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暗褐网柄牛肝菌是外生菌根菌吗/——暗褐网柄牛肝菌与思茅松和栲树的菌根合成



全 文 :食用菌学报2016.23(1):37~41
收稿日期:2015-12-15原稿;2016-01-15修改稿
基金项目:云南省热带作物科技创新体系建设专项资金(RF2015-5)、云南省科研院所技术开发专项(2015DC014)、
中国科学院“西部之光”人才培养项目(326)、云南省应用基础研究计划项目(2013FZ168)、景洪市科技三
项费项目(2013.46)资助
作者简介:张春霞(1981-),女,2005年毕业于西北农林科技大学,副研究员,主要从事暗褐网柄牛肝菌研究。 
E-mail:zhangchunxia7084@163.com
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2016.01.008
暗褐网柄牛肝菌是外生菌根菌吗?
———暗褐网柄牛肝菌与思茅松和栲树的菌根合成
张春霞,何明霞,曹 旸,刘 静,高 锋,许欣景,王文兵,王 云
(云南省热带作物科学研究所,云南景洪666100)
摘 要:在野外生态调查中,笔者从未发现暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)和任何树木根系形成外生
菌根的结构。为了进一步证实暗褐网柄牛肝菌是否为外生菌根菌,在温室条件下,用暗褐网柄牛肝菌栽培种
和液体种对思茅松(Pinus kesiyavar.langbianensis)和栲树(Castanopsis sp.)进行菌根接种试验。接种5个
月后,思茅松一、二级侧根及吸收根表面上,均有大量暗褐网柄牛肝菌菌丝缠绕生长;菌丝有锁状联合,但是并
没有菌丝套和哈氏网发育的迹象。接种10个月后有大量暗褐网柄牛肝菌菌丝也缠绕在栲树根的表面,有发
达的菌索;菌丝有锁状联合,呈结晶体状,但没有任何菌根结构形成。在同样的温室条件下,思茅松和印度块
菌形成了典型的外生菌根。结果表明,暗褐网柄牛肝菌在室内接种条件下也不能与思茅松和栲树形成外生菌
根。因此,暗褐网柄牛肝菌可能不是一种外生菌根菌。
关键词:暗褐网柄牛肝菌;思茅松;栲树;菌根合成
暗褐网柄牛肝菌 (Phlebopus portentosus)隶属于伞菌纲(Agaricomycetes)、牛肝菌目(Boletales)、小牛
肝菌科 (Boletinelaceae)、网柄牛肝菌属 (Phlebopus)[1]。国内主要分布在云南和四川,广西和海南也
有分布;国外分布于泰国和斯里兰卡,越南、印度尼西亚、澳大利亚、新西兰、墨西哥、阿根廷、哥伦比亚、
巴西、南非、刚果和马达加斯加等国家有近似种的分布[2-4]。
牛肝菌目中的大多数科属的食用菌都属于外生菌根菌,需要用合成菌根苗的方法进行人工栽培,
但是,成功先例很少。乳牛肝菌(Suillus spp.)是一个例外,在国内外都有应用菌根接种技术,成功栽
培褐环粘盖牛肝菌的例子[5-6]。对于暗褐网柄牛肝菌及其近似种的营养方式,是共生(外生菌根菌)或
腐生还是兼生,众说纷纭。SINGER(1986)和 WATLING (2001)等认为可能是一种外生菌根菌,但并
未做菌根合成的实验来证实他们的认知[2-3]。SANMEE(2010)等用卡西亚松(Pinus kesiya)等五种植
物做寄主,在温室内接种暗褐网柄牛肝菌,结果仅卡西亚松形成了有菌丝套和哈氏网的外生菌根,他们
认为暗褐网柄牛肝菌可能是一种兼生的外生菌根菌[7]。
暗褐网柄牛肝菌近缘种的菌根状态也有一些不同的报道。越南的PHAM等发表了一个和暗褐网柄
牛肝菌十分相近的新种Phlebopus spongiosus,并在实验室内接种柚子(Citrus maxima)苗,产生了有菌丝
套结构的根,认为网柄牛肝菌是外生菌根,并称这种菌根是“菌鞘菌根”(sheathing mycorrhiza)
[8]。
Phlebopus bruchi 是分布在阿根廷等国的一种食用的网柄牛肝菌,自然环境下常和阿根廷花椒(Fagara
coco)生长在一起,曾被认为是一种外生菌根菌,但是温室接种试验证明P.bruchi 并不是外生菌根菌,而
是内生菌根真菌[9]。
为了探索人工栽培暗褐网柄牛肝菌的方法,笔者对其生物学特性进行了调查研究,发现它生长在
多种植物附近,起初认为它可能是一种外生菌根菌[10],但是随着研究的深入,在温室和菇房内用栽培
腐生菌的方法成功培养出暗褐网柄牛肝菌子实体,开始怀疑暗褐网柄牛肝菌的菌根状态,认为它可能
