全 文 ：书收稿日期:2012-10-08; 修订日期:2012-12-31
基金项目:国家自然科学基金( No． 30860374)
作者简介:李光星( 1978-) ，男( 朝鲜族) ，硕士学位，吉林延吉人，现任延边
大学讲师，主要从事分子肿瘤学研究工作．
* 通讯作者简介:张学武( 1973-) ，男( 汉族) ，博士学位，吉林大安人，现任
延边大学教授，主要从事肝脏生物化学与中草药开发工作．
珍珠梅提取物 TTF1 抑制肝癌细胞增殖作用的研究
李光星1，林冬岩2，张学武1*
(1．延边大学，吉林 延吉 133000; 2．中国人民解放军空军 93011 部队，吉林 延吉 133000)
摘要:目的 探讨珍珠梅提取物 TTF1 抑制肝癌细胞增殖作用的机制。方法 利用MTT细胞毒性实验检测 TTF1 对人肝癌
细胞 HepG2 和正常人永生化肝细胞 Chang － liver增殖的影响，并采用 EdU实验进行验证;通过 Western Blotting实验在蛋
白水平检测 TTF1 作用下，人肝癌细胞 HepG2 中常见的增殖指标 －野生型 p53 以及 Bcl － 2 变化情况。结果 MTT与 EdU
实验证实 TTF1 可以明显抑制人肝癌细胞 HepG2 的增殖，但对正常肝细胞 Chang － liver毒性较小，野生型 p53 可随 TTF1
作用剂量增加而表达增高，而 Bcl － 2 则随之降低。结论 TTF1 可能通过上调野生型 p53 蛋白表达，抑制 Bcl － 2 蛋白的表
达而抑制肝癌细胞增殖，对正常细胞毒性较小，可能开发为新型毒副作用较小的肝癌药物。
关键词:TTF1; 肝癌细胞; 增殖
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 04． 003
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 04-0774-02
Inhibition of HCC cells proliferation by TTF1 from extract of herbal medicine
LI Guang-xing1，LIN Dong-yan2，ZHANG Xue-wu1*
( 1． Yanbian University． Yanji 133000． China; 2． 93011 Air Force． Yanji 133000． China)
Abstract: Objective To study the mechanisms of TTF1 inhibiting the proliferation of hepatocellular carcinoma ( HCC) cells．
Methods The inhibitory rate of TTF1 on HCC cells was detected by MTT on the normal human liver cell lines，Chang － liver，and
the HCC cell line，HepG2． The effect of TTF1 on HCC cells proliferation was detected by EdU assay． And the protein expression
levels of wild type p53 and Bcl － 2 were examined by western blot． Ｒesults The MTT and EdU data showed that TTF1 inhibited
HCC cell line HepG2 proliferation． Western blot analysis showed that TTF1 treatment led to decreased protein expression of bcl －
2 and an increase in wild type p53． Conclusion These results together suggested that TTF1 may induce proliferation of HepG － 2
cells through a complex pathway．
Key words: TTFl; HCC cells; Proliferation
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的消化
系统肿瘤之一。在世界范围内，其发病率排癌症发病率的第 5
位，其死亡率排癌症死亡率的第 3 位［1］。几十年来虽然早期诊断
