全 文 ：新疆党参多糖的提取 、含量分析及免疫功能的初步研究
李 艳 1 , 孙 萍 1 , 刘 霞2 , 但建明 1 , 谢建新 2
(1.石河子大学师范学院 ,新疆 石河子 832003;2.石河子大学医学院分子医学实验室 ,新疆 石河子 832002)
收稿日期:2004-01-03
基金项目:本课题为新疆兵团博士基金项目(2001年度 03项目)
作者简介:李艳(1967～ ),女 ,新疆石河子市人 ,石河子大学副教授 ,在职研究生 ,从事中草药有效成分的提取及药理活性研究。 联系电
话:0993-2038268;E-mail:shzly-1967@163.com
关键词:党参多糖;MTT;淋巴细胞增殖
中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2005)07-0839-02
新疆党参 Codonopsisclematidea(schrenk)Clarke为桔梗
科党参属多年生草本植物。药用根 , 其性甘 、平 , 补脾胃 , 益
气血 , 生津止渴 ,是重要的传统补益中药 ,民间用于治疗功能
性子宫出血 、体虚无力 、胃下垂 、风湿性心脏病等 [ 1] 。据报
道:新疆党参含 12种生命必需微量元素;含 37种挥发成
分 [ 2];在小鼠脑内抗自由基作用优于潞党参 [ 3] 。新疆党参
在全疆均有分布 , 且储量丰富 , 但对新疆党参的利用却很少 ,
为了开发这一药用资源 , 我们从新疆党参中提取 CCP,并对
其含量进行测定 [ 4] , 通过动物细胞培养试验 , 测定 CCP刺激
淋巴细胞增殖的功能 ,来探讨 CCP的免疫增作用。
1 材料与方法
1.1 试剂与药品
党参采用新疆天山 , 经石河子大学药学院生药教研室成
玉怀副教授鉴定为新疆党参 Codonopsisclematidea(schrenk)
Clarke。秋季挖取 , 洗净 ,阴干 , 60℃烘 3 h,粉碎成粗粒 , 置干
燥器中备用。 MTT(Sigma公司产品), 用 pH=7.2的 PBS配
成 5 mg· mL-1溶液 , 0.22 μm滤膜除菌 , 4℃避光保存 2
周 [ 5] 。 ConA(Sigma公司产品)用 pH=7.2的 PBS配成 6mg
· mL-1溶液。RPMI-1640(Sigma公司产品)培养液(含 10
新生牛血清 , 青 、链霉素各 100 U/mL, 无酚红)。 SDS-DMF
(20 SDS加 50 DMF, 以 1 mol/L的 HCl调解 pH值为
4.7[ 6])。新生牛血清(GIBIO公司)96孔培养板(NUNC公司
产品)。葡萄糖(Sigma公司产品)。其余试剂均为分析纯。
1.2 实验仪器
酶标仪(ELX800 BioelisaReader)。 5 二氧化碳培养
箱。旋转蒸发仪(R50 2B上海申生科技有限公司)。岛津
UV-2401PC紫外可见分光光度计。傅利叶变换红外光谱仪
(EQUINOX55德国 BRUKER公司生产)。
1.3 实验动物
Balb/c小鼠 50只 ,购自新疆军区总医院实验动物中心
[合格证号:SCXK(军)2002-015] , ♀♂各半 , 6 ～ 8周龄 , 约
20 ～ 22 g。
1.4 CCP的提取与精制
称取党参粗粒置索氏提取器中 , 依次用石油醚 、乙醚和
乙醇回流提取 ,除去单糖及苷类。残渣再以水回流提取 , 活
性炭脱色 , 抽滤 , 滤液经 sevag法 、蛋白酶法和透析等方法除
去蛋白质 、氨基酸 、和小分子寡糖等 , 浓缩后 , 加乙醇使含醇
量达 80 ,冰箱静置过夜 , 抽滤 , 得党参多糖(CCP), 得率为
15.4 (n=3)。 CCP为灰白色 , 溶于水 ,不溶于乙醇 、丙酮 、
氯仿等有机溶剂。 Molish反应呈阳性 , 碘化钾-碘反应呈阴
性 ,钠熔法元素分析不含氮 ,红外光谱在 4000-400 cm-1区间
有多糖的特征吸收 , UV扫描未见核酸和蛋白质特征吸收峰。
1.5 CCP的含量分析
按文献 [ 4] ,以葡萄糖为标准品 , 用苯酚-硫酸法显色测
定 , CCP的含量为 50.01 (n=5)。
1.6 淋巴细胞的收集和培养
小鼠脱颈处死 ,无菌取出脾脏置 Hanks液平皿中剪碎 ,
灭菌注射器针芯轻轻挤压脾组织块 , 用 200目金属筛网过
滤 , Hanks液冲洗 , 离心后取上清液 , Tris-NH2CL破渗红细
胞 , RPMI-1640培养液洗涤离心 2次 , 沉淀细胞用完全 RPMI-
1640培养液制备一定的浓度单细胞悬液。台盼蓝染液进行
活细胞计数大于 95 ,调整至细胞浓度 1×106mL-1。
1.7 淋巴细胞增殖反应
按 Mosmann法 [ 7]改进:96孔细胞培养板 , 每孔加入 1 ×
106mL-1淋巴细胞悬液 100 μL及不同浓度的药物 50 μL(临
用前用 PBS配成一定浓度 , 超滤灭菌 , 4℃保存), 于 5 CO2 ,