是一种腐生菌[11],而且还发现了暗褐网柄牛肝菌和昆虫(粉蚧)有共生的关系,开始认识到其营养方式
食 用 菌 学 报 第23卷
比人们认识到的内容复杂[12-13]。通过对暗褐网柄牛肝菌进行菌根合成试验,探讨其是否为一种外生菌
根菌,是笔者研究了解暗褐网柄牛肝菌复杂营养方式的一项重要内容。
1 材料与方法
1.1菌株及树种
  暗褐网柄牛肝菌 (P.portentosus)10003菌株,从西双版纳州景洪市大勐龙镇东风柚子园中的暗
褐网柄牛肝菌的子实体中经组织分离获得,由中国科学院昆明植物研究所杨祝良研究员鉴定。思茅松
(Pinus kesiyavar.langbianensis)种子购自云南省种苗站,栲树(Castanopsis sp.)种子采自景洪市大
兴集贸市场。
1.2培养基质
  M1培养基:20g葡萄糖,1g酵母膏,1g KH2PO4,1.5g MgSO4·7H2O,200g去皮马铃薯,20g
琼脂,1LH2O。
M1培养液为 M1培养基去掉琼脂。
栽培种培养料:70%橡胶木锯木屑,28%谷粒,1% MgSO4,1% KH2PO4,(55±2)%含水量,pH
4.0~5.0。
盆栽基质1:草炭,蛭石,牛粪,菜园土(1∶1∶1∶1,v/v v/v),pH 5.5。
盆栽基质2:生红土,河沙,粉末状的椰子树皮(2∶2∶1,w/w/w),pH 5.5。该基质为SANMEE
(2010)等用暗褐网柄牛肝菌接种卡西亚松等五种植物的基质配方[7]。
1.3无菌苗培养
  组培瓶(直径5.5cm,高9cm)底部铺一层滤纸,用自来水浸湿,封口膜封好。高压灭菌(121℃、
30min),冷却后待用。种子用自来水冲洗1h,30% H2O2浸泡15min,同时不断摇动,然后用2L无菌
水清洗干净,放入组培瓶,置于26℃条件下黑暗培养。每天检测2次,剔除污染的种子。塑料花盆(直
径30cm、高27cm)用0.5%高锰酸钾消毒处理。珍珠岩用水预湿后高压灭菌(121℃、90min),装入
花盆,移入萌发的无菌的思茅松和栲树种子,温室自然条件下培育无菌苗。
盆栽基质1和盆栽基质2经121℃高压灭菌2h,装入塑料花盆(直径15cm、高12cm),待思茅松
和栲树长至3~5条侧根时,移栽到装有上述各基质的花盆中,每盆1株。移栽思茅松至基质1中50
盆、基质2中20盆,移栽栲树至基质1中20盆。
1.4暗褐网柄牛肝菌接种思茅松实验
1.4.1菌种培养
  液体种:供试菌株10003在装有 M1培养基的斜面试管上培养,待菌丝长满斜面后,取菌丝块接入
M1培养液中,131r/min振荡培养10d,得到液体菌种。
栽培种:用搅拌机将栽培种培养料拌匀后装入高密度聚丙烯菌袋(17cm×35cm),高压灭菌
(121℃、2h),然后将液体菌种30mL接入菌袋,培养50d得到暗褐网柄牛肝菌栽培种。
1.4.2接种实验
  待思茅松长出5~6条侧根,每条侧根有数个吸收根时进行接种试验。将暗褐网柄牛肝菌
(P.portentosus)菌种分别接种至盆栽思茅松根系,以盆栽基质1中不接种为对照,设6个处理,每处
理接种10盆,共计70盆。
以盆栽基质1设4个处理。
称取暗褐网柄牛肝菌栽培种60g,将其掰成3~4cm的小块接入思茅松根系附近(G1-1);将暗褐
网柄牛肝菌栽培种121℃高压灭菌2h,得到灭活菌种,称取灭活菌种60g,将其掰成3~4cm的小块接
入思茅松根系附近(G1-2);用灭菌纱布过滤液体菌种、无菌水冲洗干净,获得菌丝球,按每株90mL液
体菌球接入盆栽思茅松根系(G1-3);将液体菌种121℃高压灭菌30min,得到灭活菌种,用灭菌纱布过
滤,无菌水冲洗干净,获得菌球,按每株90mL液体菌球接入盆栽思茅松根系(G1-4)。
以盆栽基质2设两个处理G2-1和G2-2,菌种选用和接种方法分别同G1-1和G1-2。
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第1期 张春霞,等:暗褐网柄牛肝菌是外生菌根菌吗?———暗褐网柄牛肝菌与思茅松和栲树的菌根合成
1.4.3观察树苗和菌丝生长及菌根感染情况
  接种后注意观察树苗生长状况和菌根发育情况。随机取样部分幼苗,仔细洗去根表泥土,在Leica
解剖镜下观察根系上菌丝生长情况和有无菌根形成。同时取吸收根样品,用YD-202Ⅲ冷冻切片机切
片(浙江金华益迪医疗设备厂)切片,在Leica显微镜DM4000B下观察有无菌根结构形成。
1.5暗褐网柄牛肝菌菌种接种栲树实验
  待栲树根系长出5~6条侧根,每条侧根有数个吸收小根时,称取暗褐网柄牛肝菌栽培种60g,将
其掰成3~4cm的小块接入栲树根系附近,接种至基质1中10盆,对照10盆,观察方法同1.4.3。
2 结果与分析
