全 文 ：研究与探讨 Vol . 33 , No . 09 , 2012
2012年第9期
现代研究表明，很多疾病如组织器官老化、肿瘤、
心血管疾病等都与过剩的自由基有关。一些外源性
天然抗氧化剂能拮抗体内过量的自由基，从而预防
相关疾病的发生。研究表明，天然色素花色苷具有
消除自由基、抗衰老、抗氧化、抗癌等多种生理活性
功能[1-3]。因此寻找高效的天然花色苷抗氧化剂已经
成为人们关注的热点。蓝靛果忍冬（Lonicera edulis
Turcz.），又名蓝靛果、黑瞎子果、山茄子、羊奶子等，属
被子植物门忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（Lonicera）
植物，落叶灌木[4]。蓝靛果忍冬含有丰富的花青素、维
生素、矿质元素和氨基酸等物质，是一种世界珍稀、
纯天然、野生的可食用浆果，具有极高的营养与保健
价值[5-6]，并且是天然花色苷的良好来源[7]。研究显示，
蓝靛果与其他许多产品相比有很强的抗氧化活性，
从蓝靛果提取物中分离出的天然产物具有化学抑制
和化学治疗的活性[8-9]。作者在前期也对蓝靛果花色
苷粗提物的体外抗氧化性进行了研究，确定其抗氧
化活性较强。蓝靛果因其具有的营养价值，相继开发
出了一系列保健饮料、功能性食品、药品等产品 [10]。
本研究以蓝靛果为原料，经60%乙醇提取及X-5大孔
树脂吸附，用不同体积分数的乙醇进行梯度洗脱得
到不同洗脱物，并对各洗脱物清除·OH、O2-·、DPPH·
和ABTS+·的能力进行比较，以VC作为阳性对照，筛选
王振宇1，2，刘奕琳1
（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；
2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨 150090）
摘 要：蓝靛果花色苷是一种很好的抗氧化剂，其花色苷种类繁多，为筛选出具有较高抗氧化活性的花色苷，将蓝靛
果花色苷粗提物经X-5大孔树脂吸附后，用体积分数10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液梯度洗脱获
得8个洗脱物，研究了这8个洗脱物对·OH、O2-·、DPPH·和ABTS+·的清除作用。8个洗脱物均表现出较强的清除能力，并
且清除率随各物质量浓度的升高而提高，而且清除率大都高于VC对照组，其中，60%乙醇洗脱物清除·OH和O2-·能力
最强，40%乙醇洗脱物清除DPPH·能力最强，10%乙醇洗脱物清除ABTS+·能力最强。 实验结果表明，蓝靛果提取物的
乙醇洗脱物具有很强的清除自由基的能力，可以作为抗氧化剂应用在食品、化妆品、药品等领域。
关键词：蓝靛果，花色苷，洗脱物抗氧化性
Antioxidant activities of ethanol eluting fractions from
Lonicera edulis extract
WANG Zhen-yu1，2，LIU Yi-lin1
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；
2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）
Abstract：Lonicera edulis anthocyanidins are good antioxidants and have varies of physiological functions. To
sift and determine the anthocyanidin with stronger antioxidation ability from Lonicera edulis extract，Lonicera
edulis extract was absorbed on resin X-5 and eluted gradiently with 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70% and
80% ethanol solution to get eight fractions. The scavenging effects of the eight fractions were determined on
·OH，O2-·，DPPH· and ABTS+·. The results showed that all the eight fractions exhibited strong scavenging
abilities which are higher than the VC and control groups and the scavenging rate increased obviously with the
increase of concentration. The scavenging ability of 60% ethanol fraction on·OH and O2-· is the strongest，
while the 40% ethanol fraction showed the strongest scavenging ability on DPPH·When it came to the ABTS+·，
the scavenging ability of 10% ethanol fraction was the best. In conclusion，different concentrations of ethanol
eluting fractions had different but strong radical scavenging ability which could be used as a strong antioxidant
in the industry of food，cosmetic，pharmaceutical，etc.
