全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-11
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31070441）, 国家转基因生物产业化专项（2009ZX08009-030B）
作者简介 ：牛丽红，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物生物化学与分子生物学 ；E-mail: cqyniu@yahoo.com.cn
通讯作者 ：张杰，研究员 ；E-mail: jzhang@ippcaas.cn
莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的
表达与活性分析
牛丽红1 耿丽丽1 张蕊2 孙长坡2 张杰1
（1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193 ；2国家粮食局科学研究院，北京 100037）
摘 要: 采用 RT-PCR 方法克隆到莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因 lyd15，与毕赤酵母表达载体 pPIC3.5K 连接，电击法转化
毕赤酵母 GS115。转化子经高浓度 G418 筛选出高抗性重组子，经 PCR 鉴定目的基因已整合入毕赤酵母基因组中。甲醇诱导表达，
RT-PCR 检测表明莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中得到了表达 ；毕赤酵母总脂肪酸甲酯经气相色谱（GC）分析结果
显示亚油酸的含量明显降低，而 α-亚麻酸的含量有所提高。
关键词: 莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶 α- 亚麻酸 毕赤酵母
Hetero Expression of ω-3 Desaturase Gene from Chlamydomonas
reinhardtii and Assay of Its Activity in Pichia pastoris
Niu Lihong1 Geng Lili1 Zhang Rui2 Sun Changpo2 Zhang Jie1
（1 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Beijing 100193 ；2Academy of State Administration of Grain， Beijing 100037）
Abstract: The C. reinhardtii ω-3 fatty acid desaturase gene （lyd15） was subcloned into the methylotrophic yeast Pichia pastoris
expression vector pPIC3.5K to generate a recombinant plasmid p3.5K-Ld3， which was subsequently transformed into Pichia pastoris strain
GS115 for heterologous expression with electroporation method. The expression of desaturase gene lyd15 in P. pastoris was verified with RT-PCR.
Total fatty acids were extracted from the induced cells and methylated. The fatty acid methyl esters were analyzed with gas chromatography （GC），
the results show that the amount of linoleic acid was decreased remarkably， whereas the content of alpha-linolenic acid was increased.
Key words: Chlamydomonas reinhardtii ω-3 fatty acid desaturase Alpha-linolenic acid Pichia pastoris
α- 亚 麻 酸（alpha-linolenic acid， ALA） 是 人 体
所必需的 ω-3 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty
acids， PUFAs）中的一种，具有重要的营养价值和药
用价值 [1,2]。α- 亚麻酸能够降低血清总胆固醇，升
高血清高密度脂蛋白 [3-6]，ALA 还对一些疾病的治
疗及预防具有极其重要的效用，如对慢性肾病的预
防 [7] ；而且 ALA 是对人体健康非常重要的几种 ω-3
PUFAs， 如 二 十 碳 五 烯 酸（eicosapentaenoic acid，
EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid， DHA）
