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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-11-21
基金项目 : 国家科技支撑计划项目（2007BAD68B03）, 公益性行业（农业）科研专项（nyhyzx07-007-1）, 广西青年科学基金项目（桂科
青 0991077）, 广西自然科学基金重点项目（2010GXNSFD013031），广西作物遗传生物技术重点开放实验室开放课题（桂科能
0815011-6-1-14）
作者简介 : 王日升 , 男 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 蔬菜分子生物学 ; E-mail: shengriwang@126.com
通讯作者 : 李杨瑞 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: liyr@gxaas.net
全雌系苦瓜 ACC合成酶基因 cDNA克隆及序列分析
王日升1, 2 张曼1 方锋学3 黄如葵1 刘文君1 杨丽涛4 李杨瑞4
（1 广西农业科学院蔬菜研究所，南宁 530007 ； 2 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007 ；
3 广西农业科学院甘蔗研究所，530007 ；4 广西大学农学院，南宁 530005）
摘 要： 以全雌系苦瓜 ‘X-Hei-d-d’花蕾为材料，根据已报道 ACC合成酶 （1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，
ACS） 保守氨基酸序列设计简并引物，采用 RT-PCR技术及序列拼接，获得了全雌系苦瓜 ACS基因 cDNA序列，命名为 Mc-ACS4
（GenBank登录号：FJ459814）。该序列包含一个 1 455 bp的完整开放阅读框，编码 484个氨基酸，具有 7个保守区；系统进化上
与普通苦瓜 ACS基因首先聚类，同源性达 99%，二者仅有 2个氨基酸差异，推测可能与全雌系苦瓜性别分化有关。
关键词： 苦瓜 全雌系 ACC合成酶 基因克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic
Acid Synthase Gene cDNA from Gynoecious Momordica charantia
Wang Risheng1,2 Zhang Man1 Fang Fengxue3 Huang Rukui1 Liu Wenjun1 Yang Litao4 Li Yangrui4
（1Vegetable Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007; 2Guangxi Crop Genetic Improvement and
Biotechnology Lab, Nanning 530007; 3Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007;
4Agronomy College, Guangxi University, Nanning 530005）
Abstract: Floral buds of gynoecious bitter melon ‘X-Hei-d-d’ were used for RNA isolation. Three cDNA fragments were amplified
by two pairs of specific primers and one pair of degenerated primer designed based on the reported conserved amino acid sequence of
1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase （ACS）, and the full length sequence was spliced, named Mc-ACS4 （GenBank No.
FJ459814）. The sequence of Mc-ACS4 contained a 1455 bp open reading frame which encoded a 484 predicated amino acid and seven highly
conserved region. The results of phylogenetic analysis showed that Mc-ACS4 firstly clustered with that of common bitter melon based on amino
acid sequences, which shared 99% homology with only two different amino acids. It was presumed that the two different amino acids may be
related with sex differentiation of gynoecious bitter melon.
Key words: Bitter melon Gynoecious ACC synthase Gene clone Sequence analysis
苦瓜（Momordica charantia L.）为葫芦科苦瓜属
