全 文 ：收稿日期:2011-04-25; 修订日期:2011-11-02
基金项目:河北省自然科学基金(No． 08B032) ;
河北省留学回国人员科技活动项目(No． 200602) ;
河北省卫生厅科研基金(No． 08053)
作者简介:张嫚丽 (1978-) ，女(汉族) ，黑龙江五常人，现任河北医科大学
讲师，博士学位，主要从事天然药物活性成分研究工作．
* 通讯作者简介:史清文(1964-) ，男(汉族) ，河北沧州人，现任河北医科
大学教授，博士生导师，博士学位，主要从事天然药物活性成分研究工作．
异土木香内酯在不同血浆中蛋白结合率的 HPLC测定
张嫚丽1，王 进2，霍长虹1，李力更1，王于方1，史清文1*
(1．河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017;
2．河北医科大学附属第二医院，河北 石家庄 050070)
摘要:目的 应用平衡透析法测定异土木香内酯的蛋白结合率。方法 采用 HPLC法测定异土木香内酯在大鼠血浆、人血
浆和牛血清白蛋白(BSA)中的总浓度及游离药物浓度，并分别计算蛋白结合率。结果 结果表明体外异土木香内酯与大
鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白(BSA)的蛋白结合率均较高。结论 异土木香内酯与血浆蛋白具有较强的结合，临床上
与其它药物配伍应用时需注意交互影响。
关键词:异土木香内酯; 蛋白结合率; 高效液相色谱
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 04． 038
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)04-0875-02
Determination of Protein Binding Rate of Isoalantolactone by HPLC
ZHANG Man-li1，WANG Jin2，HUO Chang-hong1，LI Li-geng1，WANG Yu-fang1，SHI Qing-wen1*
(1． School of Pharmacological Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;2． Affiliated
Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050070，China)
Abstract:Objective To determine the protein binding rate of isoalantolactone by the method of equilibrium dialysis．
Methods An HPLC method was carried out to determine the protein binding rate of isoalantolactone in rat plasma，human plasma
and bovine serum albumin (BSA)． Results The protein binding rate of isoalantolactone with the three mediums was high in vitro．
Conclusion Isoalantolactone has strong combination with plasma protein，and its interaction effects should be paid attention to
when combined with other drugs in clinical use．
Key words:Isoalantolactone; Protein binding rate; HPLC
土木香为菊科旋覆花属植物土木香 Inula helenium L．，别名
祁木香，主产于河北安国，此外浙江、四川、河南、山西、陕西、甘肃
及新疆等地亦产，功效健脾和胃、调气解郁、止痛安胎，用于胸肋、
脘腹胀痛、呕吐泻痢、胸肋挫伤、岔气作痛、胎动不安等［1］。异土
木香内酯(Isoalantolactone，1)是土木香中主要化学成分［2］，是
《中国药典》2005 年版一部中土木香药材的定性、定量指标性成
分之一。现代药理学研究表明异土木香内酯具有较强的抗阿米
巴原虫、阴道毛滴虫作用［3］。本课题组还对异土木香内酯的抗
肿瘤活性进行研究:异土木香内酯对人非小细胞肺肿瘤细胞
(A549 、RERF － LC － jk 、QG －56)的增殖抑制作用强于顺铂，对
人小细胞肺肿瘤细胞(PC － 6 和 Q G －90)的增殖抑制作用与顺
铂相同［4］，因此具有开发为抗肿瘤药物的潜力。本研究采用
HPLC法测定 1 在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白(BSA)中的
蛋白结合率，为 1 的药物动力学研究提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 1200 型高效液相色谱仪(G1322A 型脱气机，G1311A
型四元泵，G1329A 型自动进样器，G1316A 型柱温箱) ，G1314B
