全 文 ：第 33卷 第 4期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 33 No. 4
2005年 4月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) April 2005
不同生境和年龄沙地柏茎叶中鬼臼毒素
含量的 SFE-HPLC分析
程俊侠1a, b ,苏世平2 ,杨永志 3 ,陈存根 1b ,张 兴1a, 4
( 1西北农林科技大学 a无公害农药研究服务中心 ; b资源环境学院 ,陕西 杨凌 712100;
2陕西省治沙研究所 ,陕西 榆林 719000; 3陕西榆林大保当臭柏自然保护站 ,陕西 榆林 719300;
4陕西省生物农药工程技术研究中心 ,陕西杨凌 712100)
[摘 要 ] 对采自我国北方沙区 7种不同生境 (固定沙地、流动沙地、阳坡、阴坡、凸地、人工林和凹地 )的沙地
柏茎叶中鬼臼毒素含量进行了 SFE-HPLC分析 ,结果表明: ( 1) 7种不同生境 (按上述顺序 )间沙地柏茎中鬼臼毒素
平均含量分别为 2. 512, 2. 031, 2. 328, 1. 993, 2. 567, 2. 029和 2. 493 mg /g ,无显著性差异 ;而在 7种不同生境 (按上
述顺序 )间沙地柏叶中鬼臼毒素平均含量分别为 8. 613, 8. 451, 8. 303, 8. 134, 8. 012, 6. 748和 6. 282 3 mg /g ,存在显
著差异 ; ( 2) 7种不同生境沙地柏叶中鬼臼毒素含量均明显高于茎 ; ( 3)不同年龄沙地柏茎、叶中鬼臼毒素含量差异
极显著 ,茎中含量最高 5. 211 mg /g ,最低只有 0. 358 9 mg /g ,叶中最高为 9. 268 mg /g ,最低为 5. 186 mg /g;按鬼臼
毒素含量从高到底排序依次为: 1年生叶> 2年生叶> 1年生茎> 2年生茎> 3年生茎。
[关键词 ] 沙地柏 ;茎叶 ;生境 ;鬼臼毒素 ; SFE-HPLC
[中图分类号 ] Q946. 8 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1671-9387( 2005) 04-0057-04
沙地柏 ( Sabina vulgaris Ant. )为柏科 ( Cupres-
saceae)圆柏属常绿匍匐灌木 ,少数为乔木 ,亦称叉
子圆柏、臭柏、新疆圆柏及爬地柏等 [1 ] ,是西北干旱、
半干旱沙区的一种重要治沙“乡土树种” ,对维护该
区生态环境具有重要意义 [2 ]。同时 ,沙地柏也是北方
城市园林建设的一种新型绿化树种 [3, 4 ]。 张兴等 [ 5, 6]
在对我国西北地区杀虫植物筛选中 ,首先发现并报
道了其杀虫活性 ,并进一步对沙地柏种子进行了系
统研究 ,证明鬼臼毒素物质是其主要活性成分之一 ,
具有较大的开发利用前景。
鬼臼毒素类物质是一类重要的生理活性物质 ,
除具杀虫活性外 ,还有抗癌 [ 7]及除草 [8, 9 ]活性。 目前
临床上大量使用的抗癌药物 V P-16、 V P-23等均以
天然鬼臼毒素为合成原料 ,从而使其主要的原料来
源小檗科 ( Berberidaceae )鬼臼亚科 ( Podophyl-
loideae )植物资源面临枯竭 [10 ] ,寻找替代植物资源
成为解决这一问题的有效途径之一。 沙地柏在我国
分布广泛、资源丰富 ,有望成为鬼臼毒素类物质的主
要天然资源。
对于沙地柏及其主要次生代谢物质鬼臼毒素类
化合物的综合开发利用而言 ,明确其不同生境及植
株不同部位和不同器官鬼臼毒素的含量是十分必要
的。 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心对
沙地柏种子中的鬼臼毒素类物质 ,如鬼臼毒素、脱氧
鬼臼毒素、苦鬼臼、表鬼臼等鬼臼类物质的分离纯化
技术及其活性都进行了研究 ,同时对鬼臼和脱氧鬼