等的合成前体。哺乳动物所需的 ω-3 PUFAs 需要通
过饮食摄入而获得，这是由于高等动物失去了合成
这些脂肪酸的能力 [8]。目前 ω-3 PUFAs 的主要来源
是深海鱼油，但鱼类自身并不能合成 EPA 和 DHA，
它们是通过摄食富含 ω-3 PUFAs 的微藻等进行有
限积累，然而由于海洋污染及鱼类资源的匮乏使得
这种来源不能有效的正常供给。目前人们主要食用
的植物油，如玉米胚芽油、棉籽油、燕麦油、芝麻
油及大豆油等中的主要的脂肪酸是亚油酸（linoleic
acid， LA），缺乏 ALA 等 ω-3 PUFAs[9]。所以，很多
研究者开始探索如何利用转基因植物作为生产 ω-3
PUFAs 尤其是 EPA 和 DHA 的绿色工厂。
ω-3 脂肪酸脱氢酶是 ALA 合成的关键酶，此
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酶在亚油酸（18 2）脂肪酸链的距甲基端的第三个
碳原子处引入双键生成 ALA（18 3）。对脂肪酸脱
氢酶分子生物学研究起始比较晚，但是在最近几年，
其发展非常迅猛，取得了突破性进展。目前从植物、
真菌等不同生物体中克隆到几种脂肪酸脱氢酶 [10]，
并且在模式微生物（毕赤酵母与酿酒酵母等）及油
料种子作物中获得功能性表达，如 Damude 等 [11] 把
从串珠镰刀霉中分离得到的 ω-3 脱氢酶基因，并
且转入大豆中使其得到表达，转基因大豆中亚油酸
占总脂肪酸的 5.9%，而非转基因中亚油酸的含量
为 52.0%，亚油酸含量明显降低 ；同时转基因大豆
中 ALA 占总脂肪酸含量的 70.9%，而非转基因大豆
中 ALA 只占总脂肪酸的 10.9%，使得转基因大豆中
ALA 含量提高了 7 倍 [12]。
莱茵衣藻属于绿藻门、团藻目、衣藻科，是
一种单细胞真核鞭毛藻类。莱茵衣藻含有丰富的
PUFAs [11,13]，尤其是长链 PUFAs，如 EPA，所以其
PUFAs 合成的相关酶类比较丰富，具有很大的应用
前景。莱茵衣藻的基因组已经测序完成 [14-16]，且其
转录组也得到了分析 [17]，为本研究提供了分子基础。
本研究以拟南芥的 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因功能为对
照 [18]，在毕赤酵母中对莱茵衣藻的 ω-3 脂肪酸脱氢
酶基因的生物学功能进行分析，为第一代转基因植
物脂肪酸的优化创造条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinh
ardtii）品种为 CC-1690，由美国德克萨斯大学的藻
类中心提供 ；拟南芥（Arabidopsis thaliana）品种为
Colo 野生型，由中国农业科学院作物科学研究所馈
赠；大肠杆菌（Escherichia coil）DH5α、毕赤酵母
（Pichia pastoris）GS115 及表达载体 pPIC3.5K 为本
实验室保存。
1.1.2 酶及试剂 DNA 凝胶回收试剂盒与质粒小量
提取试剂盒均购自 Axygen 公司 ；pMD19-T 载体、各
种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、Ex Taq DNA 聚
合酶、反转录酶及 T4 DNA 连接酶均购自 TaKaRa 公
司，DNA 分子量标准购自天根生化科技有限公司 ；
其余试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基 LB 培养基，莱茵衣藻用 TAP 培养
基培养，毕赤酵母培养、筛选及诱导表达培养基参
照 Invitrogen 公司的毕赤酵母操作说明进行。
1.1.4 仪器设备 气相色谱仪，安捷伦 6890N ；摇
床 D250， 美 国 NBS 公 司 产 品 ；细 菌 恒 温 培 养 箱
DHP120， 上 海 实 验 仪 器 总 厂 ；RXZ-380B 型 培 养
箱，宁波江南仪器厂 ；台式常温离心机 5415D，德
国 Eppendorf ；台式冷冻离心机 2-16K，美国 Sigma ；
PCR 仪，美国 AmpGene 4800 ；凝胶成像系统 Eagle
EyeII System，美国 STRAGENE 公司 ；核酸电泳仪，
北京六一厂 ；可见分光光度计 UV-2100，美国 UNIC
公司 ；P10、P20、P100、P200 及 P1000 移液器，法
国 Gilson 公司。
1.1.5 引物 引物（表 1）由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因克隆 （1）设计引
物，根据 GenBank 公布的莱茵衣藻的 ω-3 脂肪酸
脱氢酶基因登录号 ：EF110555，与拟南芥的 ω-3
脂肪酸脱氢酶基因登录号 ：L22961，设计引物分别
为 NNJd15-5f、NNJd15-3r 与 LYd15-5f、LYd15-3r。
（2）提取拟南芥嫩叶与莱茵衣藻总 RNA，方法参照
TRIzol RNA 提取试剂说明书，RNA 纯化用 TaKaRa
的 DNase Ⅰ 酶。（3）RT-PCR， 以 总 RNA 为 模 板，
