全 文 ：苏州大学学报(医学版)2012;32(1) 81
收稿日期:2011 － 03 － 20 作者简介:陆 叶(1974 －) ，女，黑龙江林甸人，讲师，农学博士，研究方向为中药质量标准。
高效液相色谱法测定秋鼠麴草中总黄酮的含量
陆 叶1，陈 桢2，肖 旭1，刘春宇1
(1．苏州大学医学部药学院 中药鉴定研究室，江苏苏州 215123;2．苏州市常熟食品药品监督管理局，江苏
苏州 215500)
摘要:目的 建立秋鼠麴草提取物中总黄酮含量高效液相色谱的测定方法。方法 选择乙醇浓度、料液比和
提取时间这 3 个因素进行正交试验，初步优选出常规热回流法提取总黄酮的最佳工艺。色谱柱为 HypersilODS2 C18
柱(250 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;流动相为甲醇∶水 = 33∶ 67;紫外检测波长为 359 nm ;流速 1． 0 ml /min;柱温 35℃;以
芦丁为对照计算总黄酮含量;进样量 10 μl。结果 最优的总黄酮提取条件为:60%乙醇溶液、料液比为 1∶ 35、提取
时间为 60 min。芦丁在 0． 013 2 ～ 0． 105 6 mg /ml 范围内线性良好，样品平均回收率为 98． 98%，相对标准偏差
(RSD)为 1． 86%。结论 利用高效液相色谱法测定秋鼠麴草热回流提取物中总黄酮含量的方法回收率高、精密度
好、重复性好，能为药材鼠麴草的质量评价和控制提供可行方法。
关键词:秋鼠麴草;芦丁;高效液相色谱法;总黄酮;含量测定
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1673 － 0399(2012)01 － 0081 － 03
Determination of the total flavonoid of Gnaphalium affine D． Don by
high-performance liquid chromatography
LU Ye1，CHEN Zhen2，XIAO Xu1，LIU Chun-yu1
(1． Dept of Authentication of Traditional Chinese Medicines，School of Pharmaceutical Science，Meclical Col-
lege，Soochow University，Jiangsu Suzhou 215123，China;2． Suzhou Changshu Food and Drug Administration，
Jiangsu Suzhou 215500，China)
Abstract:Objective To develop a high-performance liquid chromatography (HPLC)method for
determination of the amount of total flavonoid from Gnaphalium hypoleucum DC． Methods The prelimi-
nary optimum extracting conditions of total flavonoid were investigated by using orthogonal experimental
design． The experimental factor，such as the percentage of ethanol，the ratio of material to liquid，time of
the ethanol refluxing technology was studied． HypersilODS2 C18(250 mm × 4． 6 mm，μm)column of
(HPLC)was adopted in the flavonoid determination． The MEOH-water (33 ∶ 67)was used as mobile
phase． The flow rate was 1． 0 ml /min． The temperature of HypersilODS2 C18 was 35℃ ． The detective
wavelength was 359 nm． The concentration of Rutin was used as control and the injection volume was
10μL． Results The optimal extracting conditions were as follows:60% ethanol solution，the ratio of
material to liquid was 1∶ 35;the extracting time was 60 min． Rutin in 0． 0132 － 0． 1056mg /ml range was
obtained good linearity． The average recovery was 98． 98% with the RSD of 1． 86% ． Conclusion It was
found that HPLC method could be used for determination the concentration of total flavonoid of hot reflux
extraction of Gnaphalium hypoleucum DC． This method proved to be high recovery，good precision and
good repeatability providing a feasible means for quality evaluation and control of Herb Gnaphalii．
