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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族（SnRKs）在植
物许多生理过程中起着重要的作用，根据基因序列
的相似性和基因结构的不同将其分为 3 个亚家族，
分 别 是 SnRK1，SnRK2 和 SnRK3［1-3］。SnRK2 亚 家
族是植物中所特有的一类，参与植物逆境胁迫，对
植物抵御不良环境具有一定的调节作用，已在拟南
收稿日期 ：2012-09-18
基金项目 ： 国家科技支撑计划（2012BAD06B03），国家马铃薯产业技术体系，甘肃省科技重大专项计划（1102NKDA025），甘肃省财政厅
农牧林业务专项资金，甘肃农业大学 SRTP 科研项目（20120104）
作者简介 ： 刘思妍，女，在读本科生，研究方向 ：农学专业 ；E-mail ：991630916@qq.com
通讯作者 ： 王蒂，男，硕士，教授，研究方向 ：马铃薯育种 ；E-mail ：wangd@gsau.edu.cn
白江平，男，博士，副教授，研究方向 ：基因工程 ；E-mail ：baijp@gsau.edu.cn
马铃薯 StSnRK2.1 基因克隆与生物信息学分析
刘思妍  毛娟  范阿棋  张俊莲  王蒂  白江平
（甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 甘肃省干旱生境作物学重点实验室 甘肃农业大学农学院，兰州 730070）
摘 要 ： SnRK2 基因对植物的逆境胁迫具有重要的调节作用，以马铃薯‘陇薯 3 号’（Solanum tuberosum）为试材，采用
RT-PCR 方法从马铃薯试管苗中克隆得到 1 个 SnRK2.1 基因 cDNA，命名为 StSnRK2.1，提交 GenBank 注册，注册号为 JX280911。
通过生物信息学分析，该基因开放阅读框全长 1 008 bp，编码 335 个氨基酸。预测蛋白质分子量约为 37.77 kD，等电点为 5.37，蛋
白质二级结构预测 α-螺旋 42.39%，延伸链 16.42%，β-折叠 7.46%，无规卷曲 33.73%，具有疏水性，为膜内蛋白。亚细胞定位显示
该基因出现在细胞质及微体中的可能性较大。肽链可能有 7 处丝氨酸磷酸化位点，2 处苏氨酸磷酸化位点，以及 3 处酪氨酸磷酸化
位点，因此推测该基因在植物抗逆中有重要的作用。
关键词 ： 马铃薯 抗旱 基因克隆 生物信息学分析
Cloning and Bioinformation Analysiss of StSnRK2.1 Gene in
Solanum tuberosum
Liu Siyan Mao Juan Fan Aqi Zhang Junlian Wang Di Bai Jiangping
（Gansu Key Laboratory of Crop Improvement and Germplasm Enhancement，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，College
of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract:  SnRK2s plays an important role in the regulation when plants suffer from adervise environments. The full-length cDNA
sequence of SnRK2.1 in Solanum tuberosum was successfully cloned by RT-PCR with the tube plant. The gene was named StSnRK2.1 and
has been submitted to Genbank with the accession number JX280911.By bioinformation analysis, the results showed that the StSnRK2.1 has a
complete ORF sequence is 1 008 bp, encoding 335 predicted amino acids. The protein molecular weight is 37.77 kD and theoretical pI is 5.37.
In protein’s secondary structure, Alpha helix is 42.39%, Extended strand 16.42%, Bela turn is 7.46%, Random coil is 33.73%. Also, the protein
is drophilicity, haven’t transmembrane. It is probably exit in the cytoplasm and microbody by subcellular localization prediction of protein. There
are seven serine sites, two threonine sites, three tyrosine sites, so it is putative that the StSnRK2.1 is related to plant’s tolerance in abiotic stress.
