全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-28
作者简介 : 武强 , 男，博士研究生，研究方向 : 昆虫分子生物学 ; E-mail: wuqiang8510@163.com
三种提取苹果绵蚜基因组 DNA 方法的比较
武强1 吕志创1 万方浩1 李照会2
（1中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193 ；
2山东农业大学植物保护学院，泰安 271018）
摘 要： 参考国内外昆虫基因组 DNA 提取的常用方法，选取 KAc 法、氯仿 - 异戊醇法和盐析法 3 种方法对苹果绵蚜（Eriosoma
lanigerum）基因组 DNA 进行提取。通过基因组 DNA 直接琼脂糖凝胶电泳、SSR 引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测，对 3 种方法所提基因组 DNA 的质量进行了比较，并综合分析了提取所需时间及所用试剂的毒性大小等。结果表明，
盐析法操作程序较简便快捷，节时省工，可得较好质量的 DNA 样本，且对试验操作人员无伤害，是一种值得推广应用的基因组
DNA 提取方法。
关键词： 昆虫 DNA 提取 KAc 法 氯仿 - 异戊醇法 盐析法 苹果绵蚜
Comparison of Three Methods for Genomic DNA Extraction from the
Woolly Apple Aphid
Wu Qiang1 L Zhichuang1 Wan Fanghao1 Li Zhaohui2
（1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Beijing 100193 ；2College of Plant Protection，Shandong Agricultural University，Taian 271018）
Abstract: Three methods to extract the genomic DNA of insects were implemented on the woolly apple aphid（Eriosoma lanigerum）.
All these methods can extract genomic DNA of good quality, which are suitable for the SSR-PCR amplification. Compared with the chloroform-
isoamyl method and KAc method, the salting-out method spend less time, and is toxic free and easier to be carried out. Result showed that
salting-out method is an easy, rapid, non-toxic and effective method to extract genomic DNA from insects.
Key words: Insects DNA isolation KAc method Chloroform-isoamylol method Salting-out method Eriosoma lanigerum
20 世纪 80 年代 PCR 技术的完善使分子生物技
术越来越多地应用于生物的个体生命与代谢过程、
物种系统发育和进化等方面，成为现代分子生物学
试验工作的重要基础之一，也促使了诸多分子标记
技术的诞生与应用［1］。这些分子标记技术已广泛应
用于动植物的相关研究中［1-4］。在昆虫学研究中的
应用也取得了长足进展，极大地促进了昆虫学的发
展，如 RAPD 标记、AFLP 标记、mtDNA-COI 标记、
SCAR 标记、ISSR 标记及 SSR 标记等这些 DNA 分子
标记技术已经被广泛用在昆虫遗传变异、系统发育