Key words：Lonicera edulis；anthocyanin；antioxidant activities of ethanol eluting fraction
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2012）09-0163-04
收稿日期：2011－09－02
作者简介：王振宇（1957-），男，博士，教授，研究方向：功能性食品。
蓝靛果乙醇洗脱物的抗氧化活性研究
163
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.09.094
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2012年第9期
出抗氧化能力最强的洗脱物，旨在为蓝靛果资源的
综合开发利用及研究提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蓝靛果 采摘于大兴安岭，清洗沥干后包装，置
于冰箱中冷冻备用；DPPH、ABTS 购自Sigma公司；
无水乙醇、FeSO4、H2O2、水杨酸钠、焦性没食子酸、铁
氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁 均为国产分析纯。
HR1707榨汁机 飞利浦公司；FA2004电子分析
天平 上海天平仪器厂；T6新世纪紫外可见分光光
度计 北京普析仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蓝靛果提取物的不同浓度乙醇洗脱物的制
备 称取1kg蓝靛果，用榨汁机破碎果肉，过滤得澄清
汁，用5L体积分数60%的乙醇溶液浸泡滤渣24h，离心
并过滤取上清液，滤饼再重复浸提一次，合并两次的上
清液和澄清汁，真空浓缩获得提取液。将预处理好的
X-5大孔树脂以湿法装柱，所用柱子的径长比为1∶10。
上样速度为1mL/min，吸附4h后进行洗脱，洗脱剂依
次为水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%
乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇，洗脱体积为两倍
柱体积，洗脱速度为2mL/min，收集各洗脱级分，分别
经真空浓缩除去乙醇溶剂，定容至同一体积，用pH示
差法[11]测定各个洗脱物花色苷的含量，并计算花色
苷的相对得率，即各个洗脱物的花色苷含量占8个洗
脱物花色苷总含量的百分比。并将各个洗脱物配制成
不同质量浓度的花色苷样品液，4℃避光冷藏备用。
1.2.2 羟自由基清除能力的测定 参照徐建国等[12]
采用的水杨酸钠络合法，略作改动，测定样品清除羟
自由基的能力。反应体系中依次加入样品液1mL，
6mmol/L FeSO4溶液2mL，6mmol/L H2O2溶液2mL，将
反应体系混合均匀放置10min，再加入6mmol/L水杨
酸钠溶液2mL，静置30min后，于510nm波长下用蒸馏
水调零，并测定吸光值A1；将上述体系中的水杨酸钠
溶液用相同体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定
吸光值A2；将上述体系中的样品溶液用相同体积的
蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A0。羟自由
基清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100%
1.2.3 超氧自由基清除能力的测定 参照郭雪峰[13]
的方法，略作改动，测定样品清除超氧自由基的能力。
反应体系中依次加入50mmol/L Tris-HCl溶液5.7mL，
样品溶液0.2mL，6mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，将混
合物反应4min，滴入2滴HCl终止反应，在320nm波长
下测定吸光值A1；将邻苯三酚用等体积的蒸馏水代
替，其他操作相同，测定吸光值A2；将样品溶液用等
体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A0。