引物为 Oligo （dT）在反转录酶作用下反转录合成
cDNA。（4）PCR 扩 增， 以 cDNA 为 模 板，（1） 中
的引物，Ex Taq DNA 聚合酶，PCR 扩增程序 ：94℃
30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s 30 个循环。大肠杆菌转化，
PCR 产物回收、与 pMD19-T 载体连接、转化大肠杆
菌 DH5α 感受态细胞、重组质粒分别为 p19TL15d 与
p19TN15d，测序后进行 blast 分析 [19]。
1.2.2 ω-3 脱氢酶基因毕赤酵母表达载体构建 设
计上游带有 SnaB Ⅰ与下游带有 Not Ⅰ酶切位点的引
物 Ld15SN5f、Ld15SN3r 与 Nd15SN5f、Nd15SN3r ；
分 别 以 p19TL15d 与 p19TN15d 为 模 板 进 行 PCR 扩
增，纯化的 PCR 产物与 pMD19-T 载体连接、转化
大 肠 杆 菌 DH5α， 提 取 质 粒 pT-Ld15 与 pT-Nd15，
SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ双酶切鉴定 ；毕赤酵母表达载体
构 建，SnaB Ⅰ 与 Not Ⅰ 双 酶 切 pT-Ld15、pT-Nd15
与 pPIC3.5K，回收，用 T4 DNA 连接酶连接，转化
牛丽红等 ：莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达与活性分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期98
DH5α，质粒用 SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ双酶切鉴定。
1.2.3 毕赤酵母转化及鉴定 空载体 pPIC3.5K 与重
组质粒 p3.5K-Ld15 与 p3.5K-Nd15 经 Sal Ⅰ线性化，
苯酚 - 氯仿抽提，电击转化毕赤酵母 GS115，涂布
RDB 琼脂培养基上筛选转化子，平板于 30℃温箱培
养，直至单个菌落出现。挑取转化子转至不同 G418
浓度（0.5、1、2、4 mg/mL）的 YPD 固体培养基上
筛选高抗性菌株。以 5AOX1 与 3AOX1 为引物 PCR
鉴定 [19]。
1.2.4 毕赤酵母诱导表达及脂肪酸甲酯化 毕赤酵
母重组子接种于 30 mL BMGY 培养基中，于 30℃，
220 r/min 培养至 OD600 =3，离心收集菌体，重悬于
100 mL BMMY 培养基中，添加的底物为亚油酸，亚
油酸于 100% 甲醇中进行乳化，其终浓度为 200 μg/
mL。在 BMMY 培养基中用甲醇进行诱导表达，甲醇
终浓度梯度分别为 0.25%、0.5％、0.75% 与 1.0%，
置于 20℃、220 r/min 诱导表达，每 24 h 向培养基中
添加 100％甲醇使甲醇终浓度与上述梯度相同。诱
导后的 3 d，5 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，并用
无菌水洗涤 3 次（参照 Invitrogen 公司的毕赤酵母操
作说明书）。
菌体按每克菌 6 mL 的比例加入 4 mol/L 盐酸混
匀，室温放置 30 min，煮沸 3 min，-20℃迅速冷冻，
加入 2 倍体积氯仿 甲醇（1 1）提取液，充分震荡
后，5 000 r/min 5 min，取氯仿层，真空干燥除去氯
仿即得油脂，置于 10 mL 离心管中，加入 0.5 mol/L
的 KOH- 甲醇溶液，60℃水浴皂化，冷却加入 14%
三氟化硼 - 甲醇溶液，于 60℃水浴震荡 2 min，加
入正己烷 1 mL，加入饱和氯化钠溶液，静置，取上
清液进行气相色谱（GC）分析 [20]。
1.2.5 气相色谱分析脂肪酸组分气 相色谱（GC）条
件如下 : 色谱柱：VF-23MS，规格为 30 m×0.25 mm×
0.25 μm。进样口温度 ：260℃ ；分流比 ：100 1 ；
检测器温度 ：260℃。程序升温 ：初始温度 110℃保
持 3 min，以 4℃ /min 升至 220℃，保持 15 min。
2 结果
2.1 ω-3脂肪酸脱氢酶基因克隆
RT-PCR（图 1）分别扩增到两条序列，一条约 1.3
kb（样品 2-4），另一条约 1.5 kb（样品 7， 8），PCR
产物纯化后分别与 pMD19-T 载体连接，转化大肠杆
菌 DH5α 感受态细胞，经 PCR 鉴定后送样测序，序
列经 NCBI 网站的 blast 分析，得到莱茵衣藻 ω-3 脂
肪酸脱氢酶基因 lyd15 全长序列，大小为 1 362 bp，
拟南芥 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因 nnjd15 全长序列，大
小为 1 525 bp，得到质粒 p19TL15d 与 p19TN15d。
表 1 引物名称及序列
引物名称 基因名称 引物序列（5－3） 基因大小（kb）
NNJd15-5f
拟南芥ω-3脱氢酶基因（lyd15）
CAAGTTCTAATGGCGAACTTGG
1.5
NNJd15-3r AATGCAATGTATGGTATATATAGC