以及种群分化等方面的研究［5］。分子标记技术使人
们对昆虫的系统发育和生态学，包括种群遗传分化、
种群间迁移扩散关系以及生殖策略等问题获得了更
深入的认识。
这些研究的第一步也是最关键步骤是获得物种
的 DNA，并且在一些分子生物学如种群遗传多样性
等研究中通常都需要较大的样本量，所以 DNA 的提
取工作作为分子标记等分子生物学研究的基础，除
了要保证基因组 DNA 的高产量、高纯度、结构完整
之外，更重要的是能够寻求一种步骤简单，耗时少、
成本低的基因组 DNA 提取方法［6］。
苹果绵蚜（Eriosoma lanigerum，Hausmann）是
一种世界性的苹果树重要害虫之一，原产北美洲并
传播到世界各地，且在原产地营完整生活史，而在
世界其他地区发生，基本为孤雌生殖。目前，对苹
果绵蚜的研究多为其生物学、生态学和防治等方
2012年第1期 71武强等 ：三种提取苹果绵蚜基因组 DNA 方法的比较
面的研究。在种群遗传多样性方面，Timm 等［7］用
AFLP 标记技术对南非国内 5 个地理种群的研究结果
表明各种群间遗传差异很小 ；而 Lavandero 等［8］用
ISSR 标记技术对智利国内 10 个地理种群的研究显
示， 智利国内苹果绵蚜种群的遗传多样性较高。苹
果绵蚜在我国的入侵来源较多且可能存在多次入侵，
对我国各地的苹果绵蚜群体进行遗传结构分析，可
以更加清楚地了解苹果绵蚜在我国的扩散路线和强
适应性的分子进化机制，为苹果绵蚜的检疫和防治
提供一定的理论依据［9］。
本研究借鉴国内外应用较多的提取昆虫 DNA 的
3 种方法，即 KAc 法、氯仿 - 异戊醇法和盐析法对
其稍作改进，以苹果绵蚜为研究材料，通过基因组
DNA 直接琼脂糖凝胶电泳、SSR 引物扩增产物的琼
脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，对 3 种
方法提取的基因组 DNA 的质量进行了比较，并结合
DNA 提取所需时间、操作难易程度和所用试剂的毒
性大小进行综合比较。旨在为研究我国各地苹果绵
蚜种群的遗传结构寻找一种高效的 DNA 提取方法，
既可以满足研究所用分子标记方法的扩增需求，又
可以更加省时，操作更简便，且能降低对操作人员
的毒害等。
1 材料与方法
1.1 材料
苹果绵蚜 ：2007-2008 年间采集于我国苹果绵
蚜发生地区，用 95% 乙醇保存，放置于 -20℃冰箱。
试验中配制提取液及其他溶液所用试剂均为实
验室常规试剂，化学纯 ；所用仪器等其他信息见试
验方法。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DAN 的提取方法
1.2.1.1 KAc 法：参照安瑞生等［10］的方法，稍加改进。
（1）取单头苹果绵蚜，在双蒸水中漂洗，吸水
纸吸干表面水分 ；立即将蚜虫置于 1.5 mL 离心管中，
加入 20 μL 提取缓冲液（1% SDS，50 mmol/L Tris-Cl
pH8.0，25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA），置于 -20℃
冰箱中 ；
（2）4 min 后取出，用微量移液器吸取 180 μL
提取缓冲液，用移液器上的枪头将蚜虫碾碎后将提
取缓冲液加入离心管中，65℃水浴 45 min（中间取
出摇动混匀 2 次）；
（3）加入 100 μL 3 mol/L KAc（pH7.2），冰上放
置 1 h ；
（4）4℃下 12 000 r/min 离心 10 min，移上清液
于另一离心管中 ；
（5）加入 600 μL 预冷无水乙醇，混匀，放置
于 -20℃冰箱 1 h 以上 ；
（6）4℃下 12 000 r/min 离心 15 min，小心倾尽
上清液，加 400 μL 预冷的 75% 乙醇洗涤，12 000 r/min
离心 15 min，小心弃去上清液 ；
（7）在室温下干燥，加入 30 μL 灭菌 ddH2O，充
分溶解后 -20℃保存备用。
1.2.1.2 氯仿 - 异戊醇法：参照周志湘等［11］的方法。
（1）将单头苹果绵蚜置于加有 20 μL 提取缓冲
