全 文 ：159天津医药 2004年 3月第 32卷第 3期
*吉林省延边朝鲜族自治州科技发展计划项目 (项目编号:
2003YBK J027)
作者单位:133000 延边大学医学院 (张学武 , 金香子 , 陈丽
艳);吉林省延边脑科医院(金艳华);吉林省延吉市医院(金英淑)
珍珠梅提取物对大鼠肝脏化学致癌前
病变抑制作用的实验研究 *
摘要 目的:研究珍珠梅提取物对二乙基亚硝胺(DEN)致癌初期的抑制作用 。方法:动物腹腔注射给药 , 用
DEN 制备大鼠肝脏化学致癌初期模型 ,分为模型组 、治疗组 、正常对照组 。模型组和治疗组注射 DEN ,对照组注射
等体积生理盐水 。用免疫组织化学 SP 法检测 3组大鼠肝脏 c_myc 、p53和 bcl_2的表达水平 ,用比色分析法检测血
清 、肝匀浆 、线粒体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(M DA)含量的变
化 。结果:珍珠梅提取物能显著降低治疗组大鼠肝脏 bcl_2 、突变型 p53的表达 , 与对照组比较差别有统计学意义
(P <0.05或 P<0.01), 而对 c_myc的表达无明显影响;治疗组 SOD 、GSH_Px 的活性高于模型组 , 而 MDA 含量
低于模型组(P <0.05或 P <0.01)。结论:珍珠梅提取物对 DEN 致大鼠肝脏癌变初期有抑制作用 ,其作用机制可
能与下调 bcl_2和突变型 p53蛋白的表达及清除自由基有关 。
关键词 珍珠梅 肝 癌前状态 大鼠
张学武 金香子 陈丽艳 金艳华 金英淑
Inhibitory Effect of Sorbar ia Sorb ifolia Extract on Diethylnit rosamine_Induced Hepat ic
Precancerous Lesion in Rats
ZHANG Xuew u , JIN Xiangzi ,CHEN Liyan , JIN Yanhua , JIN Yingshu
Yanbian U niversity College of Med ici ne , Y anbian 133000 , Ch ina
Abstract Object ive:To investiga te the inhibitory ef fect o f so rbaria so rbif olia ex t ract on diet hy lnit rosamine
(DEN)-induced hepa tic precancerous lesion in ra ts.Methods:The sorbaria sorbifolia ex t rac t w as administ rated
to the ra ts with DEN -induced precarcinogenesis and t he p53 , c-myc and bcl-2 pro teins were de tected by
immunohistochemical SP method.The activitie s o f superox ide dismut ase(SOD), g lutathione peroxidase(GSH-
Px)and the concentrations of m alondialdehyde(M DA)w ere investiga ted by co lo rimet ric met hod.Results:In
se rum , live r cell homogena te and liver cell mitochondria ,t he sorbaria so rbifolia decreased the expression o f bcl-
2 and m utant p53 proteins and the level o f M DA , and increased the activitie s of SOD and GSH-Px significantly
(P <0.05 or P <0.01).Conclusion:T he sorbaria so rbifo lia ex t ract has the inhibito ry e ffect on DEN -induced
hepatic precancerous lesion in rats.The mechanism may be related to the regulation of expression of bcl_2 , mu-
tant p53 protein and the clearance of f ree radicals.