超氧自由基清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100%
1.2.4 DPPH自由基清除能力的测定 参照Blois等[14]
的方法，略作改动，测定样品清除DPPH自由基的能
力。配制0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，放在棕色试剂瓶
中于4℃保存，在试管中加入2mL DPPH乙醇溶液及
2mL样品溶液，混合均匀在室温避光放置30min，于
517nm波长下用无水乙醇调零，并测定吸光值A1；将
DPPH乙醇溶液用等体积的无水乙醇代替，其他操作
相同，测定吸光值A2；将样品溶液用等体积无水乙醇
溶液代替，其他操作相同，测定吸光值A0。DPPH自由
基清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100%
1.2.5 ABTS+·清除能力的测定 参照Wanwisa等的
方法，略作改动，测定样品清除ABTS+·的能力。用
2.6mmol/mL过硫酸钾溶液溶解ABTS甲醇溶液，配制
成7.4mmol/mL ABTS储备液，室温避光静置12～24h后
4℃保藏。现用时取1mL储备液用甲醇稀释54.7倍，在
734nm处的吸光值为0.700±0.020，甲醇调零。在试管
中加入2.850mL ABTS测定液及0.150mL样品溶液，混
合均匀在室温避光放置2h，于734nm波长下用甲醇调
零，并测定吸光值A1；将ABTS测定液用等体积的蒸馏
水代替，其他操作相同，测定吸光值A2；将样品溶液
用等体积甲醇溶液代替，其他操作相同，测定吸光值
A0。ABTS自由基清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100%
实验数据均采用SPSS 10.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同洗脱物的花色苷相对得率
按1.2.1方法获得的洗脱物，用pH示差法测定其花
色苷含量，即各个洗脱物的花色苷含量占8个洗脱物
花色苷总含量的百分比。计算其相对得率如表1所示。
由表1可以看出，8个乙醇洗脱物的花色苷相对
得率存在显著差异，其中，30%乙醇洗脱物的花色苷
相对得率最高，可达到31.66%；其次是40%乙醇洗脱
物和20%乙醇洗脱物；再次是50%乙醇洗脱物和60%
乙醇洗脱物；10%乙醇洗脱物、70%乙醇洗脱物和
80%乙醇洗脱物的花色苷相对得率最低，并且三者
的差异不显著。
2.2 不同级分清除羟自由基的能力
羟基自由基（·OH）是化学性质最活泼的一种自
由基，几乎可以与所有的生物大分子发生反应，危害
性极大，在生物体内甚至导致细胞死亡和突变。基于
水杨酸钠可以捕获羟基自由基生成2，3-二羟基苯甲
酸和2，5-二羟基苯甲酸，在波长510nm处有最大吸
收的原理，建立一种Fenton反应产生羟基自由基的方
法。按照1.2.2的方法，8个洗脱物对羟自由基的清除
表1 不同洗脱物的花色苷相对得率
Table 1 The relative rates of anthocyanin of different eluting
fractions
乙醇浓度（%） 10 20 30 40 50 60 70 80
相对得率（%） 1.03 22.3 31.66 23.86 15.08 3.54 1.45 1.08
图1 不同乙醇洗脱物对羟自由基的清除能力
Fig.1 Scavenging effects of eight fractions on·OH
羟
自
由
基
清
除
率
（
%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
花色苷质量浓度（μg/mL）
10%乙醇
20%乙醇
30%乙醇
40%乙醇
50%乙醇
60%乙醇
70%乙醇
80%乙醇
VC
164
研究与探讨 Vol . 33 , No . 09 , 2012
2012年第9期
（下转第174页）
率如图1所示。
由图1可以看出，每个洗脱物对羟自由基都有较
好的清除能力，均高于VC对照组，并且清除率随质量
浓度的增加而增大，呈现明显的量效关系，其清除能
力大小依次为：60%乙醇>10%乙醇>40%乙醇>50%