82 JOURNAL OF SOOCHOW UNIVERSITY MEDICAL SCIENCE EDITION 2012;32(1)
Key words:Gnaphalium hypoleucum DC． ;Rutin;high-performance liquid chromatography;total
flavonoids;determination content
药材鼠麴草(Herb Gnaphalii)为菊科鼠麴草属
植物鼠麴草 Gnaphalium affine D． Don 的干燥全草，
具有止咳化痰﹑平喘﹑降血压﹑祛风湿等功效［1］。
鼠麴草属植物有 20 种之多［2］，市场上作为药材鼠麴
草流通的来源种类比较混乱，常见的有鼠麴草和秋
鼠麴草混合。市场上流通的药材鼠麴草也有与其
他药材如白头翁［3］、萎陵菜［4］、火绒草等混售的现
象。为了控制药材鼠麴草的质量并制定相关的质
量标准，因此有必要对秋鼠麴草中黄酮类化合物的
含量进行测定。中药大辞典中记载“鼠麴草全草含
5%黄酮类化合物”。黄酮类化合物具有抗氧化、抗
炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝作用，及保护心脑血
管系统和抗病毒等广泛的生理活性［5，6］。鼠麴草中
黄酮类化合物的微波辅助提取研究和超声波研究
已有报道，多采用紫外分光光度法测定总黄酮含
量［7，8］，而通过高效液相色谱法测定鼠麴草总黄酮
含量的方法尚未见报道。本研究以热回流法提取，
采用高效液相色谱法测定，从而为该药材的质量控
制提供可行的实验方法。
1 材料与方法
1． 1 材料
芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号
100080 － 200707，供含量测定用) ;槲皮素对照品
(中国药品生物制品检定所，批号 100090 － 200704，
供含量测定用) ;药材鼠麴草购自安徽亳州药材市
场，经苏州大学药学院刘春宇老师鉴定为秋鼠麴草
(Gnaphalium hypoleucum DC．)。
1． 2 方法
!$! 色谱条件 色谱柱为 HypersilODS2 C18(250
mm ×4． 6 mm，5 μm) ;流动相为甲醇∶水 = 33∶ 67;
流速 1． 0 ml /min;柱温 35℃;进样量 10 μl。
!$$ 检测波长的确定 精密量取芦丁对照品溶液
(0． 528mg /ml)1ml，置于 25ml 的容量瓶中，加甲醇
并稀释至刻度，即得(0． 021 12 mg /ml)。同时精密
称取样品 0． 1 g，置三角烧瓶中，加甲醇 50 ml，加塞
冷浸 2 h，将滤液过滤至 50 ml 容量瓶中，用甲醇定
容。在 200 ～ 400nm范围内观察紫外吸收。
!$# 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品
13． 2 mg，置于 25 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释
至刻度，摇匀(0． 528 mg /ml) ，备用。
!$+ 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液
(0． 528mg /ml)1． 25、1． 67、2． 5、5 、10 ml，分别置于
50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制
得浓度为 0． 013 2、0． 017 6、0． 026 4、0． 052 8、0． 105
6 mg /ml的芦丁对照品溶液。按上述色谱条件分别
进样 10 μl，测定峰面积。以峰面积积分值(y)为纵
坐标，浓度(x)为横坐标绘制标准曲线。
!$/ 精密度试验 精密量取芦丁对照品溶液
(0． 528mg /ml)1 ml，置于 10 ml容量瓶中，加甲醇稀
释至刻度。即得芦丁对照品溶液(0． 052 8 mg /ml) ，
按上述色谱条件进样 10 μl，连续重复进样 5 次，测
定峰面积。
!$P 重复性试验 取同一批鼠麴草粉末，准确称
取 10 g，置入圆底烧瓶，按 1． 2． 9 方法制备 5 份供试
品溶液，按上述方法测定总黄酮的含量，进样 10 μl。
!$> 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在 0、
1、2、4、6、8 h进样 10 μl，测定峰面积。
!$Q 加样回收率试验 准确称取 5 份已知含量的
鼠麴草粉末 10 g，置于圆底烧瓶中，精密加入芦丁对
照品溶液(0． 528mg /ml)7． 5 ml，按 1． 2． 9 方法制备
供试品溶液，进样 10 μl，分别测定峰面积，计算加样
回收率。
!$R 供试品溶液的制备 取鼠麴草药材粉末 10
g，按表 1 提取，冷却提取液，抽虑，用适量石油醚萃
取，在 60 ～ 70℃条件下旋转蒸发至稠膏状，置于蒸
发皿中，真空烘干至粉末状，甲醇溶解过滤至 100 ml
容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，用 0． 45 μm 微孔滤
膜过滤，吸取滤液 10 μl进样。
表 1 热回流法因素和水平表 L9(3
4)
Tab 1 Factor and level table L9(3
4)of hot reflux method
Factor
Level
A(concentration
of ethanol)
B(ratio of material
to liquid)
C(reflux
time，min)
D
(empty)
1 20% 1∶ 15 60
2 40% 1∶ 25 90
3 60% 1∶ 35 120
