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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
分泌蛋白进入内质网腔后开始一系列分泌过程。
在内质网腔内，分泌蛋白进行折叠，随后完成糖基
化、磷酸化和二硫键形成等翻译后修饰过程，才能
被转运到细胞外。只有正确折叠的分泌蛋白才能被
转运出内质网，而未折叠或折叠错误的分泌蛋白留
在内质网腔内。在酵母过表达体系中，如果蛋白折
叠机制饱和或蛋白折叠错误，导致内质网腔内不断
积累未折叠或折叠错误的分泌蛋白，从而引发细胞
收稿日期 ： 2013-11-04
作者简介 ：钟开新，男，硕士，研发助理，研究方向 ：基因工程 ；E-mail ：nhappy_z@163.com
通讯作者 ：李阳源，男，博士，副主任，研究方向 ：基因工程与发酵 ；E-mail ：liyangyuanvtr@163.com
共表达内质网响应蛋白 HAC1 对 α-半乳糖苷酶在毕氏
酵母中表达的影响
钟开新  陈丽芝  李阳源
（广东溢多利生物科技股份有限公司，珠海 519060）
摘 要 ： 为提高毕氏酵母（Pichia pastoris）中重组 α-半乳糖苷酶的表达，将来源于 P. pastoris GS115 的 hac1 基因构建至
pPIC9K 表达载体中，转化到重组 P. pastoris 中与 α-半乳糖苷酶共表达。研究结果表明，在 AOX1 启动子控制下，HAC1 过表达提高
了重组 P. pastoris 中 α-半乳糖苷酶蛋白表达含量，使 α-半乳糖苷酶活性提高了 2.2 倍。经 PCR 产物鉴定，结果表明重组 P. pastoris
基因组中插入 hac1 基因。经 50 L 发酵罐甲醇诱导 168 h，Gal-HAC1-4# 工程菌最终酶活达到 6 560 U/mL，比 Gal-21# 工程菌提高了
27%。甲醇诱导后 Gal-HAC1-4# 发酵液中粗蛋白浓度均高于 Gal-21# 工程菌。表明共表达 HAC1 蛋白可提高毕氏酵母产 α-半乳糖苷
酶蛋白的能力。
关键词 ： HAC1 α-半乳糖苷酶 毕氏酵母 共表达 UPR 反应
Effect of Co-expressing Protein HAC1 on Expression of α-galactosidase
in Pichia pastoris
Zhong Kaixin Chen Lizhi Li Yangyuan
（Guandong VTR Bio-tech Co.，LTD.，Zhuhai 519060）
Abstract:  To improve the production of a recombinant α-galactosidase in Pichia pastoris, the hac1 gene from P. pastoris GS115
constructed in pPic9K vector was coexpressed with α-galactosidase gene in P. pastoris X33. Results showed that the HAC1 protein under control
of AOX1 promoter increased the expression level of α-galactosidase protein in P. pastoris. The α-galactosidase activity superexpressed with the
HAC1 protein was up to 2.2 times than that of constitutive expression of HAC1. hac1 gene integrated into the genome of the P.pastoris was proved
by PCR. The galactosidase activity of Gal-HAC1-4#, after 168 h methanol induction in 50 L high-density fermentation, reached the highest value
of 6 560 U/mL, and increased by 27% compared with Gal-21#. The crude protein concentration of Gal-HAC1-4# was higher than the strain Gal-
21# after methanol induced. These results showed that the galactosidase expression ability of Pichia pastoris was inproved by co-expressing
protein HAC1.