臼毒素的有关毒理进行了研究。但由于种子 3年才
能成熟 ,因而利用种子作为植物源农药来源显然是
不够的 ,还有必要对沙地柏茎叶中鬼臼毒素含量进
行研究。为此 ,本研究对采自我国北方沙区 7种不同
生境的沙地柏茎叶中鬼臼毒素含量进行了 SFE-
HPLC分析 ,以明确生态环境与沙地柏合成积累鬼
臼毒素之间的关系 ,为其进一步开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 试验材料 沙地柏茎、叶于 2003-12采自陕
西榆林大保当臭柏自然保护区。用烘箱在 60℃条件
下烘干 ,粉碎过 30目 ( 0. 6 mm )筛 ,保存于低温冰箱
[收稿日期 ] 2004-09-22
[基金项目 ] 国家“ 863”科技攻关计划项目 ( 2001AA246016) ;国家科技攻关计划“西部开发”重大项目 ( 2004BA901A14)
[作者简介 ] 程俊侠 ( 1980- ) ,女 ,陕西白水人 ,在读硕士 ,主要从事化学生态研究。
[通讯作者 ] 张 兴 ( 1951- ) ,男 ,陕西周至人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物化学农药研究与开发。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2005. 04. 013
( - 45℃ )备用。
1. 1. 2 主要仪器 超临界流体萃取系统: ISCO TM
2-10萃取仪 , 260D柱塞泵及泵控仪 , 2 mL /min同
轴加温限流管及其控制仪。
高效液相色谱系统: Wa tersTM 600E泵 , 996
PDA紫外检测器 , Millennium色谱管理工作站。
1. 1. 3 化学试剂 鬼臼毒素标准品 ,纯度大于
95% ,由兰州大学化学化工学院田暄教授提供 CO2 ,
纯度不低于 99. 9% ,陕西省兴平化工厂生产。 分析
纯级甲醇、二氯甲烷等试剂 ,西安试剂厂生产。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 试验设计 选择固定沙地、流动沙地、阳坡、
阴坡、凸地、人工林和凹地等 7种不同生境 ,采集沙
地柏 1年生、 2年生和 3年生茎及 1年生和 2年生
叶。采用超临界 CO2萃取技术 ( SFE)对不同沙地柏
材料进行萃取 ,并用高效液相色谱仪 ( HPLC)定量
分析各萃取物中鬼臼毒素的含量。每处理设 3次重
复。采用二因素完全随机等重复试验方差分析法 ,对
试验结果进行统计分析。
1. 2. 2 沙地柏茎叶中鬼臼毒素超临界 CO2萃取条
件 采用先静态后动态的萃取方式 ,静态萃取时间
5 min,萃取压力 41. 37 M Pa,萃取仓温度为 35℃ ,
样品量为 1. 0 g;动态萃取 CO2流量为 40 m L,流速
为 1. 0 mL /min,限流管温度 60～ 65℃ ,收集溶剂为
二氯甲烷。
1. 2. 3 萃取物中鬼臼毒素含量的高效液相色谱分
析方法 色谱柱: Diamonsi l C18反相柱 ;流动相为甲
醇∶水 (体积比 )= 65∶ 35,流速为 1 mL /min;检测
波长为 217 nm,在此条件下鬼臼毒素与其他杂质峰
分离度良好。配制不同浓度梯度鬼臼毒素标准液 ,建
立标准曲线 ,采用外标法测定鬼臼毒素含量。
2 结果与分析
2. 1 沙地柏茎中鬼臼毒素含量
从表 1可以看出 , 7种不同生境间沙地柏 1年
生茎中鬼臼毒素含量无显著性差异 , 7种生境间 2
年生茎中鬼臼毒素含量间也无显著性差异。 1年生
和 2年生茎中鬼臼毒素含量分别为 2. 893～ 5. 211
mg /g , 1. 522～ 2. 669 mg /g;而 3年生茎中鬼臼毒素
含量存在显著性差异 ,流动沙地中鬼臼毒素含量仅
有 0. 358 9 mg /g ,而阴坡高达 1. 355 mg /g ,在 5%
水平上流动沙地和阴坡间有显著性差异。同时 ,从表