Key words:  Solanum tuberosum Anti-drought Cloning Bioinformation analysis
芥、水稻、玉米中克隆并鉴定了其功能［4，5］。
马铃薯作为粮菜兼用型作物，在作物生产中占
有极其重要的作用，尤其对我国西部干旱地区。但
是马铃薯对干旱、高温等非生物性胁迫的响应遗传
机理与种质的改良还都处于初始阶段［6-8］，其原因
一方面是植物响应逆境胁迫的数量遗传背景以及生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期84
理机理的复杂性使得抗旱育种的进展非常缓慢［9， 10］，
另一方面是因为马铃薯多倍体遗传背景的复杂性限
制了对马铃薯功能基因组的研究和生物技术在马铃
薯种质改良中的应用 ［11-17］。SnRK2 家族基因被认为
与植物响应逆境胁迫有紧密联系［18，19］，甘肃主栽品
种陇薯 3 号与其他品种相比具有明显的抗旱性。本
研究从陇薯 3 号中分离 SnRK2 基因家族并对其功能
进行分析预测，拟使其对改善植物抵抗逆境胁迫研
究具有积极地推动作用。
1 材料与方法
1.1 材料
马铃薯试管苗（陇薯 3 号）由甘肃省遗传改良
与种质创新重点实验室保存。
E. coli DH5α， 本 实 验 室 保 存 ；载 体 pGEM-
Teasy，购自 Promega 公司 ；RNA 提取试剂盒、琼脂
糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒， 购 自 TIANGEN 公 司 ；
M-MuLV 第 一 链 cDNA 合 成 试 剂 盒、DreamTaqTM
Green PCR Master Mix（2X）及引物设计由上海生工
生物工程有限公司承担。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成 按
照 TIANGEN 公司的 RNA 提取试剂盒操作说明书提
供的方法提取马铃薯试管苗总 RNA。参照上海生工
的反转录试剂盒的操作说明得到反转录产物并保存
在 -20℃下备用。
1.2.2 RT-PCR 法扩增 StSnRK2.1 基因 根据 SnRK2
同源序列设计引物 ：上游引物为 ：5-GCTCTAGAAT-
GGAGCGTTATGAGATAGTGAAG-3（下划线部分为
Xba Ⅰ酶切位点）；下游引物为 ：5-GCGAGCTCTC
ACAGTAAACCAGCAAAATCAG-3（ 下 划 线 部 分 为
Sac Ⅰ酶切位点）。扩增条件为：95℃ 1 min，95℃ 30 s，
55℃ 1 min，72℃ 1 min，40 个循环，72℃ 10 min。
PCR 产物经胶回收试剂盒纯化后保存在 -20℃下
备用。
1.2.3 载体 pGEM-Teasy 的构建 将纯化后的 PCR
产物与 T-esay 载体相连接，并将连接产物转化入感
受态细胞。感受态细胞的制备参照《分子克隆实验
指南》［19］。
1.2.4 重组质粒的鉴定及测序 将转化细胞涂布在
含 25 μL（20 mg/mL）IPTG，15 μL（50 μg/mL）X-gal，
100 μL（25 μg/mL）Ampr 的 LB 平板上进行蓝白斑筛
选，随机挑选白色菌斑 加入含 Ampr 抗生素的 LB 液
体培养基中摇荡过夜进行菌液 PCR 检测阳性克隆。
然后再通过质粒滞后及酶切鉴定后送测序。
1.2.5 生物信息学分析 将含有目的片段的菌液
送生工测序。通过 NCBI 网站上的 blast 搜索引擎
对测序结果进行同源性分析 ；利用 ExPASy 网站对
StSnRK2.1 基因的编码蛋白进行氨基酸组成、等电
点等理化性质及亲 / 疏水性进行分析 ；利用 CBS 网
站上提供的软件进行跨膜分析 ；利用 WoLF PSORT
网站对基因编码蛋白进行亚细胞定位的预测 ；利
用 DNAMAN 软件完成对分子进化树的构建 ；利用
PredictProteinPHD 信息库对蛋白质序列进行二级结
构预测；利用 NetPhos2.0 Server 进行蛋白磷酸化预测。
2 结果
2.1 马铃薯总RNA提取及RT-PCR扩增目的基因
提取马铃薯试管苗总 RNA，结果如图 1 所示，
提取的 RNA28S，18S，5S 条带清晰、完整，说明
RNA 没有发生降解，能够用于反转录。以反转录产