Key words:  HAC1 α-galactosidase P. pastoris Co-exprssion UPR
内 UPR（The unfolded protein response）反应［1］。最
新研究表明，UPR 反应是酵母细胞中由错误折叠蛋
白或未折叠蛋白胁迫引发的信号调控途径，与一系
列 UPR 目的基因的转录调控相关，如分子伴侣、折
叠酶及参与糖基化、脂类代谢的蛋白酶等。转录因
子 Hac1p 在激活、维持 UPR 反应中起着关键作用，
通过依赖于 UPR 信号响应元件（UPRE）调节蛋白
折叠或降解等相关基因的转录过程，从而缓解内质
2014年第7期 185钟开新等 ：共表达内质网响应蛋白 HAC1 对 α-半乳糖苷酶在毕氏酵母中表达的影响
网腔内错误折叠蛋白或未折叠蛋白引发的信号胁迫。
利用共表达 HAC1 蛋白提高外源蛋白在酵母中
表达量的报道甚少。Guerfal 等［2］将 AOX1 启动子
调控的 hac1p 基因分别与小鼠白介素 -10 基因（mIL-
10）、反式唾液酸酶基因（TS）在酵母中共表达，提
高了 mIL-10、TS 蛋白表达量 ；而由 GAP 启动子调
控的 hac1 基因对蛋白表达量无影响［3，4］。这一研究
结果表明过表达 HAC1 可提高酵母表达系统中外源
蛋白的表达含量。本研究将来源于毕氏酵母 GS115
的 hac1 基因构建到 pPIC9K 表达载体中，经线性化
后电击转入 Gal-21# 感受态（α-半乳糖苷酶表达菌株
pPiczαA-Gal-X33）中，以期过表达 HAC1 提高酵母
表达系统中 α-半乳糖苷酶表达量。通过 50 L 发酵罐
高密度发酵对比，进一步验证共表达 HAC1 蛋白的
毕氏酵母产 α-半乳糖苷酶菌株在工业生产中的应用
价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 克 隆 受 体 菌 Escherichia coli
TOP10，重组酵母菌株 GAL-21#（以毕氏酵母 X33
为受体菌，在基因组内已整合有 α-半乳糖苷酶基
因），酵母 GS115 为本试验室保存。质粒 pPICZαA、
pPIC9K 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 工具酶及试剂 Pfu DNA 聚合酶、Taq DNA
聚合酶、T4 连接酶均购自上海生工公司 ；限制性内
切酶购自 NEB 公司 ；抗生素 G418 购自 Invitrogen 公
司 ；对硝基酚 -α-D-吡喃半乳糖苷购自 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 hac1 基因的克隆 根据 NCBI 发布的 hac1 基
因序列（XM_002489994.1），设计引物 hac1F ：5-cg
cggatccatgcccgtagattcttctc-3 和 hac1R ：5-attgcggccgc
ctattcctggaagaatacaaagtc-3。以毕氏酵母 GS115 基因组
DNA 为模板，用高保真 Pfu DNA 聚合酶进行 PCR
扩增，得到 hac1 基因序列。
1.2.2 hac1 基因的毕氏酵母表达质粒构建 将 hac1
基因 PCR 扩增产物进行 BamH I 和 Not I 双酶切后，
与经 BamH I 和 Not I 双酶切的 pPIC9K 混合，用 T4
DNA 连接酶在 4℃过夜连接。连接产物转化大肠杆
菌 TOP10 后，通过原位菌落 PCR 验证及双酶切鉴定
获得 pPIC9K-hac1 重组子。
1.2.3 重组表达质粒的酵母转化 构建好的 pPIC9K-
hac1 表达载体经 Sac I 线性后纯化并回收，取适量
回收物进行电转化。电转化后的酵母细胞 30℃预培
养 3 h，然后涂布于含 50 μg/mL G418 的 YPD 平板，
30℃培养 48-72 h，至菌落出现。
1.2.4 共表达 HAC1 重组毕氏酵母的鉴定 提取重
组毕氏酵母基因组 DNA，以 Invitrogen 公司提供的
5AOX1 引 物（5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3）
和 3AOX1 引 物（5-GCAAATGGCATTCTGACATCC
-3）进行 PCR 扩增，反应条件 ：94℃预变性 4 min ；