和治疗措施得以改善，但未能有效减少肝细胞癌的死亡率。因
此，研发安全有效的新型抗癌药物对于提高肿瘤的治疗水平具有
重要意义。
化学名称为 5，2 ＇，4，－三羟基 － 6，7，5 ＇ －三甲氧基黄酮的
TTFl是本研究组近年来一直关注的单体化合物，该化合物是从
生长在长白山的珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)中分离得到［2］。珍珠
梅属蔷薇科植物，广泛分布于云南、贵州、四川、甘肃、宁夏及东北
地区，其药用价值早已得到重视，主要见于活血化瘀及消肿止痛
之功效，可以治疗骨折及跌打损伤［3］。TTF1 是珍珠梅提取物中
主要的有效成分，其抗肿瘤作用近年来被发现并报道，本实验室
成功建立了人肝癌 HepG2 裸鼠移植瘤模型，并利用该模型证实
TTFl通过调控 EＲK 信号转导通路抑制肝癌细胞生长的作用机
制［4］，前期研究亦证实 TTF1 可能通过线粒体途径对人肝癌细胞
凋亡有明显促进作用［5］，本研究将利用人肝癌细胞系 HepG2 为
对象，进一步研究 TTFl对肝细胞癌的作用及机制。
1 材料
人正常永生化肝细胞 Chang － liver 以及肝癌细胞系 HepG2
细胞购自北京协和大学细胞中心。主要试剂:珍珠梅提取物
(TTF1)由延边大学药学院惠赠;ＲPMI1640 培养基和新生牛血清
FBS购自美国 Gibco 公司．细胞培养瓶，96 孔板购等自美国 Cor-
ning公司;荧光二抗及 DAPI 购于美国 Invitrogen 公司，MTT 细胞
增殖与毒性试剂盒与阿霉素(ADＲ)等均购于北京世纪康维公
司。EdU试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司，野生型 p53，
Bcl － 2，β － actin抗体以及二抗均选用中国中山金桥公司产品。
2 方法
2． 1 细胞培养 人正常永生化肝细胞 Chang － liver 以及肝癌细
胞系 HepG2 细胞用含 10%胎牛血清的 ＲPMI1640(含 20 mmol /L
Hepes，100 Μ /ml 青霉素 /链霉素)。方法采用贴壁细胞传代的常
规方法，倒置显微镜观察，2 ～ 3 d传代 1 次。
2． 2 取对数生长期的正常永生化肝细胞 Chang － liver 以及
HepG2 细胞制为细胞悬液，以每孔 1 000 ～ 10 000 个细胞接种到
96 孔板，每孔体积 100 μl。分为阴性对照组、5 μmol /L 阿霉素
(Adriamycin，ADＲ)处理阳性对照组，TTF1 药物处理组，药物终浓
度为 100 μmol /L。每组设 5 个平行孔。药物作用细胞后 24，48，
72 h后，每孔加 20 μl MTT溶液;继续孵育 4 h，终止培养，小心吸
弃孔内培养上清液，每孔加 150 μl DMSO，振荡 10 min，选择 490
nm波长，在全波段酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时
间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长柱状图。
2． 3 EdU 荧光显微镜检测细胞增殖 取处于对数生长期的
HepG2细胞，以每孔 4 × 103 ～ 1 × 105 细胞接种于 24 孔板中，在培
养箱中培养至合适阶段;设对照组和 TTF1 处理组，阴性对照组加
入 DMSO，TTF1处理组加入终浓度为 100 μmol /L的药物，作用 48
h后，按照 EdU试剂盒(广州锐博公司)说明书进行荧光染色操作，
染色完成后，利用奥林巴斯荧光显微镜(BX53)采集图像。
2． 4 Western blot 检测蛋白变化 铺于 6 孔板内的 HepG2 细胞生
长至 60%左右时进行药物预处理。分为阴性对照组;100 μmol /L
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 4 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 4
书及 200 μmol /L TTF1 药物处理组;5 μmol /L阿霉素(ADＲ)处理阳
性对照组。药物作用细胞后 72 h 后，用加入 1 /100 蛋白酶抑制
剂的 ＲIPA裂解液(北京世纪康维)裂解，抽提总蛋白，定量后用
于 Western blotting实验。一抗野生型 p53，Bcl － 2，β － actin 抗体
以及二抗均选用中国中山金桥公司产品，采用 SDS －聚丙烯酰胺