2.1暗褐网柄牛肝菌接种思茅松试验结果
2.1.1暗褐网柄牛肝菌菌种对思茅松根系的生长影响
  接种5个月后,G1-1、G1-3、G2-1思茅松苗长势正常,根系生长发育良好(封二图1)。显微镜下观
察结果表明,在有菌丝生长的根系上有较多的二叉分枝结构形成(封二图2),而远离菌种无菌丝生长的
根上无二叉分枝。尽管有菌丝生长的根没有外生菌根结构形成,但是暗褐网柄牛肝菌菌种对思茅松根
系的生长有刺激作用。G1-2、G1-4、G2-2及对照松苗长势明显较差,根系和地上部分均发育不良(封二
图1)。
2.1.2思茅松根系上暗褐网柄牛肝菌菌丝生长情况
  G1-1和G2-1,接种20d后,均有暗褐网柄牛肝菌子实体发生(封二图3),说明盆栽基质1和基质2
均适合暗褐网柄牛肝菌菌丝生长,从而形成子实体。接种5个月后,每个处理随机抽样检查5株树苗
的根系,结果表明:无论G1-1和G2-1的思茅松接种的固体栽培种,还是G1-3接种的液体菌种,接种的
思茅松一、二级侧根及吸收根表面上,均有大量暗褐网柄牛肝菌菌丝缠绕生长,菌丝有锁状联合(封二
图4和封二图5)。对有菌丝缠绕的吸收根进行切片,显微镜下观察,未见有菌丝套和哈氏网结构发育
(封二图6)。也就是说暗褐网柄牛肝菌与思茅松未形成外生菌根。G1-2、G1-4、G2-2及对照思茅松根
系都未见有暗褐网柄牛肝菌菌丝生长。这表明无论是接入暗褐网柄牛肝菌液体种还是固体栽培种,只要
是活的菌种,暗褐网柄牛肝菌菌丝均能在基质和思茅松根系表面生长,虽然没有菌根结构形成。接种
10个月后再次检查,仍未发现任何菌根结构形成,和接种5个月抽查结果一致。
2.2栲树根系上暗褐网柄牛肝菌菌丝生长情况
  接种10个月后随机抽样检查暗褐网柄牛肝菌菌丝生长发育和栲树根系,发现大量暗褐网柄牛肝
菌菌丝缠绕在根的表面(封二图7),其中有发达的菌索(封二图8)和结晶体菌丝,菌丝有锁状联合(封
二图9),但没有任何菌根结构的形成;暗褐网柄牛肝菌与栲树也未形成菌根,对照也没有菌丝生长。
3 讨论
  泰国报道暗褐网柄牛肝菌 (P.portentosus)是一种兼性外生菌根菌,是依据在温室接种盆栽卡西
亚松(Pinus kesiya)实验中,发现暗褐网柄牛肝菌与思茅松形成了外生菌根[7],可是根据文章中给出的
图片(Fig.4a),形态图中的卡西亚松的叉状分叉小根十分瘦弱细长,没有加粗膨胀,表面粗糙,似有根
毛,是典型的未被感染的松树小根的形态,和松树外生菌根的形态不符。另一张小根切片图,虽然可以
看到一些菌丝长在根的表层细胞间隙中,但是哈氏网似有非有,和典型的哈氏网相去甚远[14]。越南的
PHAM (2012)和日本学者等报道的P.portentosus的相近种P.spongiosus与柚子(C.maxima)形
成的所谓“菌鞘菌根”[8],并不能认为是真正的外生菌根,因为它没有哈氏网的发育,缺乏外生菌根最根
本的结构。柚子是典型的丛枝状菌根(AM)树木,不可能形成任何的外生菌根[15]。正像NOUHRA等
(2008)的文章中证明P.bruchii不能和阿根廷花椒形成外生菌根一样,因为阿根廷花椒也是一种丛枝
状菌根树木[9]。在室内做外生菌根接种试验时,这种非外生菌根真菌,甚至在菌根合成试验中,木霉
(Trichoderma spp.)等霉菌的菌丝也会在植物根表面形成类似菌丝套的结构,其菌丝也会生长在根表
皮细胞间隙中,形成类似外生菌根的现象时有发生,这种结构看起来很像外生菌根,而且对苗木生长还
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食 用 菌 学 报 第23卷
有刺激作用,但是并非真正的外生菌根,这种类似菌丝套的结构在树苗移植田间后很快消失[16]。温室
接种试验表明,尽管菌根合成试验有大量的牛肝菌菌丝生长在思茅松及栲树的根系上,但没有菌根结
构形成。这与笔者大量野外调查结果相吻合,暗褐网柄牛肝菌发生于凤凰木(Delonix regia)、菠萝蜜
(Artocarpus heterophyllus)、柚子(C.maxima)、蟛蜞菊(Wedelia bilobata)、粉叶金花(Mussaenda
hybrida)、蔓花生(Arachis duranensis)、橘子(Citrus reticulate)、含羞草(Mimosa pudica)、小蓬草
(Conyza Canadensis)、藿香蓟(Ageratum conyzoides)等21科37种植物根系上[13]。这些植物均属于
丛枝状菌根(AM)植物,显微镜观察发现,尽管暗褐网柄牛肝菌菌丝生长在根的表面,但是根皮层细胞
却是泡囊状结构和钩状菌丝,没有任何外生菌根结构。笔者在野外调查时尚未发现在思茅松和栲树根
