含药血清+ADM 21.6 30.8 47.6 42.8★★
　　与对照组比较 ★P <0.05 ,★★P<0.01
3.6 　对 MCF-7/ADR 细胞 P170 蛋白 、端粒酶 、
Bcl-2表达的影响
结果见 5。
表 5　对MCF-7/ADR 细胞 P170 蛋白 、端粒酶 、Bcl-2 表达率的影响 %
P170 蛋白 端粒酶 Bcl-2
非特异性抗体荧光本底染色 　　　　0.17 　　　　0.10 　　　　0.06
10%正常大鼠血清组 72.37 72.54 43.50
10%中剂量 RHU 药血清组 30.52■ 21.00■ 21.20■
20%中剂量 RHU 药血清组 2.91■ 16.75■ 7.90■
10%中剂量 RHU 药血清+ADM 组 1.46■ 8.69■ 17.30■
10%正常血清+ADM 组 32.86■ 30.36■ 22.50■
　　与正常大鼠血清组比较 ■P <0.01
4　讨论
本研究显示 ,漏芦(RHU)抽提剂体内实验具有
一定的抑瘤作用 ,与化疗药合用 ,具有协同作用 ,可
发挥明显增效 、增敏 、减毒作用 ,并可保护荷瘤鼠的
重要脏器和免疫器官 ,显著提高荷瘤鼠免疫功能 ,延
长生存时间;体外实验显示 , RHU 含药血清具有较
轻的细胞毒作用 ,主要具有逆转耐药 、诱导细胞凋亡
作用 ,其作用靶点有:①显著下调多药耐药细胞耐药
基因 P170蛋白的表达 ,抑制耐药细胞的膜转运活
性 ,减少耐药细胞对化疗药物的外排 ,提高细胞内化
疗药物浓度 ,逆转肿瘤细胞的多药耐药性;②抑制癌
基因 Bcl-2的表达 ,诱导肿瘤细胞凋亡 ,发挥逆转肿
瘤细胞多药耐药作用;③显著降低肿瘤细胞端粒酶
活性表达 ,抑制肿瘤细胞恶性增殖 ,防止其多药耐药
的产生 。
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2008 年 1 月　 　　　　　　　　　　　　　　山东中医药大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　第 32 卷第 1 期