1还可以看出 ,在不同生境中 ,随着年龄的增长 ,沙
地柏茎中鬼臼毒素含量逐年降低且降低程度不一。
其中阴坡沙地柏茎中鬼臼毒素含量下降比较缓慢 ,
从 1年生的 2. 893 mg /g 降至 3年生的 1. 355
mg /g;而固定沙地和流动沙地中降低较明显 ,分别
从 4. 668 mg /g降至 1. 118 mg /g和从 4. 212 mg /g
降至 0. 358 9 mg /g。以生境和年龄为变异来源 ,对沙
地柏茎中鬼臼毒素含量进行方差分析表明 ,生境对
沙地柏茎中鬼臼毒素含量无显著性影响。
表 1 不同生境和年龄沙地柏茎中鬼臼毒素的含量
Table 1 The content of the podophy lloto xin in S. vulgaris stems in different habita ts and age conditions mg /g
生境
Habitat
1年生
Annual
2年生
Biennial
3年生
Triennial
平均值
Means
固定沙地 Set tled sands 4. 668 aA 1. 750 aB 1. 118 abcC 2. 512 a
流动沙地 Movab le sands 4. 212 aA 1. 522 aB 0. 358 9 cC 2. 031 a
阳坡 Sunny s lope 3. 501 aA 2. 301 aB 1. 182 abC 2. 328 a
阴坡 Shady slop e 2. 893 aA 1. 732 aB 1. 355 aC 1. 993 a
凸地 Prot ruding lands 3. 987 aA 2. 669 aB 1. 045 abcC 2. 567 a
人工林 Arti ficial woods 3. 465 aA 1. 974 aB 0. 648 abcC 2. 029 a
凹地 Concave lands 5. 211 aA 1. 710 aB 0. 558 0 bcC 2. 493 a
注: 1.鬼臼毒素含量为 3次重复的平均值。 2.表中大写字母表示同行间的差异。标不同大写字母者 ,表示鬼臼毒素含量有显著性差异 ( P <
0. 05) ,标相同大写字母者 ,表示鬼臼毒素含量无显著性差异 ( P> 0. 05) ,下表同。 3.表中小写字母表示同列间的差异。标不同小写字母者 ,表示
鬼臼毒素含量有显著性差异 ( P < 0. 05) ,标相同小写字母者 ,表示鬼臼毒素含量无显著性差异 (P > 0. 05) ,下表同。
Note: 1. Each v alue cor responds to th e average of 3 replications. 2. In the table capital let ters mean the dif ferent of the line, line fol lw ed by
th e dif ferent capi tal let ter are singnificant ly di ff eren t ( P < 0. 05) , f ollw ed by th e same capital let ter are not singnif icant ly dif f erent (P> 0. 05) ,
nex t table is same. 3. In th e table minis let ters mean th e di fferen t of the line, line follwed by th e di fferent minis let ter are singnificant ly dif f erent
( P < 0. 05) , f ollw ed by the s ame capi tal let ter are not singnificant ly di f feren t (P> 0. 05) , nex t table is same.