系附近生长暗褐网柄牛肝菌子实体。所以,暗褐网柄牛肝菌可能不是一种外生菌根菌。笔者还在同样
的温室条件下,同步进行了思茅松接种印度块菌的试验,结果思茅松和印度块菌形成了典型的外生菌
根[17],说明菌根接种的实验条件适合。另外,在同样温室菇房条件下,笔者用完全腐生菌的栽培方法成
功地培养出暗褐网柄牛肝菌子实体,已证明暗褐网柄牛肝菌具有一定的腐生性[12]。初步的研究结果表
明暗褐网柄牛肝菌和土粉蚧有共生关系,它们形成的菌腔虫瘿又寄生在寄主树木根上,它是一种兼有
腐生和虫共生、对植物寄生的营养方式极为复杂的真菌[13],其营养方式尚在进一步研究中。
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第1期 张春霞,等:暗褐网柄牛肝菌是外生菌根菌吗?———暗褐网柄牛肝菌与思茅松和栲树的菌根合成
Is Phlebopus portentosus an Ectomycorrhizal Mushroom?
———On the Mycorrhizal Symbiosis of P.portentosus
with Pine and Oak
ZHANG Chunxia,HE Mingxia,CAO Yang,LIU Jing,GAO Feng,XU Xinjing,
WANG Wenbing,WANG Yun
(Yunnan Institute for Tropical Crops Research,Jinghong,Yunnan 666100,China)
Abstract:Since ectomycorrhizal structures Phlebopus portentosus have never been found associated with tree
roots in the field,the ectomycorrhizal status of the fungus has been evaluated using Pinus kesiyavar.
langbianensis and Castonopsis sp.grown under greenhouse conditions on substrates consisting of peat,
vermiculite,cow dung and garden soil(1/1/1/1;v/v/v/v)(G1)and red loam,river sand and coconut bark
powder(2∶2∶1;w/w/w)(G2).Five months folowing inoculation,the surfaces of lateral roots and rootlets
of P.kesiya var.langbianensis were covered with abundant mycelia with clamp connections although
microscopic examination of sectioned material revealed no development of either mantle or Hartig net.Ten
months folowing inoculation,the surfaces of lateral roots and rootlets of Castonopsis sp.were covered with
a dense fungal mycelium interspersed with rhizomorphs and crystal-containing hyphae.However,no
ectomycorrhizal structures were evident whereas,under identical conditions,P.kesiyavar.langbianensis
formed ectomycorrhizas with Tuber indicum.Our data raise the possibility that P.portentosus may not be
an ectomycorrhizal fungus.
Key words:Phlebopus portentosus;Pinus kesiyavar.langbianensis;Castanopsis sp.;mycorrhizal symbiosis
[本文编辑] 王瑞霞
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