全 文 ：表 2　各组肝细胞细胞核异染色质 、常染色质及核比表面的测量结果( x±s)
组别 异染色质(Vv) 常染色质(Vv) 核比表面
正常对照 23.46±8.79 76.54±8.79 0.638 7±0.264 3＊
模型对照 20.38±6.27 79.62±6.27 0.423 1±0.079 3
中药低剂量 22.34±5.38 77.66±5.38 0.487 6±0.127 4
中药中剂量 21.20±5.06 78.80±5.06 0.573 5±0.163 8＊
中药高剂量 22.38±5.86 77.62±5.86 0.541 7±0.128 3＊
　　与模型对照组比较 , ＊P﹤ 0.05;n=30
4　讨论
我们采用 ConA复制肝损伤小鼠模型 , 小鼠血清 ALT, TBIL
在注射后 6 h达到峰值 ,与文献报道基本一致 [ 3] 。通过对实验各
组肝组织超微结构的观察分析显示 ,模型组肝细胞的损伤主要表
现有肝细胞出现细小脂滴 , 说明部分肝细胞出现脂代谢障碍。其
机理分析为肝细胞线粒体和内质网受到严重的损伤 ,造成能量代
谢障碍 , ATP生成减少 ,同时蛋白质代谢也发生障碍;主要内质网
明显减少且内质网内出现泡状结构的改变。从立体计量学测得
的结果可以看出 , 线粒体的 Vv明显减小 , 说明细胞内线粒体数
目减少 , 线粒体的 δ缩小说明线粒体体积增大 , 而线粒体的比膜
面明显减少 , 提示线粒体体积增大是水肿造成的 , 而线粒体嵴缩
短模糊或消失 , 嵴间腔扩大 , 因此比膜面减少而功能降低 , 生成
ATP障碍。研究表明 , 模型组肝细胞的损伤主要严重影响细胞的
能量代谢和蛋白质代谢 ,而对核酸的代谢影响不大 , 从核表面出
现发芽的现象并有异染色质电子密度增高所提示 , ConA性肝损
伤的发生机制与肝细胞凋亡有关 , 与文献报道相符 [ 4, 5] 。 QSYF
各组在核形态结构上均未发现有核出芽现象和异染色质电子密
度增高的现象 ,提示 QSYF对 ConA诱导的肝细胞凋亡具有拮抗
作用 , 并随着剂量的增加肝细胞质内脂滴逐渐减少 , 线粒体 、内质
网增多 ,研究结果表明 QSYF通过增强线粒体的数目和功能 、增
强蛋白质的代谢 ,发挥保护肝细胞的作用 , 减轻肝损伤 ,其量效关
系呈正相关。
参考文献:
[ 1 ] 　曲建慧 ,张修礼.ConA小鼠肝损伤模型的研究及应用 [ J] .肝脏 ,
2001, 6(3):180.
[ 2 ] 　胡水清 ,黄依雯 ,秦　伟 ,等.ConA诱导小鼠肝损伤模型的发病机
制 [ J] .中国血液流变学杂志 , 2007, 17(1):159.
[ 3 ] 　李　敏 , 李卫东.ConA引起小鼠肝损伤实验研究 [ J] .中国比较医
学杂志 , 2008, 18(7):13.
[ 4 ] 　王天才 ,李小刚 ,武忠弼 ,等.刀豆蛋白 A诱导鼠肝损伤的荧光组织
化学和超微病理研究 [ J].同济医科大学学报 , 1997, 26(3):208.
[ 5 ] 　刘巧丽 ,高月求.刀豆球蛋白 A诱导小鼠免疫性肝损伤的凋亡机
制研究 [ J] .中国免疫学杂志 , 2008, 24(10):876.
收稿日期:2008-03-06;　修订日期:2009-11-26
基金项目:湖北省卫生厅科研基金资助项目(No.JX1B025)
作者简介:陈　涛(1962-),男(汉族),上海人 ,现任三峡大学医学院教授 ,
硕士研究生导师 ,博士学位,主要从事中医药抗恶性肿瘤的研究工作.
＊通讯作者简介:巩仔鹏(1985-), 男(汉族),安徽界首人 , 现为三峡大学
2008级在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药药理研究工作.