型紫外检测器(Agilent 公司) ;Chem Office 色谱工作站。MTN －
2800D型氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。XW
－80C涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)。
异土木香内酯对照品(自制，纯度 ＞ 98%) ，人血浆(河北省
血液中心提供，批号 005010704008430) ，大鼠血浆(自制) ，BSA
(北京元亨圣马生物技术研究所，批号 060618)。乙腈为色谱纯，
其它试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2． 1 溶液配制
对照品溶液:取对照品 11． 88 mg，精密称定，置 10 ml 量瓶
中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得对照品贮备液。精密量取适量，
用甲醇稀释，分别得浓度为 0． 792，0． 396 mg /ml的对照品溶液。
BSA溶液:精密称取 BSA适量，加水溶解，制成 40 mg /ml 的
溶液，置于 4 ℃冰箱中备用。
样品制备:分别精密量取上述对照品溶液和贮备液各 90 μl，
置离心管中，用氮气流吹干，分别加入空白血浆或 BSA 溶液 1
ml，涡旋 45 s，即得 1 浓度分别为 35． 6，71． 2，106． 8 g /ml 的血浆
(或 BSA)样品。
2． 2 样品处理 采用平衡透析法，取透析平衡后的袋内血浆和袋
外透析液(PBS，pH 7． 4 的磷酸盐缓冲液，内含 0． 15 mol /L 氯化
钠)200 μl，置 1． 5 ml离心管中，加入甲醇 400 μl沉淀蛋白，涡旋
30 s，离心(2 000 × g)10 min，取上清液进样分析。分别测定袋内
血药浓度(即总浓度 Dt)及袋外 PBS 中的药物浓度(即游离浓度
Df) ，计算血浆蛋白结合率［Fb =(Dt － Df)/Dt × 100%］。
2． 3 色谱条件和系统适用性实验 色谱柱:Dikma Diamonsil C18
柱(4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相:乙腈 － 0． 05%磷酸(70∶
30) ;流速:1 ml /min;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃;进样量:20
μl。
在上述色谱条件下，1 峰形良好且无干扰，保留时间约为 6． 7
min。理论板数按 1 峰计不低于 3 000。色谱图见图 1。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 4 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 4 期
a －空白鼠血浆，b － 1 的鼠血浆样品，c －空白 PBS，d － 1 的透析袋外样品
图 1 1 在鼠血浆和 PBS中的色谱图
2． 4 标准曲线的绘制 精密量取 1 对照品储备液适量，加至不同
的血浆中，照“2． 1”项下方法制成含 1 为 1． 86，3． 71，7． 43，
14． 85，29． 70，59． 40，118． 8 μg /ml 的系列浓度溶液，摇匀后照
“2． 2”项下方法处理，分别进样测定。以 1 浓度 C 为横坐标，峰
面积 A为纵坐标，进行线性回归。回归方程见表 1。结果表明在
不同的血浆中，1 均在 1． 86 ～ 118． 8 μg /ml 浓度范围内线性关系
良好。
另配制浓度分别为 0． 186，0． 371，0． 743，1． 485，2． 970，
5． 940，11． 88 μg /ml的系列浓度 1 对照品溶液，各取 400 μl，分别
加入 PBS 200 μl，同上操作，绘制 1 在磷酸盐缓冲溶液中的标准
曲线。结果 PBS中，1 在 0． 186 ～ 11． 88 μg /ml浓度范围内线性关
系良好。
表 1 1 在不同介质中的回归方程、相关系数及线性范围(珋x ± s)
介质 回归方程 r 线性范围 /μg·ml －1
大鼠血浆 A = 12． 71C － 6． 37 0． 999 5 1． 86 ～ 118． 80
人血浆 A = 14． 69C － 6． 36 0． 999 1 1． 86 ～ 118． 80
BSA A = 12． 25C － 9． 29 0． 999 4 1． 86 ～ 118． 80
PBS A = 70． 02C + 1． 41 0． 999 8 0． 186 ～ 11． 88
2． 5 稳定性实验 照“2． 1”项下方法制备低、中、高(35． 6，71． 2，
106． 8 g /ml)3 种浓度的人血浆样品，于 25℃和 37℃放置 3，6，9，
12，24 h时测定，相应峰面积代入随行标准曲线，计算 1 在人血浆
中的浓度。结果在 25 ℃和 37℃两种温度下 3 种浓度血样的 RSD
分别为 25℃(2． 34%，2． 92%，5． 42%) ;37 ℃(2． 60%，2． 46%，2．
17%) ，结果表明，1 在上述温度下于 24 h内基本稳定。
2． 6 回收率与精密度实验 在各血浆及 PBS 中分别加入 1 对照
品溶液，制成低、中、高浓度(血浆中为 17． 80，35． 60 和 53． 46 μg /