一年生雌雄同株异花的草本植物，全雌系苦瓜是只
开雌花而不开雄花的品系。性别分化与瓜类蔬菜的
收获时期和产量密切相关，因而一直是瓜类蔬菜的
研究热点。瓜类蔬菜性别分化研究最深入的是黄瓜，
研究表明，全雌系黄瓜植株乙烯含量远大于普通黄
瓜植株的含量［1］，乙烯是影响黄瓜雌性表达的最主
要激素［2］。乙烯同样明显影响苦瓜性别表现，低浓
度乙烯利具有中等强度促雌效果，高浓度则促雌效
果不明显或使雌花数减少［3］。AgNO3（乙烯作用抑制
剂）可调控全雌系苦瓜植株从第一朵花开始到一定
节位完全转化为完全花，之后恢复为全雌花［4-6］。
可见，乙烯在其性别分化过程中可能仍起重要调控
作用。
2012年第6期 55王日升等 ：雌系苦瓜 ACC 合成酶基因 cDNA 克隆及序列分析
ACC 合成酶基因是乙烯生物合成的限速酶［7］，
其表达量与乙烯量密切相关。为探索全雌系苦瓜与
一般苦瓜乙烯合成途径中的 ACS 基因序列是否存在
差异，本研究从已报道的瓜类蔬菜 ACS 基因序列设
计引物，利用 RT-PCR 技术扩增全雌系苦瓜苗期花
蕾的 ACS 基因，序列拼接后进行序列分析，旨在为
下一步研究内源乙烯含量与苦瓜全雌性状的关系奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
X-Hei-d-d 是高度稳定的全雌系苦瓜，由广西农
科院蔬菜研究所提供。种子在温度为 29±1℃和相
对湿度 90±5％条件下催芽 2 d 露白后，播于设施大
棚中，常规管理，待苗长至 4 片真叶时，采集长势
一致植株的第一个花蕾作为材料。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取与 cDNA 合成 参照植物总 RNA
提取试剂盒（天根生化科技有限公司）手册提取总
RNA，按 MMLV Reverase Transcriptase （TaKaRa）的
使用方法将其反转录为 cDNA。
1.2.2 苦瓜 ACS 基因的中间扩增 由于基因的 3和
5序列保守性差，故采用首先扩增 ACS基因保守区
的中间片段，再向 3和 5扩展的方法获得该基因全
长序列。
1.2.2.1 中间片段的扩增 参照GenBank中葫芦科瓜
类蔬菜 ACS 基因 cDNA 序列及其编码氨基酸序列的
保守区域，利用 Primer Primer5.0 软件设计 1 对简并
引物，上游简并引物 P1：5-CAGATGGGTTTAGCWG-
AAAATCAGC-3，下游简并引物P2: 5-AAGGGATTTG-
AAGGATTSGTTAT-3，以此引物对扩增全雌系苦瓜
ACS 基因 cDNA 序列的中间片段。反应体系 ：2.0 μL
10×PCR Buffer，2.5 μL dNTPs（2.0 mmol/L），引物
P1 和 P2（10 μmmol/L） 各 1.0 μL，1.0 μL cDNA，0.3
μL rTaq（TaKaRa），12.2 μL ddH2O，共 20 μL。扩增
程序 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s，
共 30 个循环 ；72℃ 7 min。
1.2.2.2 第二片段扩增 从中间片段序列设计下游
引物 P3 ：5-CCTGCCATTTAAATTACTTTTGTTACTG-
G-3，从已知苦瓜 ACS 基因序列设计上游引物 P4 ：
5-CCACCGTTTCGTGAGCTCCTGT-3。除退火温度为
59℃外，第二片段 PCR 扩增体系和程序同中间片段。
1.2.2.3 苦瓜 ACS 基因第三片段扩增 从中间片段
序列设计上游引物 P5 ：5-CCAGGATTCGACAGAGA-
TTTGAGAT-3），从已知苦瓜 ACS 基因序列设计下游
引物P6 ：5-CCCACAACCAACAATTGAGAGA-TTG-3。
除退火温度为 57℃外，第三片段 PCR 扩增体系和程
序同中间片段。
1.2.3 PCR 产物的回收、克隆与测序 用 DNA 凝胶
回收试剂盒回收目标片段，与 pGEM-T easy 载体连
接后转入大肠杆菌 DH5α 的感受态细胞中，涂于含
IPTG、X-gal、氨苄青霉素的 LB 固体培养基上，培
养后挑选白色单菌落于含 50 mg/mL Amp 的 LB 液体
培养基中培养 ；用碱裂解法小量提取质粒 DNA［8］，
经 EcoR I 酶切、电泳鉴定为阳性克隆的菌液送上海
晶泰生物技术有限公司测序，每次分别挑选 3 个单
菌落摇菌液进行测序来验证克隆序列的一致性。
1.2.4 苦瓜 ACS 基因 cDNA 全长序列的拼接及生物
信息学分析 利用 DNASTAR 软件将克隆的 3 个片
段序列拼接。拼接序列在网站（http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/BLAST）进行同源性比较，利用 DNAMAN 软
件分析基因编码氨基酸序列预测和系统进化树 ；利
用 BioEdit 软件进行同源基因编码氨基酸序列比较 ；
保守区和保守氨基酸残基分析参照文献［9］和［10］；
利用 DNASTAR 软件分析等电点和分子量。
2 结果
2.1 全雌系苦瓜ACS基因中间片段的扩增
引物 P1 和 P2 从全雌系苦瓜花蕾 cDNA 中扩增到
一个 490 bp 条带（图 1-A），与预期片段大小相近。
Blast 分析发现，该序列与普通苦瓜、黄瓜、南瓜和甜
瓜等植物 ACS 基因核苷酸序列同源性 1 M 达 73%-
99%，初步推断为苦瓜 ACS M23 基因的同源片段。
2.2 全雌系苦瓜ACS基因第二和第三片段扩增、