珠子参皂苷对人早幼粒白血病 HL-60细胞
增殖抑制和诱导分化的研究
陈　涛 ,胡　卫 ,巩仔鹏＊ ,翟文海
(三峡大学医学院 ,湖北 宜昌　443002)
摘要:目的 探讨珠子参皂苷对 HL-60细胞增殖抑制和诱导分化作用及其机制。方法 MTT比色法测定细胞增殖抑制
作用;细胞涂片观察细胞形态学改变;硝基四氮唑蓝(NBT)试验测定细胞还原能力;流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。
结果 72 h后 , 最低 、低 、中 、高浓度珠子参皂苷组的细胞增殖抑制率分别为 51.86 %, 42.84 %, 49.13 %, 66.40 %;细胞
形态学观察发现珠子参皂苷组 67.1%细胞分化成熟;NBT还原能力明显增强;细胞被阻滞在 G0 /G1期。结论 珠子参皂
苷对 HL-60细胞有一定的增殖抑制和诱导分化作用 , 其作用机理可能与阻止细胞于 G0 /G1期有关。
关键词:珠子参;　皂苷;　HL-60;　分化
中图分类号:R962　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)04-831-02
　　珠子参 Panaxjaplcusvarmajor又名扣子七 , 为五加科植物珠
子参 PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wuet
K.M.Feng或羽叶三七 PanaxjaponicusC.A.Mey.var.bipin-
nati-fidus(Seem)C.Y.WuetK.M.Feng的干燥根茎 ,主要分
布于东喜马拉雅至我国西部山区 [ 1] 。它的根茎为药材珠子参 ,
具活血散瘀 、补血止血 、消肿止痛之功。目前已从珠子参各种属
珠子参根茎及叶中共分离出 25个皂苷 ,多数为三萜皂苷 [ 2] 。从
结构上分析 , 珠子参皂苷极可能具有诱导肿瘤细胞分化的作用。
但到目前为止 , 珠子参皂苷用于抗肿瘤方面的研究还非常少。本
文以人早幼粒白血病 HL-60细胞株为对象 ,用体外细胞培养的
方法 , 初步探讨了珠子参皂苷抗癌及诱导肿瘤细胞分化的作用。
1　材料
1.1　细胞株 人早幼粒白血病 HL-60细胞株 , 购自上海中国科
学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.2　药品与试剂 珠子参 , 产于湖北省神农架林区 , 经宜昌市药
品检验所鉴定。珠子参总皂苷提取方法见参考文献 [ 3] 。在超
净工作台中 ,将珠子参皂苷粉末溶于 RPMI-1640培养基中 , 浓
度为 2 000 μg/ml,经 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后 ,保存于 4℃
冰箱中备用。
1.3　仪器 EPLCSXL-4流式细胞分析系统;Suprafuge22高速
冷冻离心机;GENios多功能酶标仪。
2　方法
2.1　实验分组 阴性对照组(BL组):含 10%胎牛血清的 RPMI
-1640培养液;阳性对照组(ATRA组):加入全反式维甲酸 AT-
RA溶液 , 并使终浓度为含 10 %胎牛血清 100 μg/ml药液(AT-
RA浓度参照文献 [ 4] );珠子参皂苷组(PJ组):加入珠子参皂苷
药液 , 并使终浓度为含 10 %胎牛血清和 800, 400, 200, 100 μg/
ml药液 4个浓度组 ,经过细胞毒实验后 ,确定一个最佳浓度组作
为珠子参皂苷组。以上各组培养液均调整 pH值为 7.2。
2.2　细胞培养 细胞培养方法参照文献 [ 5] 。 HL-60细胞复苏
后在含 10%小牛血清的 RPMI-1640培养液 、5%CO2、 37℃条件
下传代培养 , 至对数生长期后 , 分组 , 加入相应培养基及血清后 ,
调整细胞浓度至 2×105个 /ml。
2.3　细胞毒实验 方法参照文献 [ 6] , 每组一瓶各取细胞悬液接
种于 96孔培养板 ,每组 3板 , 每板设 5个平行孔 , 每孔 100 μl, 分
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别在加入血清后 24, 48和 72 h时加入 20 μlMTT贮液 , 使 MTT
浓度为 0.9 mg/ml, 继续温育 4 h, 超速低温离心 1 000 r/min, 5
min,直接翻板法甩干上清 ,加入 10%SDS100μl/孔 , 振荡 5 min,
摇匀 , 以完全溶解微小紫蓝色结晶 , 迅速于酶标仪 570 nm处测定