乙醇>30%乙醇>20%乙醇>80%乙醇>70%乙醇，质量
浓度为100μg/mL时的清除率依次为94.57%、89.26%、
87.3%、85.12%、83.34%、79.09%、77.6%和74.07%。
2.3 不同级分清除超氧自由基的能力
超氧阴离子自由基（O2-·）是生物体中产生量最
多的一种氧自由基，其活泼性虽不大，但寿命较长，
扩散性较强，可引起核酸链断裂、多糖解聚、不饱和
脂肪酸过氧化，进而引起膜的损伤，使某些酶失活并
改变线粒体氧化磷酸化作用。在碱性条件下
（pH8.2），邻苯三酚发生自氧化反应，生成超氧阴离
子自由基（O2-·）和中间产物，该中间产物在320nm处
有一特征吸收峰。当加入自由基清除剂时，O2-·的生
成受到抑制，自氧化过程受阻，在320nm处的吸收减
弱。按照1.2.3的方法，将各个洗脱级分配制成不同质
量浓度的花色苷样品溶液，8个洗脱物对超氧自由基
的清除率如图2所示。
由图2可以看出，每个洗脱物对超氧自由基都有一
定的清除能力，并且清除率随质量浓度的增加而增大，
呈现明显的量效关系，但低于VC对照组，其清除能力
大小依次为：60%乙醇>40%乙醇>50%乙醇>10%乙
醇>30%乙醇>20%乙醇>80%乙醇>70%乙醇，质量浓
度为100μg/mL时的清除率依次为86.13%、82.24%、
80.25%、77.59%、77.12%、74.33%、68.21%和67.46%。
2.4 不同级分清除DPPH自由基的能力
二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）是一种稳定的
以氮为中心的自由基，DPPH·乙醇溶液呈紫色，其浓
度与吸光度呈线性关系。在DPPH·乙醇溶液中加入
样品后，其中的抗氧化活性物质可以与DPPH·结合
或发生替代，使DPPH·数量减少，溶液颜色变浅，其
在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。
按照1.2.4的方法，8个洗脱物对DPPH自由基的清除
率如图3所示。
由图3可以看出，每个洗脱物对DPPH都有一定的
清除能力，清除率在VC对照组上下，并且清除率随质量
浓度的增加而增大，呈现明显的量效关系，其清除能
力大小依次为：40%乙醇>60%乙醇>50%乙醇>70%乙
醇>30%乙醇>10%乙醇>20%乙醇>80%乙醇，质量浓
度为100μg/mL时的清除率依次为85.23%、84.49%、
78.31%、74.02%、68.22%、65.24%、63.32%和61.74%。
2.5 不同级分清除ABTS+·的能力
ABTS[2，2’-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-
6磺酸）]是一种供氢体，该方法是一种用于体外测定
物质总抗氧化能力的新方法，按照1.2.5的方法，8个
洗脱物对ABTS自由基的清除率如图4所示。
由图4可以看出，每个洗脱物对ABTS+·都有一定
的清除能力，均高于VC对照组，并且清除率随质量浓
度的增加而增大，呈现明显的量效关系，其清除能力
大小依次为：10%乙醇>40%乙醇>60%乙醇>50%乙
醇>30%乙醇>20%乙醇>70%乙醇>80%乙醇，质量浓
度为100μg/mL时的清除率依次为98.15%、97.24%、
96.72%、96.3%、93.07%、89.53%、87.59%和85.35%。
3 结论
蓝靛果花色苷粗提物经X-5大孔树脂吸附和洗
脱后，不同种类的花色苷及其衍生物被8个乙醇洗脱
物分别洗脱下来，各洗脱物的花色苷相对得率不尽
相同，主要集中在20%、30%、40%和50%乙醇洗脱物
中，其中30%乙醇洗脱物中的花色苷相对得率最高，
可见其含有的花色苷种类占蓝靛果花色苷粗提物中
的比例最高。但各个洗脱物中的花色苷的种类无法
确定，需进一步分析鉴定。
以往的实验都是将花色苷在同一梯度下进行纯
化洗脱，没有考虑到不同梯度洗脱分离出不同的花
色苷，其是否有不同的抗氧化性，由本研究可以看出，
在不同的自由基评价体系中，8个洗脱物表现出不同
的清除能力。在·OH体系中，60%乙醇洗脱物对·OH的
清除能力明显高于其他洗脱物，清除率为94.57%，并
且每个洗脱物的清除率均高于VC对照组；在O2-·体系
图2 不同乙醇洗脱物对超氧自由基的清除能力