凝胶电泳法，ECL显色试剂盒曝光显色。
2． 5 统计学分析 应用 SPSS 13． 0 统计软件进行分析，统计学意
义采用 珋x ± s表示，分析方法采用 student － t检验。P ＜ 0． 05 为有
差异性，P ＜ 0． 01 为有显著差异性。
3 结果
3． 1 TTF1 抑制肝癌细胞增殖能力，对正常肝细胞毒性作用较小
我们利用 MTT细胞毒性实验检测了 TTF1 对肝癌细胞系 HepG2
和正常肝细胞 Chang － liver细胞生长的影响。结果显示，在给药
72 h后，应用 TTF1 处理后可显著抑制肝癌细胞 HepG2 的生长
(与阴性对照组比较，P ＜ 0． 05) ;在正常人永生化肝细胞 Chang －
liver细胞组中，药物处理 72 h 后，TTF1 对正常肝细胞没有明显
毒性作用(与阴性对照组相比，未发现统计学意义) ，而与阿霉素
处理的阳性对照组相比，TTF1 对正常肝细胞的细胞毒性明显小
于 ADＲ组(P ＜ 0． 05)。结果见图 1。
图 1 MTT实验检测 TTF1 对 HpeG2 及 Chang － liver细胞系增殖的影响
EdU增殖检测实验的原理与 Brdu检测增殖的原理相似，EdU
会在 DNA复制时插入到增殖细胞的 DNA 中。因此，EdU 阳性细
胞的比率越高，说明细胞的增殖能力越强。EdU细胞增殖检测结
果显示，应用 TTF1处理后，肝癌细胞系 HepG2中 EdU阳性的细胞
的比例明显减少。结果见图 2。说明 TTF1 可显著抑制肝癌细胞
系的增殖能力，与MTT结果相符。以上实验结果进一步证明 TTF1
具有抑制肝癌生长的作用，且对正常肝细胞毒性较小。
图 2 EdU实验检测 TTF1 对 HepG2 细胞系增殖的影响
3． 2 TTF1 抑制肝癌细胞增殖能力与 p53 及 Bcl － 2 蛋白相关 为
了进一步研究 TTFl抑制肝癌细胞增殖的分子作用机制，采用免
疫印迹分析方法检测阴性对照组 HepG2 细胞、阿霉素组及 TTFl
200 剂量组的野生型 p53 以及 Bcl － 2 蛋白表达水平。免疫印迹
分析结果示:各组野生型 p53 蛋白表达随着 TTFl 剂量的增高而
增加，而抑制凋亡的基因 Bcl － 2 表达随 TTF1 剂量增高而降低。
结果见图 3。
图 3 Western blotting实验检测 TTF1 作用后
主要增殖指标的蛋白水平变化
4 讨论
肿瘤是一种细胞的异常增生，癌细胞无休止和无序地分裂，
表现为肿瘤生长的高增殖性，并可因此由原发部位向它处扩散，
侵犯要害器官并引起衰竭，最后导致患者死亡。
肝细胞癌的高增殖能力与其它恶性肿瘤一样是多基因、多因
子及多步骤共同作用的结果［6］。近年来我们所关注的珍珠梅提
取物 TTF1 已被证明具有一定的抗肿瘤作用，本实验选用细胞系
HepG2 和正常永生化肝细胞 Chang － liver 细胞作为研究对象，利
用 MTT的方法检测了 TTF1 对正常肝细胞以及肝癌细胞增殖作
用的影响，结果发现随着 TTF1 剂量的增加，肝癌细胞 HepG2 增
殖能力明显减弱，EdU实验也得到相同结果。而 MTT实验发现，
TTF1 的作用对正常肝细胞 Chang － liver 没有明显的细胞毒性作
用。这一结果提示，TTF1 作为一种中药提取物，具有安全可靠的
抗肝癌增殖作用。
为了进一步研究 TTF1 抑制肝癌细胞增殖的作用机制，我们
利用免疫印记法检测了细胞增殖和凋亡的相关蛋白:野生型 p53
以及 Bcl － 2 蛋白。p53 基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高
的基因，野生型 p53 以四聚体形式与特异位点结合，反式激活下
游生长抑制基因的表达，起到抑制肿瘤增殖的作用。而 Bcl － 2
可阻止凋亡形成因子如细胞色素 C 等从线粒体释放出来，具有
促进肿瘤细胞增殖，抗凋亡作用，p53 可以下调 Bcl － 2 的表达完
成抑制细胞增殖，促进细胞凋亡作用［7］。本实验中发现，随着
TTF1 作用剂量增加，肝癌细胞 HepG2 中，野生型 p53 蛋白表达明
显升高，而 Bcl － 2 表达则受到抑制，提示 TTF1 抑制肿瘤细胞增
殖的作用可能通过 p53 途径完成。前期实验中已证明 TTF1 可以
抑制肿瘤血管生成，促进细胞凋亡的结果［5，8］，本实验进一步揭
示珍珠梅提取物 TTF1 在治疗肝细胞癌等消化系统肿瘤方面具
有广阔的应用前景，但其作用机制尚待进一步研究。
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