LYd15-5f
莱茵衣藻ω-3脱氢酶基因（nnjd15）
CCTCACCAGATACTTAGTTACA
1.3
LYd15-3r AGATGGACTACCATAACGC
5AOX1
乙醇氧化酶（AOX1）
GACTGGTTCCAATTGACAAGC 毕赤酵母: 2.2
pPIC3.5K: 0.23AOX1 GCAAATGGCATTCTGACATCC
Ld15SN5f
带SnaBⅠ与NotⅠ酶切位点的lyd15 TACGTAACCATGGAGCAGTGCCTGTCTCGCTCCAGCC 1.3
Ld15SN3r GCGGCCGCAGATGGACTACCATAACGCGGCAGGT
Nd15SN5f
带SnaBⅠ与NotⅠ酶切位点的nnjd15 TACGTAACCATGGAGGCGAACTTGGTCTTATCAGA 1.5
Nd15SN3r GCGGCCGCAATGCAATGTATGGTATATATAGCTTC
Ld15yc5f
lyd15鉴定基因
CCACCAGTCTTTCTCAAACA
0.5
Ld15yc3r GGTGGATCTTGTTGAAGATG
Nd15yc5f
nnjd15鉴定基因
AGAGCAGCTATACCTAAGCA
0.5
Nd15yc3r AGTGAGGACATCCTTTCTCT
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2.2 毕赤酵母表达载体的构建
用带有 SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ酶切位点的引物，分
别以 p19TL15d 与 p19TN15d 为模板，在 Ex Taq DNA
聚合酶作用下进行 PCR 扩增，亚克隆到 pMD19-T
载体中，经 PCR 鉴定，质粒经 SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ双
酶切鉴定。毕赤酵母表达载体构建流程图如图 2 所
示，SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ双酶切质粒 pT-Ld15、pT-Nd15
与 pPIC3.5K，回收带有酶切位点的 lyd15、nnjd15 基
因和线性化的 pPIC3.5K 载体，在 T4 DNA 连接酶作
用下目的基因片段与载体连接，转化 DH5α，提取
质粒 SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ双酶切鉴定，结果如图 3 所示，
p3.5K-Ld15/SnaB Ⅰ /Not Ⅰ有约 9 kb 与 1.3 kb 两条带，
p3.5K-Nd15/ SnaB Ⅰ / Not Ⅰ有约 9 kb 与 1.5 kb 两条
1. DM2000 Marker ；2-4. 莱茵衣藻 ω-3 脱氢酶基因 RT-PCR 产物 ；5, 6. 以
ddH2O 为模板的负对照 ；7, 8. 拟南芥 ω-3 脱氢酶基因 RT-PCR 产物
图 1 莱茵衣藻、拟南芥 ω-3 脱氢酶基因 RT-PCR 产物
1. λ/E Marker: 19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、
925、421 bp; 2. 重组质粒 p3.5K-Ld15 SnaB Ⅰ / NotⅠ双酶切 ; 3. 重组
质粒 p3.5K-Nd15 SnaB Ⅰ / NotⅠ双酶切 ; 4. DM2000 Marker
图 3 重组质粒双酶切分析
牛丽红等 ：莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达与活性分析
图 2 毕赤酵母表达载体构建流程图
SnaB Ⅰ
LYd15
Not Ⅰ
Not Ⅰ
3AOX1
3AOX1
3AOX1
3AOX1
5AOX15AOX1
Kanamycin
His4ORF
pBR322
Ampicillin
p3.5K-Nd15
10.5 kb
SnaB Ⅰ
NNJd15
Kanamycin
His4ORF
Not Ⅰ
LYd15
SnaB Ⅰ
pBR322
Ampicillin
p3.5K-Ld15
10.3 kb
pT-Ld15
4.0 kb
SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ
pBR322
Kanamycin
pPIC3.5K
9.0 kb
Ampicillin 5AOX1
3AOX1
His4ORF
Not Ⅰ
Avr ⅡEcoR Ⅰ
SnaB Ⅰ
BamH Ⅰ
pT-Nd15
4.2 kb
SnaB Ⅰ与 Not Ⅰ
Not Ⅰ
NNJd15
SnaB Ⅰ
带，与预期结果完全相符。成功构建了莱茵衣藻与
拟南芥 ω-3 脱氢酶基因的毕赤酵母表达载体 p3.5K-
Ld15 与 p3.5K-Nd15。
2.3 ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达
把经 Sal Ⅰ线性化的空载体 pPIC3.5K 和重组质
粒 p3.5K-Ld15 与 p3.5K-Nd15 电击转化到毕赤酵母
GS115 中，在 RDB 琼脂培养基上筛选转化子，用高