Fig.2 Scavenging effects of eight fractions on O2-·
超
氧
自
由
基
清
除
率
（
%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
花色苷质量浓度（μg/mL）
10%乙醇
20%乙醇
30%乙醇
40%乙醇
50%乙醇
60%乙醇
70%乙醇
80%乙醇
VC
图3 不同乙醇洗脱物对DPPH·的清除能力
Fig.3 Scavenging effects of eight fractions on DPPH·
DP
PH
·
清
除
率
（
%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
花色苷质量浓度（μg/mL）
10%乙醇
20%乙醇
30%乙醇
40%乙醇
50%乙醇
60%乙醇
70%乙醇
80%乙醇
VC
图4 不同乙醇洗脱物对ABTS+·的清除能力
Fig.4 Scavenging effects of eight fractions on ABTS+·
AB
TS
+ ·
清
除
率
（
%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
花色苷浓度（μg/mL）
10%乙醇
20%乙醇
30%乙醇
40%乙醇
50%乙醇
60%乙醇
70%乙醇
80%乙醇
VC
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Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2012年第9期
中，60%乙醇洗脱物对O2-·的清除能力明显高于其他
洗脱物，清除率为86.13%，但每个洗脱物的清除率均
低于VC对照组；在DPPH·体系中，40%乙醇洗脱物对
DPPH自由基的清除能力明显高于其他洗脱物，清除
率为85.23%高于VC对照组；在ABTS+·体系中，10%乙
醇洗脱物对ABTS自由基的清除能力明显高于其他
洗脱物，清除率为98.15%，并且每个洗脱物的清除率
均高于VC对照组。由此可见，不同洗脱物中的花色苷
及其衍生物对不同的自由基表现出了不同的抗氧化
能力，这是由于花色苷抗氧化的主要途径有三种：a.抑
制自由基的产生或直接清除自由基。花色苷清除自
由基的功能主要和它分子中的羟基有关，特别是3-位
或3′-、4′-、5′-位羟基有关。b.激活抗氧化酶体系。通
过激活过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧
化物酶等来达到抗氧化效果，而抗氧化酶的重要生理
功能也在于对自由基的清除作用。c.与诱导氧化的过
渡金属络合，可以直接降低LDL的氧化程度，也可抑
制Fenton反应起到抑制活性氧自由基产生的作用[15]。
不同的花色苷的抗氧化途径不同，因此表现出不同的
抗氧化能力。总体看来，10%、40%、50%和60%乙醇洗
脱物的抗氧化活性较20%、30%、70%和80%乙醇洗
脱物高，可见不同结构的花色苷的生理功能不同。
本实验对蓝靛果花色苷不同乙醇洗脱物的抗氧
化性进行了比较，为其进一步的研究提供了参考依
据。可以看出蓝靛果花色苷具有很高的抗氧化功能，
是极强的抗氧化剂，在食品中，可作为天然色素为食
物增添色彩，同时起到抗氧化剂的功能，进而作为保
健食品；在化妆品中，添加少量的蓝靛果花色苷，可
以作为保护皮肤的天然抗氧化剂；蓝靛果花色苷也
可应用到药品中，发挥其抗癌、抗氧化作用。
参考文献
[1] 倪勤学， 霍艳荣， 陆国权. 花色苷保健功能的研究进展[J].
安徽农业科学，2010，38（35）：20025-20028.
[2] 薛红玮，陈向民，牟德华. 花色苷类色素抗氧化活性研究进
展[J]. 食品研究与开发，2009，30（7）：190-192.
[3] WANG LISHU， STONER G D. Anthocyanins and their role
in cancer prevention[J]. Cancer Letters，2008，269：281-290.
[4] 向延菊，郑先哲，王大伟. 野生浆果资源——蓝靛果忍冬利
用价值的研究现状及应用前景[J]. 东北农业大学学报，2005，36
（5）：669-671.