液（50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1% SDS、
20 mmol/L NaCl，pH8.0）的 Parafilm 膜上，以 0.2 mL
的 PCR 管底部充分研磨 ；
（2）50 μL 缓冲液清洗匀浆液 4 次并混匀，然
后用微量移液器移入 1.5 mL 离心管，加入 5 μL 蛋白
酶 K（20 mg/mL），充分混匀，于 60℃水浴 1 h（中
间取出摇动混匀 1 次），然后沸水浴 5 min ；
（3） 加 入 220 μL 氯 仿 / 异 戊 醇（V V = 24
1）抽提液，轻柔混匀，冰上放置 30 min，4℃下
10 000 r/min 离心 10 min，移上清液到另一离心管中；
（4） 加 入 440 μL 预 冷 的 无 水 乙 醇， 轻 轻 混
匀，-20℃放置 30 min ；
（5）4℃下 12 000 r/min 离心 15 min，小心弃去
上清液，加入 400 μL 预冷的 75% 乙醇洗涤，12 000
r/min 离心 15 min，小心弃去上清液 ；
（6）室温下干燥，加 30 μL 灭菌 ddH2O，充分
溶解后于 -20℃保存备用。
1.2.1.3 盐析法（salting-out protocol）：参照 Sunnucks
等［12］的方法，稍加改进。
（l）将单头苹果绵蚜置于 1.5 mL 离心管中，用
微量移液器加入 20 μL TNES 提取缓冲液（50 mmol/L
Tris-Cl，pH7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，
0.5% SDS），然后用移液器上的枪头将蚜虫捣碎 ；
（2） 加入200 μL TNES和5 μL蛋白酶K （20 mg/mL），
轻摇混匀，在 37℃下温育过夜或 60℃水浴 1 h （中
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期72
间取出摇动混匀 1 次） （本试验采用 60℃水浴 1 h）；
（3）加入 80 μL 5 mol/L NaCl，用力摇动 15 s，4℃
14 000 r/min 离心 5 min，将蛋白质沉淀，移上清液
到另一离心管中 ；
（4） 加 入 300 μL 预 冷 的 无 水 乙 醇， 轻 轻 混
匀，-20℃放置 30 min ；
（5）4℃ 14 000 r/min 离心 5 min，弃上清液 ；加
入 300 μL 预冷的 75% 乙醇洗涤，4℃ 14 000 r/min
离心 5 min，弃上清液 ；
（6）在室温下干燥，然后加 30 μL 灭菌 ddH2O，
充分溶解后 -20℃备用。
1.2.2 基因组 DAN 的检测 通过基因组 DNA 直接
琼脂糖凝胶电泳、苹果绵蚜 SSR 引物 Erio-3［13］扩
增产物的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测，对 3 种方法所提基因组 DNA 的质量进行检测
与比较。
将所提苹果绵蚜基因组 DNA 样本直接在 0.8％
的琼脂糖凝胶（包含 0.5 mg/mL 的溴化乙锭）上进
行电泳分离（80 V，40 min），然后在凝胶成像系统
上观察并拍照保存结果。
选用 SSR 引物 Erio-3 对以上方法所提取的 DNA
样本进行 PCR 扩增。用 1.5% 的琼脂糖凝胶对其扩
增产物进行电泳分离（80 V，40 min），然后在凝胶
成像系统上观察并拍照保存结果。
聚丙烯酰胺凝胶电泳过程参考 ABC Laboratory
protocols（CIIMMTY，1998）在 Seque-Gene®GT-System
38 cm×30 cm 电泳系统（Bio-Rad, USA）上进行。
在 6% 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上电泳检测扩增
产物（75 V，1 h），银染法染色并用扫描仪记录电
泳结果。
2 结果