Key words so rbaria so rbif olia live r precancerous conditions rats
珍珠梅(So rbaria so rbifolia)属蔷薇科植物 , 有
活血化瘀 ,消肿止痛 ,治骨折及跌打损伤的作用。从
中分离出胡萝卜苷 、甲基黄酮类化合物 、大黄素及
原儿茶酸等化学成分 [ 1 ] , 其乙酸乙酯提取物能使四
氯化碳肝损伤大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性
降低 、肝线粒体琥珀酸脱氢酶活性升高 , 抑制肝匀
浆脂质过氧化物的生成 [ 2] , 对小鼠 S 180肉瘤生长有
抑制作用[ 3] 。本研究探讨珍珠梅乙酸乙酯提取物对
二乙基亚硝胺(DEN)致癌初期大鼠肝脏 p53 、bcl-
2 、c_myc表达的影响 ,以及超氧化物歧化酶(SOD)、
谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH_Px)的活性及丙二醛
(MDA)含量的变化 , 旨在阐明珍珠梅的抗肿瘤作
用及可能机制 ,为开发珍珠梅提供实验数据 。
1 材料与方法
1.1 材料 (1)珍珠梅生物活性成分的制备:珍珠梅茎 、叶 、
花 , 采集于吉林省延吉市市郊 , 经延边大学药学院刘永镇教
授鉴定为正品 。乙酸乙酯提取物将乙酸乙酯分 3次浸泡珍珠
梅 ,温度为 40 ℃,每次 12 h ,合并 3次滤液 ,用旋转蒸发器减
压浓缩 ,获珍珠梅乙酸乙酯提取物浸膏(1 g 珍珠梅有效成分
相当于 33.3 g 生药), 主要成分为黄酮类化合物 。(2)试剂:
DEN 、乙酰氨基芴系 Sigma 公司产品;c_myc , p53 , bcl-2及
S P 试剂盒均为福建迈新生物技术开发公司产品 ;SOD 、
M DA 、GSH_Px 试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;其
他试剂均为国产分析纯 。(3)动物:Wist ar 雄性大鼠 ,普通级 ,
体质量 180 ～ 200 g ,由延边大学医学院动物科提供 。
1.2 方法
1.2.1 方法 取 36只Wista r 雄性大鼠随机分为正常对照
组 、模型组 、治疗组 3个组 ,每组 12只 。按 Yin等 [4 ]报道的略
改良的 Solt_Farber 氏方法制作大鼠肝脏癌前病变模型 。对
照组腹腔注射生理盐水 ,模型组和治疗组腹腔注射 DEN , 剂
量为 200 m g/kg , 2周后 , 模型组和治疗组在饲料中添加
0.008%乙酰氨基芴(AAF),同时治疗组按 6.6 g/kg 剂量每
天连续灌胃珍珠梅乙酸乙酯提取物 。注射 DEN3周后进行肝
脏部分切除术 。3组大鼠共饲养 8周后全部处死 ,采取血液并
分离血清 ,测定 SOD 、GSH_Px 的活性及M DA 的含量 。立即
称取 1.0 g 新鲜肝组织放入置有冰冷的匀浆介质(pH=7.5 ,
0.25 m ol/L 蔗糖 , 0.005 mol/L Tris_HCl , 0.001 mol/L
EDTA)的玻璃匀浆器中 , 在冰浴中制成 100 g/L 匀浆 , 在
2 000×g 下离心 10 min , 取上清液 , 为肝匀浆 , 测定 SOD 、
GSH_Px 的活性及M DA 的含量 ;采用低温超速离心机以
16 000×g 离心 20 min , 取其沉淀部分 , 即为线粒体 ,再加入
匀浆介质 , 用超声波打碎线粒体膜性结构 , 制成线粒体悬浮
液 ,测定 SOD 、GSH_Px 的活性及M DA 的含量 。剩余肝脏标
本用中性福尔马林固定 ,石蜡包埋 , 5μm 连续切片 。用免疫
组织化学染色方法 , 按 SP 试剂盒说明书检测 c_myc 、p53和
bcl_2蛋白 。实验过程模型组大鼠死亡 3只 ,治疗组大鼠死亡
1只 。
1.2.2 结果判定 c_myc 、 p53阳性者为细胞核有棕黄色颗
粒;bcl_2阳性者为细胞膜或细胞浆有棕黄色颗粒 。c_myc、
bcl_2和 p53蛋白表达强度 , 根据阳性物质着色深浅及阳性