37℃培养箱中培养 48 h, 培养结束前 4 h, 每孔加入 MTT(5
mg· mL-1)20μL, 培养结束时每孔加入 SDS-DMF100μL,放
培养箱中继续培养 3 h后在酶标仪上测定 OD570值 , 实验设
空白对照 、正常对照 , 阳性对照 ,阳性对照药为 ConA, 每实验
点设 5复孔。
1.8 统计学处理
采用方差分析 ,数据处理采用 SPSS软件。
2 结果
从表 1、表 2结果可以看出:CCP剂量 80 mg· mL-1组能
明显促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖 , 其 OD值是正常对照组
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第 27卷 第 7期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
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Vol.27 No.7
的 1.5倍左右。小鼠淋巴细胞增殖率与正常对照组相比增
高 70 。 CCP剂量 128 mg· mL-1组没有增殖作用 , 可能因
药物浓度过大 , 促使细胞凋亡或者可能导致毒性作用 ,从而
使淋巴细胞增殖能力下降。 CCP剂量 34 mg· mL-1组可能
因为浓度没有达到能刺激淋巴细胞增殖的阈值 ,故没有刺激
淋巴细胞增殖的作用 。
表 1 CCP对正常体外小鼠淋巴细胞增殖的影响(体外实验)
组别 终浓度(mg· mL-1) N OD570(Mean±SD)
RPMImedia1640 10 0.1261±0.0369
CCP剂量 1组 128 10 0.1127±0.0531
CCP剂量 2组 80 10 0.1928±0.07361)
CCP剂量 3组 34 10 0.1154±0.0668
ConA 2 10 0.2345±0.10612)
1)P<0.05, 2)P<0.01vscontrol.
表 2 CCP体外对小鼠淋巴细胞增殖率(体外实验)
组别 终浓度(mg· mL-1) N 淋巴细胞增殖率( )
RPMImedia1640 10 100 ±0.0000
CCP剂量 1组 128 10 54 ±0.5239
CCP剂量 2组 80 10 170 ±0.8014
CCP剂量 3组 34 10 30 ±0.3786
ConA 2 10 185 ±0.3017
1)P<0.05, 2)P<0.01vscontrol.
3 讨论
本实验采用改良的 MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖反
应 , 这种方法简便可行 ,并且能克服 3H掺入法带来的放射性
问题 , 改良的 MTT法采用 SDS-DMF作溶解液 , 可不必象过
去那样在加溶解液前吸弃或离心去除原来的培养液 ,除去其
中的血清蛋白等成分以避免沉淀造成干扰 ,也不必剧烈振荡
培养板以助溶。
多糖具有多种生物活性 , 能激活免疫细胞 , 提高机体的
免疫功能 ,对正常细胞没有毒副作用 , 已成为当前新药发展
的方向之一。赵武述 [ 8]等对 21种中药多糖进行了体外淋巴
细胞增殖反应的研究 ,发现多糖对淋巴细胞有一定的促增殖
作用。本实验证明 CCP也具有促进淋巴细胞增殖的作用 ,
CCP刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖可能存在最适剂量 , 浓度过
高 ,可能反而促进了淋巴细胞的凋亡或者可能导致毒性作
用 ,从而使淋巴细胞增殖能力下降。新疆党参多糖的进一步
分离纯化及结构鉴定工作正在进行当中 , 以期深入研究其构
效关系等 ,为新疆特色中草药的开发以及临床应用提供实验
依据。
参考文献:
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分析 [ J] .中华微生物和免疫学杂志 , 1991, 11(6):381-383.
西红花伪品的鉴别
吴晓春
(上海市药材有限公司 ,上海 200002)
收稿日期:2005-01-26
作者简介:吴晓春(1966～ ),女 ,大学 ,主管中药师,主要从事药材质量检验工作。
关键词:西红花;鉴别;伪品
摘要:目的:鉴别西红花的真伪 。方法:经验鉴别法 、显微鉴别法 、理化鉴别法。结果:运用此三法能正确鉴别西红花的真
伪。结论:西红花及其伪品的鉴别是可归纳掌握的。
中图分类号:R282.5 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2005)07-0840-02
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中 成 药
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