95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s， 共 30 个 循 环 ；
72℃延伸 5 min，16℃保温。PCR 产物经琼脂糖凝胶
电泳进行鉴定。
1.2.5 转化子的 α-半乳糖苷酶活性筛选 挑取 40 个
转化子分别培养于装有 5 mL BMGY 培养液的 50 mL
离心管中，置于 30℃、250 r/min 的摇床中培养 1 d
后，每 24 h 加入终浓度 0.6% 的甲醇进行诱导。2 d
后测定各转化子酶活进行初筛。从初筛结果中挑选
出 2 个具有较高表达酶活的菌株，分别培养于 5 mL
BMGY 培养液的 50 mL 离心管中，30℃摇床培养 1
d 后转接至装有 50 mL BMGY 培养液的 250 mL 三角
瓶中，且调整初始细胞浓度 OD600 均约为 1。30℃、
250 r/min 的摇床中培养 1 d 后，每 24 h 加入终浓度
0.6% 的甲醇进行诱导。每 24 h 测定一次总蛋白浓度
及 α-半乳糖苷酶活性。
1.2.6 总蛋白浓度及 α-半乳糖苷酶活性测定 总蛋
白浓度测定方法 ：取适量培养液离心后获得的上清
液进行稀释，按改良型 Bradford 法蛋白浓度测定试
剂盒法进行测定。
α-半乳糖苷酶活性测定方法［5，6］：酶活单位定
义 ：在 pH5.5 且 37℃条件下，10 min 内从 10 mmol/L
对硝基酚 -α-D-吡喃半乳糖中降解释放 1 μmol 对硝
基酚所需要的酶量为一个酶活单位 U。经浓度为 0.05
mol/L 的醋酸钠缓冲液（pH5.5）稀释的酶液和底物
对硝基酚 -α-D-吡喃半乳糖溶液于 37℃下振荡 10 min
预热，然后吸取各溶液 0.1 mL，充分混合，于 37℃
恒温振荡 10 min，加入 0.8 mL 浓度为 0.2 mol/L 的碳
酸钠溶液，振荡混匀，终止酶反应，在 400 nm 处测
定吸光度。空白对照用经过预热的酶液各 0.1 mL，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期186
然后加入 0.8 mL 碳酸钠溶液，振荡混匀，再加入 0.1
mL 预热的底物于 37℃振荡 10 min。
1.2.7 50 L 发酵罐中高密度发酵对比 将 Gal-21#
与 Gal-HAC1-4# 工程菌进行 50 L 发酵罐高密度发酵，
对比其产酶能力。50 L 发酵罐中的工程菌诱导过程
分为甘油单批培养，甘油分批补料培养和甲醇分批
补料培养 3 个不同阶段。首先，将工程菌种子液按
10% 的接种量转入装有 20 L 甘油培养基的发酵罐中，
于 pH 为 5.5、温度为 30℃、搅拌转速为 500 r/min
的初始条件下培养约 18 h，此过程通过调节罐内气
压将溶氧控制在 30% 左右。当甘油耗尽时开始分批
流加甘油补料培养基，如此反复进行几次，当培养
基湿重高于 150 mg/mL 时开始流加甲醇补料培养基
以诱导产酶。诱导前期根据 DO 曲线的变化采取梯
度流加，控制甲醇终浓度分别为 2%、3%、5%、8%
和 12%，如此培养 12-15 h 后进入诱导稳定期，此
后以 10 g/h 的速率恒速流加甲醇补料培养基，并每
隔 24 h 取样进行酶活及蛋白含量分析。
2 结果
2.1 PCR扩增hac1基因
以酵母 GS115 基因组 DNA 为模板，利用高保
真性 Pfu 酶扩增 hac1 基因，经 1% 琼脂糖凝胶电泳
分析，在 1.2 kb 处可见一条特异性条带，与预期的
目的条带大小相同，见图 1。
测序结果与 GenBank 中录入的基因序列一致。
2.3 重组酵母的获得与筛选
重组载体 pPIC9K-hac1 经线性化后，电击转化
感受态工程菌 GAL-21#，通过加有 G418 的 YPD 固
体平板进行筛选获得重组转化子。重组转化子转接
到 5 mL BMGY 培养基中培养，经甲醇诱导 48 h，测
定培养基上清液中 α-半乳糖苷酶的活性。在近 40 个
转化子中，筛选得到 GAL-HAC1-4#（126.95 U/mL）、
GAL-HAC1-21#（66.66 U/mL），其表达 α-半乳糖苷
酶活性分别是 GAL-21#（26.43 U/mL）的 4.8、2.5 倍。
2.4 HAC1共表达对重组酵母α-半乳糖苷酶表达
的影响
250 mL 摇 瓶 培 养 重 组 酵 母 GAL-21#、GAL-
HAC1-4#、GAL-HAC1-21# 菌种，每 24 h 加甲醇诱导
表达 α-半乳糖苷酶，测定上清液中总蛋白含量及 α-