各孔吸光度(OD值)。
细胞杀伤率(%)= 1-实验组 OD均值对照组 OD均值 ×100%
2.4　细胞形态学分级 每瓶细胞悬液离心 , 弃上清 ,取沉淀涂片 ,
迅速风干 , Wright-Giemsa染色 10 min, 蒸馏水轻轻冲洗 , 风干
后 , 油镜下观察 ,记数 200个细胞 , 分级标准参照文献 [ 7] 。
2.5　细胞 NBT还原能力检测 细胞培养至对数生长期后 , 将药
物加入细胞悬液中 , 并将细胞终浓度调成 1 ～ 5×105个 /ml,细胞
共分 3组:阴性对照组 、阳性对照组 、珠子参皂苷组 , 培养 72 h
后 , 将各组细胞悬液离心 , 弃上清 , 加入 0.1% NBT溶液 0.5 ml
和 TPA溶液 20μl, 37℃孵育 1 h后 ,各组细胞离心 , 弃上清 ,取沉
淀涂片 , 迅速风干 , Wright-Giemsa染色 10 min, PBS轻轻冲洗 ,
风干后油镜下随机计数 200个细胞 , 细胞内有蓝黑色颗粒者为
NBT阳性细胞 ,计算阳性细胞百分率 。
2.6　FCM细胞周期分析 细胞培养至对数生长期后 ,将药物加入
细胞悬液中 ,再培养 72 h后, 将各组细胞悬液离心 ,弃上清 ,用 PBS
轻轻洗涤 2次 ,并调整细胞浓度为 1～ 5×106个 /ml, 4℃下用 75%
乙醇固定 30min, 含 Rnase及碘化丙啶(PI)染色液染 30 min后上
流式细胞仪检测 DNA含量的变化, 分析细胞周期变化, 并以增殖
指数(proliferationdex, PI)表示药物对细胞分裂增殖的影响。
2.7　资料统计分析方法 数据采用单因素方差分析 , 应用
SPSS10.0在 PC上进行处理。并采用 SNK法进行组间比较。
3　结果
3.1　细胞毒作用 结果见表 1, 可以看出 , 与阴性对照组相比较 ,
药物作用 24, 48, 72 h后 ,珠子参皂苷各不同浓度组和阳性对照组
的 OD值均明显小于阴性对照组 ,且均有显著性差异(P<0.01),
说明珠子参皂苷有抑制 HL-60细胞生长的作用。而且珠子参皂
苷对 HL-60细胞的生长抑制作用随着药物作用时间的延长 , 效
果也随之增强。由于珠子参皂苷对 HL-60细胞抑制作用最低浓
度组作用虽比高浓度组弱 , 但比低 、中浓度组强 ,考虑到药物浓度
过高 ,对细胞有杀伤作用 , 以及有的中药有双向调节作用 ,所以选
择珠子参皂苷最低浓度(100 μg/ml)作为珠子参皂苷浓度 , 以后
所提到的珠子参皂苷组均为珠子参皂苷最低浓度组。
表 1　不同药物在不同时间对HL-60细胞生长的影响( x±s)
组别 OD值
24h 48 h 72 h
细胞生长抑制率(%)
24h 48h 72h
BL 0.637 8±0.048 3 0.675 5±0.016 8 0.707 7±0.026 4 - - -
ATRA 0.240 9±0.017 9＊ 0.219 9±0.021 3＊ 0.197 7±0.013 2＊ 62.23 67.45 72.06PJ1 (100μg/ml) 0.392 5±0.032 3＊ 0.363 6±0.027 2＊ 0.340 7±0.028 2＊ 38.46 46.17 51.86PJ2 (200μg/ml) 0.452 5±0.021 4＊ 0.430 8±0.021 0＊ 0.404 5±0.028 5＊ 29.05 36.23 42.84PJ3 (400μg/ml) 0.400 6±0.021 8＊ 0.384 5±0.028 3＊ 0.360 0±0.036 0＊ 37.19 43.08 49.13
PJ4 (800μg/ml) 0.265 4±0.020 3＊ 0.247 8±0.017 7＊ 0.237 8±0.012 5＊ 58.39 63.32 66.40
　　与阴性对照组比较 , ＊P<0.01;n=5
3.2　细胞形态分级 本次实验显示 ,在药物作用 72 h后 , 光镜下
阴性对照组中的 HL-60细胞呈原始未分化状态 , 体积大而圆 ,
胞浆较少 , 含有少量嗜天青颗粒 , 胞核大 、圆形或椭圆形 , 染色质
细 , 核仁大而圆 ,常为 2 ～ 3个 , 而阳性对照组和珠子参皂苷组的
大部分细胞分化为中 、晚幼粒细胞 ,胞体变小 , 呈圆形或椭圆形 ,
胞核小 , 核仁减少或消失 ,核染色质变粗 ,核 /浆比例下降 , 胞浆中
出现特异性颗粒 ,部分呈杆状核和分叶核细胞 , 见图 1 ～ 5。各组
细胞形态分化率见表 2, 从此表可以看出 , 与阴性对照组相比 , 阳
性对照组和珠子参皂苷组的早幼粒细胞比值明显下降(P<0.