物为模板，采用 RT-PCR 扩增目的基因，结果如图
2 所示，扩增出与预期大小相符的特异性条带，在
1 000 bp 左右。
28S
18S
5S
图 1 马铃薯总 RNA 电泳图
2.2 目的基因的克隆与鉴定
将扩增得到的目的基因片段回收并且与 pGEM-
Teasy 连接并转化到大肠杆菌 DH5α 中，通过蓝白斑
筛选，挑选白色重组质粒进行菌落 PCR 鉴定，结果
2013年第3期 85刘思妍等 ：马铃薯 StSnRK2.1 基因克隆与生物信息学分析
如图 3 所示，能够扩增出大小为 1 000 bp 左右的预
期片段 ；用 EcoR I 酶切质粒，能够切下预期的片段
（图 4），说明可能获得了马铃薯 StSnRK2.1 的 cDNA
片段。
2.3 StSnRK2.1基因cDNA序列分析
将重组质粒送上海生工进行测序，测序结果如
图 2 StSnrk2.1 基因扩增结果
ⴞⲴ⡷⇥
2000
bp
1 M
1500
1000
700
400
200
2000
bp
M 1 2 3 4
1500
1000
700
400
200
M ：DNA 分子量标准 ；1-4 ：均为 PCR 扩增产物1 ：RT-PCR 扩增产物 ；M ：DNA 分子量标准
图 3 StSnrk2.1 基因菌液 PCR 结果
M 1 2
1000
bp
图 4 酶切 StSnRK2.1
M ：DNA 分子量标准 ；1 ：酶切产物 ；2 ：PCR 产物
图 5 所示，该基因开放阅读框全长 1 008 bp，编码
335 个氨基酸，将基因命名为 StSnRK2.1。
2.4 StSnRK2.1基因系统发生树的构建
利用 DNAMAN 软件构建了 SnRK2 基因的系统
发生树，结果如图 6。利用该软件对其进行多重序
列比对，结果表明，StSnRK2.1 与蒺藜苜蓿的 SnRK
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图 5 StSnRK2.1 基因全长序列及编码氨基酸序列
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期86
基因相似性最高，为 77.65% ；与蓖麻 SnRK 基因相
似性次之，达 77.22% ；与高粱 SnRK 基因相似性也
较高，达 75%。为了更好地了解不同物种中 SnRK2
的同源关系，将 StSnRK2.1 与其他植物一起进行基
因的同源性分析，结果如图 7 所示。从图 7 可以看出，
该基因家族在 N 端相对保守，而在 C 端则特异性极
其明显。
2.5 StSnRK2.1基因编码蛋白的一级结构及亲水性
分析
对编码该基因的氨基酸种类及数量统计，如表
1 所示。氨基酸的亲水性分析数据表明该基因编码
蛋白在第 50 个氨基酸附近具有最大亲水位置，在第
200 个氨基酸附近有最大疏水位置，且在较多位置
上均表现出疏水性，可见该基因可能属于疏水性（图
图 6 不同植物 SnRk2 基因的系统发生树
表 1 StSnrk2.1 基因编码蛋白的氨基酸含量
氨基酸组成 数量 百分比（%） 氨基酸组成 数量 百分比（%）
丙氨酸（Ala） 23 6.87 甲硫氨酸（Met） 9 2.69
半胱氨酸（Cys） 8 2.39 天冬酰胺（Asn） 11 3.28
天冬氨酸（Asp） 17 5.07 脯氨酸（Pro） 15 4.48
谷氨酸（Glu） 30 8.96 谷氨酰胺（Gln） 12 3.58
苯丙氨酸（Phe） 17 5.07 精氨酸（Arg） 16 4.78
甘氨酸（Gly） 20 5.97 丝氨酸（Ser） 22 6.57
组氨酸（His） 10 2.99 苏氨酸（Thr） 14 4.18
异亮氨酸（IIe） 24 7.16 缬氨酸（Val） 25 7.46
赖氨酸（Lys） 19 5.67 色氨酸（Trp） 2 0.60
亮氨酸（Leu） 30 8.96 酪氨酸（Tyr） 11 3.28
StSnrk2.1
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98%
95%
93%
92%
90%
87%
84%
79%
75%
72%
100% 70%95% 90% 85% 80% 75%
8），该基因的跨膜分析结果表明该肽链有 3 个跨膜
区域，但是蛋白并未跨膜。
2.6 StSnRK2.1基因编码蛋白的二级结构分析及亚