由表 1可知 ,不同年龄沙地柏茎中鬼臼毒素含
量间有极显著性差异。在 7种生境中 ,按鬼臼毒素含
量从高到底排序依次为: 1年生茎> 2年生茎> 3年
生茎。在 1年生茎中鬼臼毒素含量最高达 5. 211
58
西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 33卷
mg /g ,在 3年生茎中鬼臼毒素含量最高只有 1. 355
mg /g。
2. 2 沙地柏叶中鬼臼毒素含量
从表 2可以看出 ,沙地柏 1年生叶中鬼臼毒素
含量在 7种不同生境间无显著性差异 ,鬼臼毒素含
量在 7. 379～ 9. 268 mg /g; 2年生叶中鬼臼毒素含
量在 7种不同生境间有显著差异 ,流动沙地鬼臼毒
素含量最高为 8. 200 mg /g ,人工林中鬼臼毒素含量
最低为 5. 186 mg /g。对叶中鬼臼毒素含量的方差分
析表明 ,生境对沙地柏叶中鬼臼毒素含量有显著性
影响。 表 2结果还表明 ,在固定沙地和流动沙地中 ,
1年生和 2年生沙地柏叶中鬼臼毒素含量无显著性
差异。 固定沙地 1年生叶中鬼臼毒素含量为 7. 566
mg /g ,而 2年生叶中为 7. 126 mg /g;流动沙地中 1
年生鬼臼毒素含量为 8. 703 mg /g, 2年生叶中为
8. 200 mg /g。而其他 5类生境中 1年生叶与 2年生
叶中鬼臼毒素含量均有显著性差异。
表 2 不同生境、年龄沙地柏叶中鬼臼毒素含量
Table 2 The content of the podophyllo to xin in S . vulgaris
leav es in different habita ts and age condi tions
mg /g
生境
Habi tat
1年生
Annual
2年生
Biennial
平均值
Means
固定沙地
Set tled sands
7. 566 a A 7. 126 abA 8. 613 a
流动沙地
Mov able sands
8. 703 a A 8. 200 a A 8. 451 a
阳坡
Sunn y slope
8. 189 a A 5. 307 bB 8. 303 ab
阴坡
Shady s lope
8. 966 a A 7. 635 aB 8. 134 ab
凸地
Prot ruding land
9. 248 a A 7. 977 aB 8. 012 ab
人工林
Arti ficial w oods
7. 379 a A 5. 186 bB 6. 748 bc
凹地
Concav e land
9. 268 a A 7. 602 abB 6. 282 3 c
3 小结与讨论
3. 1 生境与沙地柏中鬼臼毒素含量的关系
本研究结果表明 ,沙地柏中鬼臼毒素含量与生
境之间的相互关系比较复杂 ,不同生境沙地柏茎中
鬼臼毒素含量无显著性差异 ,而不同生境沙地柏叶
中鬼臼毒素含量有显著差异。 有研究 [11, 12 ]表明 ,环
境对植物次生代谢物质含量有明显影响 ,如小麦萎
焉时小麦中的脱落酸含量可增加 40倍 [11 ] ,淡土植
物和盐生植物由非盐生条件逐步转移至高盐分环境
中 ,都能诱导脯氨酸生成量的逐步增加 [ 12 ]等。 鬼臼
毒素作为沙地柏中的一种次生代谢物质 ,从理论上
说其在植株中的含量必然会受到生境的影响 ,但本
研究结果表明 ,生境对茎中鬼臼毒素含量影响不显
著。这可能是由于本研究仅测试比较了气候、土壤等
条件相一致的大范围内不同小生境的沙地柏样品 ,
也可能是鬼臼毒素并不是沙地柏产生环境抗逆性的
主要次生代谢物质。 为此 ,有必要在更大范围内 ,如
在甘肃、青海、新疆、内蒙古和陕西等沙地柏分布区
进行采样 ,系统地分析生境与沙地柏茎、叶中鬼臼毒
素含量间的关系 ,探讨生境中那些因子对鬼臼毒素
含量起决定性作用。
3. 2 沙地柏中鬼臼毒素的主要积累器官
本研究结果表明 ,在 7种不同生境中随年龄增
长 ,沙地柏茎和叶中鬼臼毒素积累量降低 ,按鬼臼毒
素含量从高到底排序依次为: 1年生叶> 2年生叶>
1年生茎> 2年生茎> 3年生茎。沙地柏叶中鬼臼毒