半乳糖苷酶活性。在培养液中细胞浓度几乎相同的
情况下，GAL-HAC1-4# 发酵培养液中总蛋白含量明
显高于 GAL-21# 发酵液（图 4），甲醇诱导 96 h 时
GAL-HAC1-4# 发酵液中 α-半乳糖苷酶活性是 GAL-
21# 发酵液的 2.2 倍（图 5）。表明 HAC1 共表达显
著增加了酵母表达系统中外源蛋白 α-半乳糖苷酶的
3000
1500
1000 1200
bpbp
M 1
750
500
250
M ：1 kb DNA Ladders ；1 ：hac1 基因 PCR 产物
图 1 hac1 基因扩增产物鉴定
2.2 构建重组表达质粒
hac1 基因经酶切后连接到 pPC9K 载体中，转化
大肠杆菌后经 LBA（含 Amp+）抗性平板筛选获得转
化子。原位菌落 PCR 产物及双酶切产物经 1% 琼脂
糖凝胶电泳分析，均可见约 1.2 kb 的特异性 DNA 条
带，见图 2，图 3，表明重组表达质粒构建成功。其
3000
1500
1000 1200
bpbp
M 1 2 3
750
500
250
M ：1 kb DNA Ladders ； 1-3 ：原位菌落 PCR 产物
图 2 原位菌落 PCR 产物鉴定
3000
1500
1000 1200
bpbp
M 1 2
750
500
250
M ：1 kb DNA Ladders ； 1 ：pPICqK-hacl 质粒 ；2 ：pPICqK-hacl 质粒经
BamH I 和 Not I 酶切产物
图 3 重组表达载体 pPIC9K-Hac1 双酶切鉴定
2014年第7期 187钟开新等 ：共表达内质网响应蛋白 HAC1 对 α-半乳糖苷酶在毕氏酵母中表达的影响
分泌量，大大提高了发酵液中 α-半乳糖苷酶的酶活。
2.5 共表达HAC1重组毕氏酵母鉴定
提 取 重 组 毕 氏 酵 母 GAL-21#、GAL-HAC1-4#、
GAL-HAC1-21# 基因组 DNA，以此为模板进行 PCR
扩增，扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析。GAL-
HAC1-4#、GAL-HAC1-21# 可见约 1.4 kb（包含载体
片段 200 bp，hac1 基因片段约 1.2 kb）、2.4 kb（包
含载体片段约 200 bp，gal 基因片段约 2.2 kb）及
2.8 kb（酵母基因组 AOX1 基因）的 DNA 片段，而
GAL-21# 只可见 2.4 kb 和 2.8 kb 的 DNA 片段，见图
6。表明重组表达质粒 pPIC9K-hac1 已重组至 GAL-
21# 酵母基因组中。
2.6 50 L发酵罐进行工程菌发酵
Gal-21# 与 Gal-HAC1-4# 工程菌在 50 L 发酵罐
中分别经过甘油单批培养，甘油分批补料培养和甲
醇分批补料培养 3 个不同阶段，其最终发酵酶活分
别 为 5 200 U/mL 和 6 560 U/mL（ 图 7）。 相 比 Gal-
21#，Gal-HAC1-4# 工程菌最终发酵酶活提高了 27%。
加入甲醇诱导后，Gal-HAC-4# 工程菌发酵液中粗蛋
白含量均高于 Gal-21# 工程菌（图 8）。这些结果进
一步表明，毕氏酵母产 α-半乳糖苷酶工程菌中共表
达 HAC1 蛋白，可以大大提高工程菌产 α-半乳糖苷
酶的产酶能力，提高了目的蛋白的表达量，且可运
用于大工业化生产中。
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 24 48 72 96
TimehProtein concentrationug/mL GAL-21#GAL-HAC1-4#GAL-HAC1-21#
GAL-21# ：原始菌株 ；GAL-HAC1-4#、GAL-HAC1-21# ：共同表达菌株 ；下同
图 4 共表达菌株与原始菌株发酵表达总蛋白含量
0
50
100
150
200
250
24 48 72 96
TimehEnzyme activityU/mL GAL-21#GAL-HAC1-4#GAL-HAC1-21#
图 5 共表达菌株与原始菌株发酵表达 α-半乳糖苷酶酶活
2000
1500
1000
2400
1400
bpbp
M 1 2 3
750
500
250
M ：1 kb DNA Ladders ；1 ：GAL-21# 基因组 PCR 产物 ；2 ：GAL-HAC1-4# 基