细胞数的多少分为 4级:无阳性细胞或阳性细胞少于 10%或
背景同空白对照者为(-);每张切片<25%的细胞明显呈阳
性为弱阳性 (+);25%～ 50%细胞明显呈阳性为阳性
(++);>50%细胞呈阳性为强阳性(+++)。
1.3 统计学处理 应用 SPSS 10.0统计软件进行方差分
析 、秩和检验 ,两两比较用 q检验 。
2 结果
2.1 珍珠梅对大鼠肝脏化学致癌初期对大鼠肝脏
c_myc 、 p53和 bcl_2表达的影响 模型组与对照组
比较 c_my c 、p53和 bcl_2表达差别有统计学意义(P <
0.05或 P <0.01);治疗组与模型组比较 p53 和
bcl_2表达差别有统计学意义 (P <0.05 或 P <
0.01),但 c_myc表达差别无统计学意义 ,见表 1。
2.2 珍珠梅对大鼠肝脏化学致癌初期对血清 、 肝
匀浆 、肝线粒体 SOD 、MDA 、GSH_Px 的影响 模
对照组(1)
模型组(2)
治疗组(3)
H
t 1:2
1:3
2:3
12
9
11
0
3
2
0
2
2
0
1
0
12
4
7
0
2
2
0
2
2
0
1
0
9
2
7
12
3
7
n
p53蛋白表达
- + ++ +++
c_myc蛋白表达
- + ++ +++
bcl_2蛋白表达
- + ++ +++
2
2
2
0
1
1
表 1 3组大鼠肝脏 c_myc 、p53和 bcl_2表达比较
型组与对照组和治疗组比较 ,血清 、肝匀浆 、肝线粒
体 SOD 、GSH_Px 活性降低 , MDA 含量升高 , 差别
有统计学意义(P <0.05或 P <0.01),见表 2 ～ 4。
1
4
1
7.65**
2.62*
0.58
1.94*
4.33**
2.12*
1.46
1.15
9.78**
2.40*
0.56
2.78**
(x ±s)
n
SOD
(U/L)
GSH_P x
(U/L)
M DA
(nmol/L)
对照组(1)
模型组(2)
治疗组(3)
F
q1:2
1:3
2:3
12
9
11
131.4±38.9
92.6±42.7
126.7±27.3
3.632*
7.352**
2.154
9.325**
0.8±0.1
1.1±0.1
0.8±0.1
5.882**
5.230**
1.346
8.170**
28.6±5.7
16.2±3.7
26.8±6.2
12.069**
4.998**
2.116
4.997**
表 2 3组大鼠血清 SOD 、M DA 和 GSH_Px 水平比较
(x ±s)
n
SOD
(U/L)
GSH_P x
(U/L)
M DA
(nmol/L)
35.1±10.7
15.4±1.9
36.2±16.4
5.895**
4.997**
1.462
10.231**
1.2±0.3
1.6±0.2
0.9±0.4
5.224**
10.237**
2.054
8.459**
12
9
11
对照组(1)
模型组(2)
治疗组(3)
F
q1:2
1:3
2:3
表 4 3组大鼠肝细胞线粒体 SOD 、M DA 和
GSH_Px 水平比较
153.4±56.1
135.1±31.9
144.1±45.4
3.476*
10.322**
1.770
9.387**
n
SOD
(U/L)
GSH_Px
(U/L)
MDA
(nmol/L)
35.7±9.2
26.2±5.7
31.4±6.6
5.895**
4.997**
1.444
10.218**
1.0±0.2
1.5±0.1
0.7±0.3
7.236**
4.763**
2.025
8.834**
12
9
11
对照组(1)
模型组(2)
治疗组(3)
F
q1:2
1:3
2:3
72.9±39.8
49.8±14.0
61.3±6.7
11.554**
3.89*
8.889**
9.632**
表 3 3组大鼠肝匀浆 SOD 、M DA 和 GSH_Px 水平比较
160 T ianjin M ed J , Mar 2004 , Vol 32 No 3
P<0.05, P<0.01* **
(x ±s)
* **P<0.05, P<0.01
* **P<0.05, P<0.01