2.1 琼脂糖凝胶电泳检测
3 种方法提取的 DNA 样本直接在 1.5% 琼脂糖
上电泳的分离效果如图 1 所示。可见，苹果绵蚜的
基因组大小在 23 kb 以上（图 1-B），3 种方法都能
成功提取到苹果绵蚜基因组 DNA，基本无蛋白质和
RNA 污染。
A: KAc 法（M1. BM2000 DNA Marker ；1-3. 苹果绵蚜基因组 DNA）；B. 氯仿 - 异戊醇法（M2. λDNA/ Hind III
DNA Marker ；1-8. 苹果绵蚜基因组 DNA）；C: 盐析法（M3. BM2000 DNA Marker ；1-6. 苹果绵蚜基因组 DNA）
图 1 不同方法对单头苹果绵蚜 DNA 的提取效果
2.2 PCR扩增效果检测
将 3 种方法所提 DNA 通过苹果绵蚜 SSR 引物
Erio-3 进行 PCR 扩增，其产物进行琼脂糖凝胶电泳
和聚丙烯酰胺凝胶电泳的效果如图 2 所示。可见，3
种方法所提 DNA 样本均能通过 SSR 引物 Erio-3 得到
高效扩增，且扩增效果无明显差异，均可用于 SSR
分子标记。
3 讨论
氯仿 - 异戊醇法和 KAc 法是目前国内提取昆虫
或其它动物组织的两种代表性的方法，盐析法是国
外用分子标记技术研究蚜虫等小型昆虫种群遗传结
构使用较多的方法，国内也已有部分研究者将其应
2012年第1期 73武强等 ：三种提取苹果绵蚜基因组 DNA 方法的比较
用于自己的研究中，并取得了较好的效果［14］。本研
究使用以上 3 种具有代表性的昆虫 DNA 提取方法对
苹果绵蚜基因组 DNA 进行提取，并对其提取效果进
行了比较。在提取效果方面，氯仿 - 异戊醇法提取
质量最高，盐析法和 KAc 法大多会出现不同程度的
降解 , 但能够满足 SSR 分子标记的扩增需求 ；KAc
法不使用蛋白酶 K，成本较低；盐析法操作过程简单，
耗时较短，提取得率较高，且不使用有毒试剂。
滕希等［15］以烟粉虱为对象进行研究，结果表
明盐析法对烟粉虱各虫态均能有效地提取其基因组
DNA，并适用于以 RAPD、COI 和 SSR 分子标记为
手段的有关烟粉虱生物型检测、不同生物型发生
动态和地理分布监测以及遗传分化、遗传结构等
研究。说明该方法可适用于多种昆虫基因组 DNA
的提取，可通过以其它昆虫或节肢动物物种为研
究材料进行验证，且不同的 DNA 提取方法是否会
对某些分子标记的多态性位点数量产生影响，它
们各自适用于哪些分子标记方法等问题也有待进
一步研究。
4 结论
本试验综合了 KAc 法、氯仿 - 异戊醇法和盐析
法 3 种方法对苹果棉蚜基因组 DNA 提取的效果，结
果显示，盐析法能提取到满足普通 PCR 扩增的试验
要求的较高质量的 DNA 样本，而且该方法操作简单，
耗时较短，还可减少对试验操作人员的身体伤害，
是一种值得推广应用的基因组 DNA 提取方法。
参 考 文 献
［1］ 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW．分子克隆实验指南［M］. 第 3 版 .
北京 ：科学出版社，2002 ：596-701．
［2］ 孙芳芳．常用分子标记在植物科学研究中的应用 . 安徽农学通
报， 2010，16（06）：40-41．
［3］ 单雪，王秀利，仇雪梅．分子标记及其在海洋动物遗传研究中
的应用 . 生物技术通讯，2005（4）：463-466．
［4］ 张娜娜，王清义，王玉琴，等．微卫星 DNA 标记遗传多样性
在家畜遗传育种上应用的研究进展．中国畜牧兽医，2009，36
（12）：77-80．
［5］ 何恒果．分子标记技术在昆虫种群遗传学研究中的应用．西华
师范大学学报 ：自然科学版，2008（4）：342-347．
［6］ Ivanova NV, Dewaard JR, Hebert PDN．An inexpensive, automation-
friendly protocol for recovering high-quality DNA. Molecular Ecology
Notes，2006，6（4）：998-1002.