ml，PBS中为 1． 78，3． 56，5． 35 μg /ml)的溶液，照“2． 2”项下方法
处理后进样，以标准曲线法计算 1 浓度，求得回收率。结果见
表 2。精密度结果见表 3。
表 2 不同介质中 1 的回收率(珋x ± s)
介质
回收率(%)
高浓度 中浓度 低浓度
大鼠血浆 107． 9 ± 4． 2 101． 5 ± 12． 9 87． 83 ± 5． 6
人血浆 105． 8 ± 10． 6 100． 1 ± 7． 4 97． 96 ± 11． 5
BSA 104． 9 ± 5． 7 113． 5 ± 8． 3 100． 1 ± 4． 3
PBS 108． 3 ± 3． 4 94． 81 ± 5． 1 99． 45 ± 9． 5
n = 6
表 3 不同介质中 1 的精密度(珋x ± s)
介质 高浓度 中浓度 低浓度
大鼠血浆 5． 08 3． 98 7． 69
人血浆 3． 69 5． 95 13． 56
BSA 3． 45 7． 42 4． 32
PBS 5． 34 3． 81 9． 74
n = 6
2． 7 血浆蛋白结合率的测定
2． 7． 1 试验方法 采用平衡透析法，将各浓度含药血浆(含 1
106． 8，71． 2，35． 6 μg /ml)0． 5 ml加入透析袋，置含 PBS 2． 5 ml的
5 ml离心管中，37 ℃透析至平衡后，用三氯醋酸试剂检查袋外透
析液有无蛋白质漏出。取透析袋两侧的介质，照“2． 2”项下方法
处理进样，以峰面积代入相应标准曲线，计算两种介质中的药物
浓度。
另取 12 份含药血浆，同上操作，其中 6 份有透析袋，袋内初
始药物浓度为 106． 8 μg /ml，袋内以 PBS 0． 5 ml代替血浆作为空
白对照;另外 6 份无透析袋，将等量药物直接加至 PBS 2． 5 ml中，
以考察药物与半透膜的结合情况。
另取 6 份含药血浆，袋内加入不含 1 的 PBS 0． 5 ml，并与空
白 PBS的色谱图比较，考察透析袋上吸附的杂质是否影响测定。
结果显示药物与半透膜的结合可忽略不计，透析袋的溶解杂
质对测定无影响。
2． 7． 2 透析平衡时间的确定 将含 1 的 71． 2 μg /ml的 PBS溶液
0． 5 ml加入透析袋(4 份 × 5 组)中对 PBS透析，分别于 3，6，9，12
及 24 h于透析袋两侧分别取样，照“2． 2”项下方法处理并测定，
不同时间的血浆蛋白结合率分别为(59． 76 ± 8． 5)%，(87． 29 ±
7． 4)%，(88． 56 ± 7． 0)%，(85． 47 ± 6． 8)%和(86． 48 ± 9． 5)%。
采用 SPSS统计软件中的 ANOVA 程序进行分析，根据试验数据
和统计分析结果确定平衡时间。P 值检验发现 6 h 与 9 h、12 h
均无显著性差异，说明 6 h时透析已达平衡。
2． 7． 3 蛋白结合率 透析平衡后分别测定袋内血浆药物浓度(总
浓度 Dt，g /ml)及袋外缓冲液药物浓度(游离药物浓度 Df，g /ml) ，
根据公式计算不同药物浓度下不同种属的血浆蛋白结合率
(Fb)。结果见表 4。数据显示 1 在各血浆的蛋白结合率均极高，
提示 1 的药物动力学研究达峰时间可能较长。同服其他药物时，
应注意药物间与血浆蛋白的竞争性结合，设计给药方案时，需测
定药物与血浆蛋白的结合率。
表 4 1 在不同种属血浆中的蛋白结合率(珋x ± s)
介质
蛋白结合率(%)
106． 8 μg·ml －1 71． 2 μg·ml －1 35． 6 μg·ml －1
大鼠血浆 96． 97 ± 8． 6 97． 59 ± 8． 3 98． 82 ± 6． 8
人血浆 97． 62 ± 2． 5 97． 15 ± 7． 3 99． 67 ± 6． 0
BSA 98． 46 ± 5． 4 98． 53 ± 6． 1 98． 54 ± 11． 8
n = 6
3 讨论
试验中比较了不同流动相(甲醇 － 水、乙腈 － 水、乙腈 －
0． 05%磷酸、乙腈 － 0． 05% 甲酸等)及不同柱温(30℃，35℃，
40℃)对测定结果的影响，考虑到 1 为倍半萜类成分，脂溶性较
强，因此采用乙腈 － 0． 05%磷酸(70∶ 30)作为流动相，分离效果
较好，且可显著缩短目标成分的出峰时间;流动相中少量的甲酸
可以改善峰形;柱温对分离效果无明显的影响。故最终确定了现
有的色谱条件。
试验数据显示，异土木香内酯的体外蛋白结合率均较高，说
明其从结合型向游离型转化时间较长。推测该药物半衰期较长，
在临床上与其它药物配伍应用时需注意交互影响。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 中国药典，Ⅰ部［S］． 北京:化学工业出版社，
2005:13．
［2］ 张嫚丽，霍长虹，刘 丽，等． 土木香药材 HPLC指纹图谱研究及含
量测定［J］． 中草药，2010，41(9) :1539．
［3］ 王本祥．现代中药药理学［M］． 天津:天津科学技术出版社，1997:
648．
［4］ 李 勇，丛 斌，张嫚丽，等．土木香中倍半萜内酯抗肿瘤活性及构
效关系研究［M］．中草药，2010，41(8) :1336．
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 4 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 4