全 文 ：分光光度法测悬浮培养飞廉细胞中总黄酮含量
叶小颖 ,徐茂军　(浙江工商大学食品与生物工程学院 ,浙江杭州 310035)
摘要　[ 目的]建立悬浮培养飞廉细胞中总黄酮的含量测定方法。[方法]采用分光光度法测定悬浮培养飞廉细胞中总黄酮含量。[结
果]芦丁线性范围为 0～ 0.6 mg(r=0.999 7),平均回收率为 100.4%, RSD=1.5%(n=5)。[结论]该方法简便、准确 ,重复性良好 , 可作为
测定飞廉细胞总黄酮含量的方法。
关键词　飞廉细胞;黄酮类化合物;分光光度法
中图分类号　S 567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)25-10945-02
Study on the Determination of Total Flavonoids Content in the Suspended Cells of Carduus crispus L.by Spectrophotometry
YE Xiao-ying et al　(College of Food Science and Biological Engineering , Zhejiang Gongshang University , Hangzhou , Zhejiang 310035)
Abstract　[ Objective] The research aimed to establish the determination methods of total flavonoids content in the suspended cells of Carduus crispus L.
[Method] The content of total flavonoids in the suspended cells of C.crispus was determined by spectrophotometry.[ Results] The linear range of rutin
was 0-0.6 mg(r=0.999 7), the average recovery was 100.4% and RSD was 1.5%(n=5).[ Conclusion] This method was simple and accurate and
it had good reproducibility.It could be taken as the determination method of total flavonoids content in C.crispus.
Key words　Cells in Carduus crispus L.;Flavonoid;Spectrophotometry
作者简介　叶小颖(1983-),女 ,浙江金华人 ,硕士研究生, 研究方向:
天然产物合成。
收稿日期　2008-06-18
　　飞廉(Carduus crispus L.)又称飞轻 、红花草 、飞帘等 ,是菊
科飞廉属二年生草本 ,以全草或根入药 ,广泛分布于我国各
地 ,生长于田边 、路旁及荒野等处。《神农本草经》上记载其
性“味苦 ,平” ,以及《西藏常用中草药》记载其具祛风 、清热 、
利湿 、凉血散癖之功效 ,主治风热感冒 、头风眩晕 、风热痹痛 、
皮肤刺痒 、尿路感染 、乳糜尿 、尿血 、带下 、跌打癖肿 、疮疡肿
毒 、烫火伤等[ 1-2] 。关于飞廉的相关分析鲜有报道 ,对于悬
浮培养的飞廉细胞总黄酮的测定更是未有报道 ,为此 ,笔者
采用硝酸铝显色 ,建立了悬浮培养飞廉细胞中总黄酮含量的
光谱分析方法 ,现介绍如下。
1　材料与方法
1.1　材料 　仪器岛津 UV-2550 紫外可见分光光度计;
KQ2200DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);
3K-30冷冻离心机(Sigma)。试剂芦丁(Sigma);无水乙醇 、甲
醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠等均为分析纯。MS液体优化
培养基:每升MS液体培养基含 4.3g MS盐 、1×10-5mol萘乙
酸 、2×10-6mol 6-(苄胺基)嘌呤和 30g蔗糖。用浓度 1mol/L
NaOH调 pH值至 5.8 ,121 ℃湿热灭菌 20 min。
1.2　方法
1.2.1　飞廉悬浮细胞的培养。飞廉悬浮细胞(浙江工商大学
食品与生物工程学院细胞培养实验室提供),在 25 ℃, 100
r/min的恒温摇床振荡培养 ,每 10 d进行传代接种 ,接种量为
50 ml培养液接种细胞 3 g(湿重)。
1.2.2　芦丁标准溶液的制备。准确称取芦丁标准品 10 mg ,
置于 10ml容量瓶中 ,加浓度 30%的乙醇溶解(水浴微热)并
定容至刻度 ,摇匀 ,从中准确吸取 2.5ml ,用浓度 30%的乙醇
定容至 25ml容量瓶中 ,得到浓度为 0.1 mg/ml的芦丁标准
溶液。
1.2.3　样品溶液的制备。取飞廉悬浮细胞 ,抽滤后 60 ℃真
空干燥至恒重 ,精密称取 0.5 g飞廉细胞 ,至 10ml离心管中 ,
加入 8ml甲醇;超声 1 h , 2 000 r/min离心 10 min ,收集上清
液;再加入 8ml甲醇 ,重复超声提取 、离心 ,合并上清液 ,浓缩
至干;加甲醇溶解定容至 10 ml 容量瓶 ,得样品总黄酮提
取液 。
1.2.4　显色稳定性试验。准确吸取芦丁标准溶液和样品总
黄酮提取液各 3ml分别于 0、15、30 、45、60min测其吸光度。
1.2.5　精密度试验。准确吸取芦丁标准溶液和样品总黄酮
提取液各 3ml ,重复测定 6次 ,研究试验精密度。
1.2.6　重复性试验。取不同生长时间的飞廉悬浮细胞 ,制
备样品总黄酮提取液 ,准确吸取各时间样品总黄酮提取液 3
ml各 5份 ,测定吸光度 ,计算 RSD值 。
1.2.7　加样回收率试验。取已知总黄酮含量的样品提取液
3ml ,加入芦丁标准品适量 ,分别测定吸光度 ,分析加样回
收率 。
1.2.8　标准曲线的绘制和样品含量的测定。分别吸取芦丁