因组 PCR 产物 ；3 ：GAL-HAC1-21# 基因组 PCR 产物
图 6 共表达 HAC1 重组毕氏酵母的 PCR 产物鉴定
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 24 48 72 96 120 144 168
TimehEnzyme activityU/mL Gal-21#Gal-HAC1-4#
图 7 50 L 发酵罐中 Gal-21# 和 Gal-HAC1-4# 发酵酶活对比
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 24 48 72 96 120 144 168
Timehprotein concentrationmg/mL Gal-21# Gal-HAC1-4#
图 8 50 L 发酵罐中 Gal-21# 和 Gal-HAC1-4# 发酵液中蛋
白含量对比
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期188
3 讨论
酵母表达系统中外源蛋白分泌是一个极其复杂
连续的过程，影响其表达量的因素众多，包括重组
载体启动子的强弱，基因密码子的优化，基因拷贝
数，mRNA 转录过程，非成熟肽在内质网的转运过程，
蛋白的翻译后修饰过程等［7］。
在真核细胞中，大部分分泌蛋白和跨膜蛋白以
非折叠肽的形式转运到内质网中，且在其腔内进行
一系列的折叠和加工过程，从而形成成熟蛋白，并
被主动运送到细胞外，这就形成了一种蛋白成熟过
程的动态平衡［8］。如果蛋白折叠过程受到限制，导
致未折叠蛋白在内质网中过量积累，从而打破这一
平衡，细胞就会激发胞内 UPR 效应［9］。UPR 效应
激活胞内转录因子 HAC1 mRNA 在细胞核中进行非
常规剪接反应，翻译形成 Hac1p，Hac1p 激活相关
伴侣蛋白、折叠因子等基因的转录翻译，进一步提
高内质网中未折叠蛋白的折叠过程，促进蛋白成熟
过程的动态平衡［10］。如果这一稳态未能重新形成，
过度积累的未折叠蛋白加速细胞死亡，从而导致表
达蛋白分泌量下降或酶活降低［11］。
Guerfal 等［2］ 将 由 AOX1 启 动 子 调 控 表 达 的
HAC1p 分别与小鼠白介素 -10（mIL-10）和来源于
克氏锥虫的反式唾液酸酶（TS）在酵母表达系统中
诱导表达。研究结果表明，HAC1p 的过表达提高了
mIL-10 蛋白表达量 2.2 倍，提高了 TS 蛋白表达量 2.1
倍。本研究将由 AOX1 启动子调控表达的 HAC1 与
相同启动子调控表达的 α-半乳糖苷酶在酵母表达系
统中共表达，研究结果表明，HAC1 的过表达提高
了酵母表达系统中总蛋白的含量，甲醇诱导 96 h 时
其 α-半乳糖苷酶活性最大提高了 2.2 倍。通过在 50
L 发酵罐高密度发酵研究，表明 Gal-HAC1-4# 工程
菌在 168 h 时的最终发酵酶活比 Gal-21# 工程菌提高
了 27%，自加入甲醇诱导后，Gal-HAC1-4# 工程菌
发酵液中粗蛋白浓度均高于 Gal-21#。这些研究结果
说明，在酵母表达系统中，可能存在大量非折叠蛋
白或错误折叠蛋白，而利用过表达 HAC1 可将这些
非折叠蛋白或错误折叠蛋白重新折叠成成熟蛋白的
功能，可以大大提高目的蛋白的表达量。
作者尝试将过表达 HAC1 蛋白分别与木聚糖酶、
纤维素酶、植酸酶等在酵母系统中共表达，木聚糖酶、
纤维素酶和植酸酶蛋白表达量均无显著提高，表明
过表达 HAC1 影响分泌蛋白的蛋白表达可能具有一
定的选择调控机制，这一机制有待进一步深入研究。
4 结论
将 hac1 基因转入产 α-半乳糖苷酶的重组酵母菌
株 Gal-21# 中，在 5 mL 培养基中诱导 48 h 筛选获得
产 α-半乳糖苷酶高表达菌株 ：GAL-HAC1-4#、GAL-
HAC1-21#，其表达 α-半乳糖苷酶活性分别是原始菌
株 GAL-21# 的 4.8、2.5 倍。 在 50 L 发 酵 罐 中 高 密
度发酵进一步对比 Gal-21# 菌株和 Gal-HAC1-4# 菌
株的产酶能力，Gal-HAC1-4# 菌株最终发酵酶活比
Gal-21# 菌株提高了 27%，Gal-HAC1-4# 菌株发酵液
中粗蛋白浓度也均高于 Gal-21# 菌株。表明共表达
HAC1 蛋白提高了毕氏酵母异源表达 α-半乳糖苷酶
的能力，且可运用于大工业生产中。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）