序列拼接及序列分析
全雌系苦瓜 ACS 基因的第二和第三片段分别
扩增出多条带，应属 ACS 家族基因中不同成员，预
期片段清晰可见，其长度分别为 440 bp 和 1 087 bp
（图 1-B）。基于 3 个 cDNA 片段的重叠区序列，拼
接后得到了全雌系苦瓜 ACS 基因 cDNA 序列，命名
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期56
为 Mc-ACS4（GenBank 登录号为 FJ459814）。序列
分析可知，该序列含有 1 455 bp 的完整开放阅读框
（opening reading frame，ORF），起始密码子 ATG 位
于第 31-33 碱基，5端和 3端非翻译区序列长度分
别为 30 bp 和 119 bp。完整开放阅读框编码 484 个
氨基酸的蛋白，与植物 ACS 基因编码 480 个左右氨
基酸的结论相一致［11］；该预测编码蛋白分子量为
54.019 kD，等电点为 6.23。
3），显示出它们具有科属的顺序聚类趋势，即全雌
系苦瓜 Mc-ACS4 最先与普通苦瓜 Mc-ACS3 聚类，再
与同科冬瓜 Cm-ACS3 聚为一类 ；同科苹果和梨聚
为一类 ；同科甜瓜、黄瓜和西葫芦聚为一类 ；黄瓜
ACS2、3 聚为一类 ；番茄单独聚为一类。
1. 第 1 片段 ；2. 第 2 片段 ；3. 第 3 片段 ；M. DL2000 DNA Marker
图 1 苦瓜 ACS基因三个片段的扩增
2.3 全雌系苦瓜Mc-ACS4基因推定氨基酸序列的
比较和分子进化分析
全雌系苦瓜 Mc-ACS4 基因推定氨基酸序列与
植物 ACS 基因氨基酸序列同源性介于 64% 和 99%
之间，其与苦瓜 ACS 基因（登录号 :AF248737 和
AF248735）同源性分别达 99%，仅有 2 个氨基酸差
异，与黄瓜达 89%，这与已知植物 ACS 基因编码区
DNA 序列都有约 60% 的同源性和氨基酸序列一般变
幅为 48%-97% 相似［12］。
将全雌系苦瓜 Mc-ACS4 基因与 GenBank 挑选的
10 个植物 ACS 基因所编码氨基酸序列进行比较，结
果表明，功能区域的氨基酸序列较保守，C 端区域
的差异很大，N 端区域的差异较小，与已报道植物
ACS 基因同源性最高的氨基酸序列在多肽的中部、
差异最大的在 C 端［12］结论一致。Mc-ACS4 基因具
有植物 ACS 基因的 7 个 ACS 保守区和 11 个保守存
在的氨基酸残基（图 2），与 Dong 等［13］认为植物
ACS 基因中部氨基酸有 7 个极为高度保守区的观点
相一致。以它们的氨基酸序列构建系统进化树（图
图 3 苦瓜与其他植物 ACS氨基酸序列构建的系统树
3 讨论
ACC 合成酶基因由多基因家族编码，不同起源、
不同类型和不同品种的苦瓜 ACC 合成酶基因的同
源性也有一定的差异。全雌系苦瓜 Mc-ACS4 与已公
布普通苦瓜 Mc-ACS3 基因仅存在 2 个氨基酸差异的
原因可能是试验材料的差异，因为已报道普通 Mc-
ACS3 基因来自雌雄同株异花的一般栽培品种，而
Mc-ACS4 来自全雌系苦瓜，这或许是全雌系苦瓜与
普通苦瓜 ACS 基因的关键差异之处。
Blast 结果表明，Mc-ACS4 与 Mc-ACS3 的核苷酸
和氨基酸序列同源性最高达 99%，系统进化树显示
Mc-ACS4 与 Mc-ACS3 首先聚类，据此确定 Mc-ACS4
是苦瓜 ACS 多基因家族的一个成员，二者极可能属
于同一基因家族。Mc-ACS4 首先与 Mc-ACS3 聚类，
然后与乙烯诱导表达冬瓜 Cm-ACS3 基因［14］聚为一
大类，却未与黄瓜雌花形成可能相关的 Cs-ACS2 和
Cs-ACS3［15，16］聚在一类，依此推测 Mc-ACS4 是受
乙烯调控表达的 ACS 基因，但其功能是否与雌花形
成密切相关尚需下一步研究证实。
2012年第6期 57王日升等 ：雌系苦瓜 ACC 合成酶基因 cDNA 克隆及序列分析
Cs-ACS1、2、3. 黄瓜 ACS1、2、3（AB006803、D89732、AB006805）； Cm-ACS. 甜瓜 ACS （D30805）； Cm-ACS3. 冬瓜 ACS（AB038559）； Cp-ACS. 西葫芦 ACS（M58323）；
Le-ACS1B. 番茄 ACS1B （U72390）； Mc-ACS3. 普通苦瓜 ACS3 （AF248737）；Mc-ACS4. 全雌系苦瓜 ACS4 （FJ459814）；Md-ACS5B. 苹果 ACS5B（AB034993）；Pc-
ACS5. 梨 ACS5 （AF386523）。加下划线的氨基酸表示 ACS 保守区，加黑箭头的氨基酸表示保守存在的氨基酸残基
图 2 苦瓜与其他植物 ACS基因的氨基酸序列比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期58
4 结论
采用 RT-PCR 技术克隆了全雌系苦瓜 ‘X-Hei-
d-d’花蕾的 ACC 合成酶基因 cDNA 序列（GenBank
登录号 ：FJ459814），序列分析表明，Mc-ACS4 具有
植物 ACS 基因的基本特征，属于植物 ACS 基因家族
基因成员 ；氨基酸序列与普通苦瓜 ACS 基因仅有 2
个氨基酸差异，同源性达 99% ；推测 Mc-ACS4 是受
乙烯调控表达的 ACS 基因，可能与全雌系苦瓜性别
分化有关。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）