素含量明显高于茎中 ,说明沙地柏中的次生代谢物
质鬼臼毒素在幼苗或新生的组织器官中积累较多。
植物的幼苗或新生的组织器官中含有大量的活性物
质 ,同时在这些幼苗或新生的组织器官中所含的次
生代谢物质的量比植物中其他部位要高得多 [13, 14 ]。
鬼臼毒素作为沙地柏植物中的一种重要的次生代谢
物质 ,其在沙地柏中的积累规律与一般植物的次生
代谢物质在其体内的积累规律是一致的。
3. 3 沙地柏的综合利用
本研究结果表明 ,在 7种不同生境中 ,沙地柏茎
和叶中鬼臼毒素积累量随着年龄增加而降低 ,在幼
苗中鬼臼毒素含量最大。而沙地柏有繁殖快 ,再生能
力强的生物学特性 [15 ] ,因此可以进行人工栽培 [16～ 18 ]
或有计划地采集其嫩枝叶 ,提取鬼臼毒素、脱氧鬼臼
毒素等鬼臼毒素类物质和精油等成分 ,用于医药或
农药研究开发 ,这有利于人类在进行可持续性生态
环境保护的同时有效地利用沙地柏资源 ,以达到“双
赢”的目的。
[参考文献 ]
[1 ] 中国植物志编委会 .中国植物志第七卷 [M ] .北京:科学出版社 , 1978. 359- 360.
[2 ] 魏凤国 .中国珍稀固沙造林树种——沙地柏采种育林调查报告 [ J ].内蒙古林业科技 , 1980, ( 3): 8- 12.
[3 ] 赵正龙 ,刘培华 .适宜北方地区的绿蓠树种—— 臭柏 [ J] .陕西林业科技 , 1983, ( 1): 69- 71.
59
第 4期 程俊侠等: 不同生境和年龄沙地柏茎叶中鬼臼毒素含量的 SFE-HPLC分析
[4 ] 孙丽华 ,李保卫 .西北地区生态园林重要树种—— 叉子圆柏 [ J].内蒙古农业大学学报 , 2002, 23( 3): 120- 121.
[5 ] 张 兴 ,付昌斌 .新杀虫植物砂地柏研究进展 [ J] .西北农业大学学报 , 1995, 23( 4): 53- 57.
[6 ] 张 兴 ,冯俊涛 ,陈安良 ,等 .砂地柏杀虫作用研究概况 [ J] .西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) , 2002, 30( 4): 130- 134.
[7 ] Lars Boh lin, B rje Rosé n. Podoph yl lotoxin d erivatives: d rug discov ery and development [ J]. Drug Discovery Today, 1996, 1( 8): 343- 351.
[8 ] Arinoto M , Matsuura S, Muro C, et al. Inhibi to ry activi ty of podophyl lotoxin and matai resino-d erivativ e lig nan s on th e root grow th of
B rassica campestris [ J ]. Bios ci Biotech nol Biochem, 1994, 58: 189.
[9 ] Oliv a A, Moraes R M, Wats on S B, et al. Aryltet ralin lignans in bi t plant grow th by affect ing the formation of mi to tic micro tub ular organiz-
ing cen ters pes ticide [ J] . Biochemis t ry and Ph ysiology, 2002, 72: 45- 54.
[10 ] 杨显志 ,邵 华 ,张玲琪 ,等 .鬼臼毒素资源研究现状 [ J] .中草药 , 2001, 32( 11): 1042- 1044.
[11 ] Mich ael W ink. Ev olution of secondary metabolit es f rom an ecological and m olecular ph ylogenet ic perspectiv e[ J ]. Ph ytoch emist ry, 2003,
64: 3- 19.