浓度的 G418 筛选基因整合高拷贝的菌株。以乙醇
氧化酶基因 AOX1 的引物 5AOX1 与 3AOX1 为引物
进行 PCR 鉴定，结果表明目的基因已经整合入毕赤
酵母基因组中。
以含空载体 pPIC3.5K 的受体菌为对照，含 lyd15
与 nnjd15 基因的毕赤酵母经甲醇诱导表达，RT-PCR
检测，结果如图 4 所示。此 RT-PCR 结果说明 ω-3
脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中能够正常转录。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期100
1. DM2000 marker; 2. lyd15模板为质粒pT-Ld15的正对照; 3, 5, 7, 9. 转
lyd15基因酵母RT-PCR产物; 13. nnjd15模板为质粒pT-Nd15的正对照; 14,
16, 18, 20. 转nnjd15基因酵母RT-PCR产物; 4, 6, 8, 10, 15, 17, 19, 21. 模板
分别为相应的总RNA; 11,22. 转pPIC3.5K空载体对照; 12. 模板ddH2O对照
图 4 转化毕赤酵母 RT-PCR 检测
2.4 ω-3脂肪酸脱氢酶的活性分析
毕赤酵母总脂肪酸甲酯化后，经 GC 分析，如
图 5 所 示， 图 5-A 为 转 空 载 体 对 照， 图 5-B 为 转
化含 lyd15 基因的毕赤酵母甲醇诱导的总脂肪酸甲
酯 GC 谱图，图 5-C 为转化含 nnjd15 基因的相应的
GC 谱图。对图谱进行分析，得到了毕赤酵母每种
具体的脂肪酸的摩尔含量，如表 2 所示，转空载体
pPIC3.5K 的毕赤酵母中亚油酸的含量为 44.3%，而
转 lyd15 的毕赤酵母中亚油酸的含量为 26.9%，转
nnjd15 基因的亚油酸的含量为 31.6%，由此可见亚
油酸的含量明显的降低了。而转空载体的毕赤酵母
中的亚麻酸为 3.6%，转 lyd15 与 nnjd15 基因的亚麻
酸的含量都为 4.5%，可见其含量有少量的提高。证
明莱茵衣藻与拟南芥的 ω-3 脱氢酶基因在毕赤酵母
中都得到了表达。
表 2 转 pPIC3.5K， p3.5K-Ld15 和 p3.5K-Nd15 毕
赤酵母总脂肪酸组分分析
毕赤酵母转化体
脂肪酸组分（摩尔含量 %）
18 2（LA） 18 3（ALA）
pPIC3.5K 44.3 3.6
p3.5K-Ld15 26.9 4.5
p3.5K-Nd15 31.6 4.5
A. 转空载体 pPIC3.5K ；B. 转 p3.5K-Ld15 的毕赤酵母 ；C. 转 p3.5K-Nd15 的毕赤酵母
图 5 毕赤酵母总脂肪酸的气相色谱分析图
60
归一化A
55
信
号
20
.51
2
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.51
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3 讨论
本研究利用 RT-PCR 技术克隆到莱茵衣藻的
ω-3 脂肪酸脱氢酶基因全长序列，并且转化入毕
赤酵母中，用甲醇进行诱导表达后，RT-PCR 检测
结果显示莱茵衣藻的 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在毕
赤酵母中已经正常转录，同时进行了 SDS-PAGE 检
测，但是电泳无目的蛋白条带出现，说明表达的目
的蛋白的含量太低 SDS-PAGE 检测不出。经气相色
谱对转基因毕赤酵母总脂肪酸甲酯进行分析，结果
显示，亚油酸的含量相比于转空载体的下降了 17%，
α- 亚麻酸含量也有所提高，证实此酶具有很好的活
性，在表达水平很低的情况下都能够使亚油酸转化
为 ALA。本研究为第一代转基因植物的脂肪酸优化
及品质改良提供了良好的基因，并奠定了基础。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是近几年发
展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的
甲醇营养型酵母表达系统 [21， 22]。因莱茵衣藻 ω-3 脂
肪酸脱氢酶结构信息不多，不能保证能够在不影响
酶活性的状况下得到大量的纯化的蛋白质，更重要
的是毕赤酵母本身含有丰富的油酸和亚油酸，是研
究脂肪酸脱氢酶生物学功能的良好的表达系统，在
不加其他底物的情况下，可直接用于 ω-3 脂肪酸脱
氢酶基因的生物学功能的验证 [23]。但在本研究中毕
赤酵母表达莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因的水平
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不高，可能原因是不同物种的基因存在密码子利用
偏好的问题，还需要继续优化毕赤酵母对脱氢酶基
因的系统。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
牛丽红等 ：莱茵衣藻 ω-3 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达与活性分析