标准溶液 0 、1.0 、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml置 25 ml的容量瓶
中 ,用浓度 30%乙醇补充至 12.5 ml ,加入浓度 5%亚硝酸钠
溶液 0.7 ml ,混匀 ,放置 5min ,加入浓度 10%硝酸铝溶液 0.7
ml ,混匀 ,放置 6 min ,加入浓度 1 mol/L氢氧化钠溶液 5ml ,混
匀 ,用浓度 30%乙醇定容至刻度 ,静置 10 min ,以试剂为空
白 ,于波长 510 nm处测定吸收度值。取样品总黄酮提取液各
3ml ,依法测定吸光度[ 3-5] 。
1.2.9　样品中总黄酮含量计算方法 。样品黄酮含量计算
公式:
X =C×V/m ×V1/V2
式中 ,X 为黄酮含量(mg/g),以芦丁计;C为根据吸光度得到
的样品总黄酮浓度(mg/ml);m 为处理样品的质量(g);V 为
测吸光度时所稀释的容量瓶体积 ,该处为 25ml;V1 为样品处
理液的总体积(ml),该处为 10 ml;V2 为测定时吸取样品处理
液的体积(ml)。
2　结果与分析
2.1　标准曲线及其回归方程的建立　以吸光度为横坐标 ,
芦丁标准溶液浓度为纵坐标进行线性回归 ,结果表明 ,芦丁
在 0 ～ 0.6 mg范围内线性良好 ,回归方程为 Y =0.090 5X +
0.000 03(r=0.999 7)(图 1)。
2.2　显色稳定性试验结果　试验结果表明 ,芦丁标准品和
样品液在 1 h内稳定性良好 ,RSD分别为 0.72%和 1.46%。
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(25):10945-10946　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　张杨林　责任校对　傅真治
2.3　精密度试验结果　试验结果表明 ,精密度试验芦丁标
准品溶液和样品总黄酮提取液吸光度值基本不变 ,RSD 分别
为 0.25%和 0.33%,表明仪器精密度良好。
图 1　芦丁标准曲线
Fig.1　The standard curve of rutin
2.4　重复性试验结果　重复性试验结果表明 ,该方法重复
性良好(表 1)。
表 1　重复性试验结果
Table 1　The repetitive experiment results
时间∥d
Time
吸光度 Absorbency
1 2 3 4 5
平均值
Mean
SD
%
RSD
%
0 0.273 0.271 0.270 0.270 0.271 0.271 0.12 0.44
4 0.185 0.187 0.184 0.185 0.183 0.185 0.15 0.81
8 0.218 0.218 0.217 0.218 0.217 0.218 0.05 0.23
12 0.346 0.346 0.348 0.350 0.350 0.348 0.20 0.57
16 0.356 0.358 0.359 0.359 0.362 0.359 0.22 0.61
2.5　加样回收率试验结果　试验结果见表 2 ,计算得加样平
均回收率为 100.4%,RSD 为 1.5%。
2.6　测定结果　取不同培养时间的飞廉悬浮细胞 ,依试验
方法测定 ,计算得飞廉细胞的总黄酮含量见图 2。在培养 14
d左右 ,其总黄酮含量达最高。
3　结论
试验以芦丁为标准品 ,利用硝酸铝显色法对悬浮培养飞
表 2　加样回收率试验结果
Table 2　The results of recovery rate test of added sample
样品
Samples
样品量
Sample quantity
mg
标准品量
Quantity of stand-
ard substance∥mg
测定值
Determined
value∥mg
回收率
Recovery
rate∥%
1 0.085 3 0.1 0.184 　98.70
2 0.085 3 0.2 0.286 100.35
3 0.085 3 0.3 0.392 102.23
4 0.085 3 0.4 0.482 99.18
5 0.085 3 0.5 0.593 101.54
图 2　飞廉悬浮细胞中总黄酮含量的变化曲线
Fig.2　The change curve of total flavonoids content in the suspended
cells of Carduus crispus L.
廉细胞总黄酮含量进行测定 ,稳定性及重现性良好 ,加样回
收率高 ,达到了准确测定飞廉悬浮细胞中总黄酮含量的
要求 。
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(上接第 10935页)
　　从表 3 中数据的直观分析可知 ,各因素对甘草酸提取
的影响大小为A>B>D>C ,即提取时间>提取剂用量>提
取剂配比>提取温度。通过收率方差分析表明 ,A 、B具有
显著性差异 ,C、D对结果无显著的影响。选用收率作为考
察指标优化甘草酸的提取工艺 ,最佳工艺条件为A2B2C3D3 ,
即提取时间为 7 h ,提取剂用量为 8倍 ,提取温度为 85 ℃,提
取溶剂的配比为含氨 0.5%的 60%乙醇溶液 。
2.3　验证试验　由于该组合未在正交表中列出 ,故以该组
合进一步做平行试验 ,试验数据见表 4。试验表明 ,该工艺
条件有较高的重现性与可靠性。
表 4　验证试验
Table 4　The verification test
试验号Test code A B C D 收率 Yield∥%
1 2 2 3 3 10.80
2 2 2 3 3 10.82
3 2 2 3 3 10.85
3　结论
以含氨 0.5%的 60%乙醇溶剂作为提取剂 ,提取温度
为 85 ℃,提取时间为 7 h ,提取剂用量为甘草重量 8倍 ,在此
工艺条件下 ,甘草酸的提取率最高 ,达 10.85%。
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