[12 ] 杜近义 ,胡国赋 ,秦际威 .植物次生代谢物的生态学意义 [ J].生物学杂志 , 1999, 16( 5): 9- 10.
[13 ] Rob V erpoorte. Ex ploration of natures ch emodiversi ty: the role of secondary metaboli tes as leads in d rug dev elopm en t [ J] . DDT, 1998, 5:
232- 238.
[14 ] 顾德兴 .次生代射物质和共同进化 [ J] .生物学通报 , 1990, ( 8): 13- 15.
[15 ] 张国盛 ,董 智 .臭柏生物生态学特性及生长繁殖的研究综述 [ J ].内蒙古林学报 , 1997, 19( 2): 69- 75.
[16 ] 邬建华 ,李玉珊 .砂地柏露地压条繁殖试验报告 [ J] .锡林郭勒林业科技 , 1984, ( 1): 8- 10.
[17 ] 陕西省林科所延安树木园 .叉子圆柏扦插育苗试验初探 [ J].陕西林业科技 , 1983, ( 1): 35- 40.
[18 ] 刀子俊 ,符亚儒 ,何忠义 .臭柏播种育苗试验 [ J] .陕西林业科技 , 1984, ( 4): 42- 43.
SFE-HPLC analysis of podophy llotoxin cotent in the stem and leave of
Sabina vulgar of different habitats and ages with
CHENG Jun-xia
1a, b
, SU Shi-ping
2
, YANG Yong-zhi
3
, CHEN Cun-gen
1b
, ZHONG Xing
1a, 4
( 1 a Bioratonal Pesticides Research and Development Center; b College of Resource and Envi ronmental Science,
Northwest A& F Universit y , Yangling, Shaanx i 712100,China;
2 Shaanx i Institute of Sand-cont rol , Yulin, Shaanx i 719000,China; 3 Dabaodan N ature Savin Reserve , Shenmu, Shaanx i 719300,China;
4 Shaanx i Research Center of Biopesticide Engineering and Technology , Yangling , Shaanx i 712100,China)
Abstract: In this paper the content of podophy llotoxin among stems and leaves o f Sabina vulgar g row n
a t 7 di fferent habitats ( set tled sands, movable sands, sunny slope, shady slope, prot ruding lands, ar ti ficial
w oods, concave lands) in the sand district of Nor th China w ere compared using supercri tical fluid ex trac-
tion ( SFE) and high perfo rmance chroma tog raphy ( HPLC) . The results are as follow s: ( 1) In these di ffer-
ent 7 habi tats ( in the same o rder w ith the above) , the contents of podophyl lotoxin were 2. 512, 2. 031,
2. 328, 1. 993, 2. 567, 2. 029, 2. 493 mg /g respectiv ely. So the habi tats exhibi ted li t tle inf lunces on the con-
tent of podophyllo to xin in the stems. how ever, In these 7 habitats di fferent ( in the same order wi th the
above ) the contents of podophyllo toxin w ere 8. 613, 8. 451, 8. 303, 8. 134, 8. 012, 6. 748, 6. 282 3 mg /g re-
spectiv ely. Thus the habitats exhibi ted singnificant inf lunces on the content of podophyllo toxin in the
leaves. ( 2) The content o f podophyllo to xin among leaves w as higher than that among stems obviously in all
di fferent habi ta ts; ( 3) There w ere notable dif ferences in the content of podophyl lotoxin among stems and
leaves of dif ferent ag es. Fo r instance, in the stems the highest content w as 5. 211 mg /g and the low est con-
tents 0. 358 9 mg /g . In the leaves the highest content w as 9. 268 mg /g and the low est content 5. 186 mg /g.
And the contents decreased in the following order: annual leaves> biennial leaves> annual stems> biennial
stems> triennial stems.
Key words: Sabina vulgaris; stems and leaves; habitat; podophyl lotoxin; supercri tical fluid ex t raction-
high perfo rmance chroma tog raphy
60
西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 33卷