[5] 王宏涛，叶云，肖顺林，等. 蓝靛果乙酸乙酯提取物对胃溃
疡大鼠胃黏膜血管活性物质的影响[J]. 辽宁中医杂志，2007，34
（3）：360-361.
[6] 莫巍 . 彩叶树种叶片中花青素含量的测定及动态分析 [J].
新疆农业科学，2007，44（S2）：138-140.
[7] WANG H， CAO G， PRIOR RL. Total antioxidant capacity of
fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996（44）：
701-705.
[8] DING M，FENG R，WANG SY，et al. Cyanidin-3-glucoside，
a natural product derived from blackberry，exhibits chemo
preventive and chemotherapeutic activity[J]. Journal of Biological
Chemistry，2006（281）：17359-17368.
[9] FENG R， BOWMAN LL， LU Y， et al. Blackberry extracts
inhibit activating protein 1 activation and cell transformation by
perturbing the mitogenic signaling pathway [J ] . Nutrition and
Cancer，2004，50（1）：80-89.
[10] 王振宇，杨玲. 蓝靛果的研究利用现状及其发展前景[J]. 安
徽科技学院学报，2009，23（3）：18-20.
[11] 杨兆艳. pH示差法测定桑葚红色素中花青素含量的研究
[J]. 食品科技，2007（4）：201-203.
[12] 徐建国，胡青平. 决明子水提物体外清除自由基活性的研
究[J]. 食品科学，2006，27（6）：73-78.
[13] 郭雪峰，岳永德，汤锋，等. 用清除超氧阴离子自由基法评
价竹叶提取物抗氧化能力[J]. 光谱学与光谱分析，2008，28（8）：
1823-1826.
[14] BLOIS MS. Antioxidant determinations by the use of a
stable free radical[J]. Nature，2002，26：1199-1200.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第165页）
1998，123：2567-2571.
[10] Uis Valle， Cecilia Diaz， Antonio L， et al. Determination of
the sum of malachite green and leucomalachite green in salmon
muscle by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical
ionisation-mass spectrometry[J]. Chromatography A，2005，1067：
101-105.
[11] Geraldine Dowling， Patrick P J Mulder， Conor Duffy， et al.
Confirmatory analysis of malachite green，leucomalachite green，
crystal violet and leucocrystal violet in salmon by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica
Acta，2007，586：411-419.
[12] Kim-Chung Lee，Jian-Lin Wu，Zongwei Cai. Determination
of malachite green and leucomalachite green in edible goldfish
muscle by liquid chromatography-ion trap mass spectrometry[J].
Journal of Chromatography B，2006，843：247-251.
[13] Van de Riet J M，Murphy C J，Pearce J N，et al. Determination
of malachite green and leucomalachite green in a variety of
aquacultured products by liquidchromatography with tandem
mass spectrometry detection[J]. AOAC Int，2005，88：744-749.
[14] Yang M C，Fang J M，Kuo T F，et al. Production of anti -
bodies for selective detection of malachite green and the related
triphenylmethane dyes in fish and fishpond water[J]. Journal of
Agricultural and Food Chemistry，2007，55（22）：8851-8856．
[15] 李晓丽，陈雪岚，刘春梅，等. 孔雀石绿单克隆抗体的制备
及直接竞争ELISA方法的建立 [J]. 食品科学 ，2009，30（24）：
283-286.
[16] 杨利国，胡少昶，魏平华，等 . 酶联免疫测定技术 [M]. 南
京：南京大学出版社，1998：95-96.
[17] 朱立平，陈学清 . 免疫学常用实验方法[M]. 北京：人民军
医出版社，2000：32-33.
[18] 沈玉栋，王宇，孙远明，等. 隐性孔雀石绿半抗原与全抗原
设计、合成及鉴定[J]. 食品科学，2008，29（7）：263-266.
174