* **P<0.05, P<0.01
161天津医药 2004年 3月第 32卷第 3期
国外医学动态
阿司匹林对未治疗的高血压患者血压的服用时间依赖性作用
(胡 立 摘译自:Hy perten s , 2003 , 41:1259)
自从发展高血压最佳治疗(HOT)研究结果说明小剂量
阿司匹林有预防高血压患者发生主要心血管事件的效果之
后 , 人们预期高血压患者应用阿司匹林会增多 。最近的研究
表明小剂量阿司匹林药物疗法对高血压患者的血压无影响 ,
至今的临床试验也极少注意此药的潜在的昼夜规律依赖性
效用 。
Hermida等进行一项试点研究 , 调查未治疗的高血压患
者在其 1 d休息—活动周期的不同时间服用阿司匹林情况
下阿司匹林对患者的血压影响 。
研究者们将 100例未治疗的轻型高血压患者 [男 34例
和女 66例 ,年龄(42.3±11.6)岁] 随机分为 3组:推荐的非
药物保健膳食;同样的推荐膳食和睡醒服用阿司匹林(每日
100 m g);或同样的推荐膳食和睡前服用阿司匹林 。干预 3个
月前后 , 在连续 48 h内 ,日间每 20 min钟测血压 1次 , 晚间
每 30 min测血压 1次 。应用人群多成分分析法(popula tion
multiple-component analysis)确定每组血压的昼夜情况 。
经过 3个月之后 , 非药物干预组的血压降低不明显 (<1.1
mmH g , P > 0.05)。睡醒服阿司匹林者血压无变化 (P =
0.229)。然而 ,睡前服阿司匹林者血压降低非常显著(收缩压
和舒张压分别降低 6和 4 mmHg , P <0.01)。
研究结果表明 , 小剂量阿司匹林对未治疗的轻型高血压
患者在统计学上有明显的服药时间依赖性效果 。此项研究所
指出的阿司匹林对血压的影响表明 , 在合用阿司匹林与抗高
血压药治疗的患者中 ,对阿司匹林的效果应当定量和监控 。
3 讨论
c_myc 、 bcl_2和 p53是近年来研究肿瘤细胞凋
亡的基因 [5 ]。bcl_2基因能使细胞长期存活 , 抑制细
胞凋亡 , 产生恶性细胞克隆 。野生型 p53能监控细
胞内 DNA 的状态 ,防止突变或受损的 DNA 复制与
转录 , 促进受到改变的细胞凋亡 , 保证细胞按细胞
周期生长 , 野生型 p53基因在抑制恶性增殖过程中
起着重要的作用 , 其编码蛋白可促进药物诱导的肿
瘤细胞凋亡。它在恶性肿瘤中多产生突变 , 形成突
变型 p53蛋白 , 从而失去对恶性肿瘤的控制 , 突变
型 p53蛋白可以通过免疫组织化学方法检出。原癌
基因 c_myc属细胞核调节性蛋白质。由染色体易位
而成为癌基因 , 编码转录因子 , 对生长因子的刺激
起反应 , 推动细胞增殖而致癌。有研究提示 , c_myc
原癌基因的超常表达出现于癌前病变阶段 [6 ]。本实
验结果显示 , 治疗组 bcl_2 、突变型 p53的阳性表达
显著低于模型组 , 说明珍珠梅提取物可能起到下调
原癌基因表达的作用 , 促进细胞凋亡 , 这可能是珍
珠梅抑瘤作用的机理之一 。c_myc在模型组 、治疗组
中均有表达 , 但组间差别无统计学意义 , 至于原因
可能是珍珠梅抗癌作用机制与 c_myc表达无关或
在本次实验中未得到证实 , 有待于今后实验进一步
研究 。
现已证明 , 在癌变的诱发和促发阶段均有自由
基参与[ 7]。各种诱癌因素和促癌因素通过各自的转
化途径 , 终使自由基水平增加 , 从而参与癌变过
程 。SOD 、GSH_Px 是属于体内消除自由基和脂质过
氧化物的酶类 , 与体内其他酶类及抗氧化剂组成一
个自由基的防御系统 , 以清除过多的自由基 , MDA
是自由基代谢的产物。本实验治疗组 SOD 、GSH_Px
活性均显著高于模型组 , 而 MDA 含量显著低于模
型组。说明珍珠梅可以通过清除自由基抑制肿瘤的
生长 , 这可能是珍珠梅抑制肿瘤生长的另一个重要
机制。
参考文献
1
2
3
4
5
6
7
(2003_08_14收稿 2003_09_24修回)
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