苏州大学学报(医学版)2012;32(1) 83
!$!, 样品含量的测定 准确称取 3 份鼠麴草粉
末 10 g，按 1． 2． 9 方法制备样品，在 2． 1 项色谱条件
下用芦丁对照品溶液 10 μl为外标，计算样品含量。
2 结果
2． 1 检测波长的确定
对照品及样品的紫外吸收图谱表明，对照品和
样品溶液在 359 nm处有最大吸收峰，故确定检测波
长为 359 nm。
2． 2 正交试验结果及极差分析
正交试验结果见表 2。表 2 中 K1、K2、K3 分别
为四因素 1、2、3 水平芦丁含量的和。极差(R)则为
K1 /3、K2 /3、K3 /3 中最大值与最小值的差。根据极
差分析可知，3 个因素对提取效果的影响大小为 A
＞ B ＞ C，即:乙醇浓度 ＞料液比 ＞回流时间，提取工
艺的最佳条件为 A3B3C1，即:乙醇浓度为 60%，料液
比为 1∶ 35(g /ml) ，回流时间为 60 min。方差分析结
果表明，乙醇浓度这一因素对含量的测定影响最大。
表 2 正交试验数据分析
Tab 2 Data analysis of orthogonal test
No．
Factor
A B C D
Rutin
content
(mg /10g)
1 1 1 1 1 0． 896 4
2 1 2 2 2 0． 711 5
3 1 3 3 3 0． 949 4
4 2 1 2 3 2． 910 4
5 2 2 3 1 2． 413 9
6 2 3 1 2 3． 045 2
7 3 1 3 2 3． 857 2
8 3 2 1 3 3． 733 4
9 3 3 2 1 3． 954 9
K1 2． 557 3 7． 664 0 7． 675 0 7． 265 2
K2 8． 369 5 6． 858 8 7． 576 8 7． 613 9
K3 11． 545 5 7． 949 5 7． 220 5 7． 593 2
R 2． 996 1 0． 363 6 0． 151 5 0． 116 3
2． 3 线性关系考察
芦丁对照品浓度为 0． 013 2、0． 017 6、0． 024 6、
0． 052 8、0． 105 6 mg /ml时对应的峰面积分别为 170
546、213 453、334 074、651 411、1 301 275。结果表
明，芦丁对照品的检测浓度在 0． 013 2 ～ 0． 105 6
mg /ml 的范围内与峰面积积分值成良好的线性
关系。
2． 4 精密度试验
结果峰面积相对标准偏差(RSD)为 1． 34% ，表
明精密度良好。
2． 5 重复性试验
结果 RSD为 2． 27%(n = 5) ，表明方法重现性
良好。
2． 6 稳定性试验
结果 RSD为 2． 24(n = 6) ，表明供试品溶液在 8
h内稳定。
2． 7 加样回收率试验
结果 RSD为 1． 86%，表明样品加样回收率高。
2． 8 样品含量测定
3 批样品含量测定的结果分别为 0． 0392%、
0． 0373%和 0． 0375%，平均含量为 0． 038%，RSD为
2． 74%(图 1)。
3 讨论
芦丁对照品的甲醇溶液(0． 021 12 mg /ml) ，经
紫外分光光度计在 200 ～ 400 nm 范围内扫描，发现
在 257 nm 和 359 nm 处有两个最大吸收峰，由于
257 nm处杂质峰较大，而 359 nm处则较小，且易于
分离，故选 359 nm作为检测波长。
以前的研究分离黄酮类化合物时使用的流动
相大多采用 0． 4%的磷酸，但磷酸影响色谱柱的稳
定性。为延长色谱柱的使用寿命，本研究中流动相
不采用磷酸，而适当增加流动相中甲醇的比例，可
使色谱峰尖锐、拖尾减少、分析时间缩短，并可保证
一定的分离度。
秋鼠麴草中主要含有黄酮类化合物，目前已报
道的鼠麴草中总黄酮含量测定方法仅有紫外分光
光度法，未见用高效液相色谱法测定秋鼠麴草中总
黄酮含量的报道。但高效液相色谱法已经被广泛
应用于生药中总黄酮类含量测定，一般以芦丁或槲
皮素为指标来计算总黄酮含量［9］。本研究借鉴文
献［10］的色谱条件，但测定结果中总黄酮含量较
低。一方面因为提取工艺不够完善，如回流提取只
提取 1 次、乙醇浓度仅取 3 种，因此有待建立更加完
善的提取工艺;另一方面，可能与高效液相色谱法
对总黄酮的响应程度高［11］有关。
(下转第 133 页)
苏州大学学报(医学版)2012;32(1) 133
皮质癌:多有包膜，边缘不规则，CT 增强扫描周边可增强而
中央因出血、坏死而极少增强，肿瘤内出血、坏死、钙化多见。
总之，肾上腺海绵状血管瘤临床罕见，影像学表现以 CT平
扫病灶内可见斑点状钙化，CT或MRI增强时以向心性强化为其
特点，临床上，应结合病史、体检及实验室检查，综合考虑诊断本
病，而对异位肾上腺海绵状血管瘤的诊断则更难，对其确诊要依
靠病理学检查。对较大的肾上腺海绵状血管瘤，其发生出血、坏
死、血栓的风险明显增大，应及早手术治疗，以防肿瘤发生致命
性出血。Heis等［5］认为对直径 ＞3 cm的肾上腺海绵状血管瘤
采取手术切除时，发生出血、血栓的危险性增大。对于偶然发现
的小的无症状肾上腺海绵状血管瘤，可以行保守治疗。
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［责任编辑:陈林华
檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷檷
］
(上接第 83 页)
图 1 对照品芦丁和样品 9 的 HPLC色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of Rutin and sample 9
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［责任编辑:倪 青］