［7］ Timm AE, Pringle KL, Warnich L. Genetic diversity of woolly apple
aphid Eriosoma lanigerum （Hemiptera Aphididae） populations in
the Western Cape, South Africa. Bulletin of Entomological Research,
2005, 95（3）: 187-191．
［8］ Lavandero B, Miranda M, Ramrez CC, et al. Landscape composition
modulates population genetic structure of Eriosoma lanigerum
（Hausmann） on Malus domestica Borkh in central Chile. Bulletin of
Entomological Research, 2009, 99（1）: 97-105．
A: 琼脂糖凝胶电泳检测（1-4. KAc 法，5-8. 氯仿 - 异戊醇法，9-12. 盐析法，M1. BM2000 DNA Marker）；B: 聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测（1-10. 盐析法，11-14. KAc 法，15-20. 氯仿 - 异戊醇法，M2. pBR332/Msp I）
图 2 SSR 引物 Erio-3 对不同方法提取的 DNA 的扩增效果
（下转第 82 页）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期82
达，为今后进一步在体外研究 LeFAD3 基因功能打
下了基础。
参 考 文 献
［1］ Hugly S, Somerville C. A role for membrane lipid polyunsaturation
in chloroplast biogenesis at low temperature. Plant Physiol,
1992,99(1):197-202.
［2］ Kodama H, Hamada T, Horiguchi G, et al. Genetic enhancement of
cold tolerance by expression of a gene for chloroplast omega-3 fatty
acid desaturase in transgenic tobacco. Plant Physiol,1994,105(2):
601-605.
［3］ Kodama H, Horiguchi G, Nishiuchi T, et al. Fatty acid desaturation
during chilling acclimation is one of the factor involved in conferring
low-temperature tolerance to young tobacco leaves. Plant Physiol,
1995,107(4):1177-1185.
［4］ Murakami Y, Tsuyama M, Kobayashi Y, et al. Trienoic fatty acids
and plant tolerance of high temperature. Science, 2000,287(5452):
476-479.
［5］ Zhang M, Barg R, Yin M, et al. Modulated fatty acid desaturation via
overexpression of two distinct ω-3 desaturases differentially alters
tolerance to various abiotic stresses in transgenic tobacco cells and
plants. The Plant J,2005,44(3):361-371.
［6］ Matos AR, Hourton-Cabassa C, Cicek D, et al. Alternative oxidase
involvement in cold stress response of Arabidopsis thaliana fad2 and
FAD3+ cell suspensions altered in membrane lipid composition.
Plant Cell Physiol,2007,48(6):856-865
［7］ Sigenthaler PA, Murata N. Lipids in photosynthesis: Structure
function and genetics ［M］ . Dordrecht: Kluwer Academic Press,1998.
［8］ Vrinten P, Hu ZHY, Munchinsky MA, et al. Two FAD3 desaturase
genes control the level of linolenic acid in flax seed. Plant
Physiol,2005,39(1):79-87.
［9］ Chappell ASC, Bilyeu KD. Short communication a GmFAD3A
mutation in the low linolenic acid soy bean mutant C1640. Plant
Breeding,2006,125(5):535-536.
（责任编辑 马鑫）
［9］ 武强，万方浩，李照会．苹果绵蚜在我国的入侵状况调查及防
治对策．植物保护，2009， 35 （5）：100-104．
［10］ 安瑞生，谭声江，陈晓峰．微卫星 DNA 在分子遗传标记研究
中的应用．昆虫知识，2002，39（3）：165-170．
［11］ 周志湘，万方浩，张桂芬，等．烟粉虱基因组 DNA 快速提取
方法．植物保护，2007，33（5）：131-133．
［12］ Sunnucks P, Hales DF．Numerous transposed sequencesof
mitochondrial cytochrome oxidase I-II in Aphids of the genus
Sitobion （Hemiptera: Aphididae）. Molecular Biologyand Evolution,
1996, 13（3）: 510-524．
［13］ Lavandero B，Figueroa CC，Ramirez CC，et al．Isolation and
characterization of microsatellite loci from the woolly apple aphid
Eriosoma lanigerum （Hemiptera: Aphididae: Eriosomatinae）.
Molecular Ecology Resources, 2009,9（1）：302-304．
［14］ 王永模．微卫星标记技术对麦长管蚜的生殖模式与迁飞规律
研究［D］．北京 : 中国农业大学，2007．
［15］ 滕希，武强，万方浩．盐析法提取烟粉虱基因组 DNA．生物
技术通报，2009（8）：166-168．
（责任编辑 马鑫）
（上接第 73 页）