01);而中幼粒细胞和晚粒细胞比例都明显增高(P<0.01),且出
现杆状核或分叶核细胞 ,说明 HL-60细胞在珠子参皂苷作用下
从形态学方面向成熟细胞方向的改变。
表 2　不同药物对 HL-60细胞形态学影响( x±s)
组别 早幼粒 中幼粒 晚幼粒 杆状及分叶核 诱导分化率(%)
BL 0.915±0.020 0.056±0.010 0.029±0.029 - 8.5
ATRA 0.280±0.035＊ 0.368±0.113＊ 0.303±0.129＊ 0.049±0.012 72.0
PJ 0.329±0.035＊ 0.299±0.046＊ 0.304±0.042＊ 0.068±0.028 67.1
　　与阴性对照组比较 , ＊P<0.05;n=5
图 1　早幼粒细胞(阴性对照组)　　图 2　中幼粒细胞(珠子参皂苷组)
图 3　晚幼粒细胞(珠子参皂苷组)　　图 4分叶核细胞(珠子参皂苷组)
3.3　NBT细胞还原能力 由表 3可以看出 , 药物作用 72 h后 , 阳
性对照组 NBT阳性细胞占 73.9%, 珠子参皂苷组 NBT阳性细胞
占 62.3%, 与阴性对照组(7.1%)相比较 , 阳性对照组和珠子参
皂苷组 NBT阳性细胞均明显增多(P<0.01)。说明 HL-60细
胞在珠子参皂苷的作用下 , 在功能和生化学变化方面向成熟细胞
方向的改变。
图 5　分叶核细胞(珠子参皂苷组)
表 3　不同药物对 HL-60细胞 NBT还原能力的影响( x±s)
组别 每组记数细胞 NBT还原能力
BL 200 0.071 0±0.009 6
ATRA 200 0.739 0±0.015 6＊
PJ 200 0.623 0±0.028 0＊
　　与阴性对照组比较 , ＊P<0.05;n=5
3.4　 FCM周期分析 流式细胞仪检测结果表明 , 在药物作用 72
h后 , 阳性对照组和珠子参皂苷组的 G0 /G1 期细胞都增多(61.78%, 48.62 %), S期细胞都减少(18.42 %, 30.38 %), 与
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阴性对照组(39.64 %, 37.52 %)相比有显著性差异(P<0.01)。
说明珠子参皂苷和 ATRA都可使 HL-60细胞阻断在 G0 /G1期 ,
使 DNA合成受抑制 , 从而干扰了HL-60细胞在细胞周期中的进
程。结果见表 4。而且从增殖指数的变化可以看出 , 珠子参皂苷
可以抑制细胞增殖。 DNA含量分布图见图 6。
表 4　不同药物对 HL-60细胞周期影响( x±s) %
组别 G0 /G1 S G2 +M PI值
BL 39.64±2.98 37.52±3.40 22.84±1.32 96.61
ATRA 61.78±4.08＊ 18.42±3.30＊ 19.8±1.71＊ 46.85PJ 48.62±2.38＊ 30.38±2.03＊ 21.00±0.97 73.80
　　与阴性对照组比较 , ＊P<0.01
a-阴性对照组　b-阳性对照组　c-珠子参皂苷组
图 6　DNA含量分布图
4　讨论
HL-60细胞最大特点是在分化诱导剂作用下可向粒细胞系
统或巨噬细胞系统两个方向分化 ,广泛应用于分化诱导剂的寻找
和分化诱导剂的作用机理研究 。本实验结果表明 ,珠子参皂苷对
HL-60细胞的生长有抑制作用 , 其特点有两点:①对 HL-60细
胞的生长抑制作用与珠子参皂苷作用的时间存在依赖性 , 随着作
用时间的延长 , 其抑制作用增强。 ②对 HL-60细胞的生长抑制
作用与珠子参皂苷的剂量不存在依赖性 ,随着珠子参皂苷浓度的
加大其抑制作用并没有加强 , 其机理可能与中药的双向调节有
关 ,有待进一步研究。
珠子参皂苷诱导 HL-60细胞分化的作用主要有以下两个
方面的表现 :
①形态学方面:成熟的白细胞由造血干细胞分化而来 , 粒细
胞一般按原始粒细胞———早幼粒细胞———中幼粒细胞———晚幼
粒细胞———杆状核及分叶核细胞逐渐分化成熟。 本次实验的结
果表明 ,药物作用 72 h后 , HL-60细胞在珠子参皂苷作用下从
形态学方面向成熟细胞方向的改变。 ②功能和生化学方面:正常
的中性粒细胞或分化的细胞 , 在 TPA(佛波酯)的激发下 , 细胞内
超氧阴离子产生增多 , NBT在分化细胞中接受由 NADPH来的
氢 ,还原为不溶性的蓝黑色颗粒 ,可在显微镜下清楚看到着色斑。
本次实验的结果表明 , 药物作用 72 h后 , 与阴性对照组相比 , 珠
子参皂苷组的 NBT阳性细胞(62.3%)明显增多 , 有显著性差异
(P<0.01),说明 HL-60细胞在珠子参皂苷的作用下 , 在功能和
生化学变化方面向成熟细胞方向的改变。
流式细胞仪是当前较先进的技术 , 它能快速 、准确 、简便地分
析细胞周期各时相分布 , 本次实验应用 FCM分析细胞周期 ,结果
表明 ,在药物作用 72 h后 , 珠子参皂苷组的 G
0
/G
1
期细胞增多
(48.6%), S细胞减少(30.38%), 与阴性对照组相比较 , 有显著
性差异。说明珠子参皂苷可以使 HL-60细胞被阻断在 G0 /G1
期 ,阻止细胞进入 S期 , 使 DNA合成受抑制 , 减少细胞增殖。 也
可能是由于细胞分化成熟 , 不再增殖。 有人认为在细胞周期的
G1期可能存在控制细胞周期的限制点(RP),珠子参皂苷通过阻
止这一位点 , 可能会使细胞从增殖走向分化。
参考文献:
[ 1 ] 　国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部 [ S].北京:化学工业出版社 , 2005:192.
[ 2 ] 　赵　仁 ,赵　毅 ,李东明 ,等.珠子参的研究进展 [ J] .中国现代中
药 , 2008, 10(7):3.
[ 3 ] 　朱新华 ,后文俊 ,李存德.珠子参总皂甙对脾细胞增殖效应影响的
研究 [ J].昆明医学院学报 , 1994, 15(1):65.
[ 4 ] 　李勤喜 ,刘颖梅 ,李一志, 等.维甲酸抗肿瘤作用的研究进展 [ J] .
甘肃教育学院学报 , 1999, 3(2):41.
[ 5 ] 　鄂　征.组织培养和分子细胞学技术 [ M] .北京:北京出版社 ,
1995:133.
[ 6 ] 　朱立平 ,陈学清.免疫学常用实验方法 [ M] .北京:人民军医出版
社 , 2000:193.
[ 7 ] 　韩　锐.抗癌药物研究与实验技术 [ M] .北京:北京医科大学中国
协和医科大学联合出版社 , 1997.
收稿日期:2009-04-02;　修订日期:2009-08-07
基金项目:贵州省中医药管理局资助课题(No.[ 2007] 205)
作者简介:肖家翔(1956-),男(汉族),贵州兴义人 ,现任贵阳中医学院附
属第一医院主任医师 ,硕士学位 ,主要从事眼表及眼底疾病中西医诊治研
究工作.
石芍护睛散抗实验性干眼病角结膜细胞凋亡的研究
肖家翔 ,杨建修
(贵阳中医学院附属第一医院 ,贵州 贵阳　550001)
摘要:目的 观察石芍护睛散对实验性干眼病角结膜细胞凋亡的影响。方法 对新西兰白兔采用睑板腺开口烧灼及紫外
线照射造模 , 造模成功后随机分组 , 中药组给予石芍护睛散口服 , 与空白组及西药组对照 , 取角结膜切片 , 记录凋亡细胞
所占的比例。结果 中药组细胞凋亡明显少于空白对照组 , 亦少于西药组。结论 石芍护睛散对干眼病角结膜细胞凋亡
有显著抑制作用。
关键词:石芍护睛散;　干眼病;　细胞凋亡
中图分类号:R77　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)04-0833-02
　　干眼病(dryeyesyndrome)是眼科临床极为常见的眼表疾病。
它是指各种原因引起泪液质和量 、或动力学的异常 ,导致泪膜不
稳定和角膜的损害并伴有一系列眼部不适 , 其主要特征为眼干
燥 、异物感 、畏光 、视疲劳或视物模糊 、或视力波动等 ,重者可引起
视力障碍 ,甚至失明 , 造成视力下降的主要原因是眼表角结膜细
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