细胞定位
利用 SOPMA 网站预测马铃薯 StSnRK2.1 基因
编码蛋白的二级结构，发现其二级结构主要有 4 种
类型，分别为 α-螺旋，β-折叠，延伸链和无规则卷
曲，其中主要以 α-螺旋为主，β-折叠最少，具体数
据如表 2 所示。对于该基因的亚细胞定位分析是通
过 PSORT 网站完成，由结果（表 3）可知该基因出
现在细胞质及微体中的可能性较大。
2.7 StSnRK2.1基因编码蛋白的三级结构预测及磷
酸化位点分析
利用 ExPASy 网站上提供的软件对该基因的编
码蛋白进行三级结构的预测，可以清楚地看到该蛋
白具有丰富的 α-螺旋结构，无规则卷曲也较明显（图
9），从而验证了 SOPMA 网站对其二级结构的预测。
该基因磷酸化位点的分析结果（图 10）显示该肽链
有 7 处丝氨酸磷酸化位点，2 处苏氨酸磷酸化位点，
以及 3 处酪氨酸磷酸化位点。
3 讨 论
在不同的生态条件下，植物体逐渐形成了不
同的生理反应机制，尤其是对逆境胁迫的抵抗。研
究表明，SnRK2 家族基因在逆境环境中起重要作
用［20-24］。本研究利用同源克隆的方法从马铃薯试
管 苗 RNA 中 成 功 克 隆 得 到 SnRK2 的 同 源 基 因 —
StSnRK2.1，将测序所得碱基序列与预测碱基序列
通过 DNAMAN 软件进行比对，发现二者相似性达
2013年第3期 87刘思妍等 ：马铃薯 StSnRK2.1 基因克隆与生物信息学分析
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Consensus g g d df
ye g gnf va lv d t f avk i e rg k i d vq r e i n h r s l hpni
60
120
180
240
300
图 7 StSnRK2.1 基因与其他物种中 Snrk2 家族基因进行多序列比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期88
98.61%，其中只有 13 个碱基发生变化，发生这种
现象的原因可能是因为克隆时所使用的模板与网站
上提交的序列不是来自同一品种马铃薯 ；另一种原
因可能是在扩增过程中碱基发生了突变。但是当对
两个序列的氨基酸进行比对时发现二者相似度高达
100%，因此可以猜测碱基不同是由于马铃薯品种不
同而使同一氨基酸的密码子不同导致的。此外，将
StSnRk2.1 基因的编码蛋白与另外 10 个物种的蛋白
质序列进行同源性比较时发现，这些基因在 N 端具
有一定的保守性，而在 C 端则高度特异，据此推测
该基因在进化过程中是比较保守的，对逆境胁迫的
响应可能与 SnRK2 家族中的其他基因一样具有一定
的一致性。
蛋白质的磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白
翻译后修饰方式。它是植物在逆境胁迫条件下体内
能量代谢和信号传递中的重要生化反应［25］。一般来
说，多肽链的氨基酸潜在的磷酸化位点越多，发挥
更多功能的可能性就越大。从分析所得的数据中，
该肽链有 7 处丝氨酸磷酸化位点，2 处苏氨酸磷酸
化位点，以及 3 处酪氨酸磷酸化位点可知该肽链潜
在的磷酸化位点较多。由此也可推测，StSnRK2.1 可
能也是通过可逆的磷酸化反应对逆境胁迫进行感知
和应答的。
4 结论
本研究从马铃薯试管苗中克隆得到 1 个 SnRK2.1
基因，命名为 StSnRK2.1。通过生物信息学分析，得
到了该基因开放阅读框全长及其编码氨基酸，蛋白
质分子量、等电点、蛋白质二级结构以及亲疏水性，
通过分析认为其为膜内蛋白，亚细胞定位显示该基
因出现在细胞质及微体中的可能性较大。肽链有 7
处丝氨酸磷酸化位点，2 处苏氨酸磷酸化位点，以
及 3 处酪氨酸磷酸化位点，推测该基因在植物抗逆
中起一定作用。
参 考 文 献
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50
2.5
2.0
1.5
0.5
1.0
0.0
1.0
1.5
0.5
2.0
2.5
100 150 200 250 300
Sc
or
e
Position
图 8 StSnRK2.1 基因编码蛋白的亲水性分析
表 2 StSnRK2.1 基因编码蛋白的二级结构分析
结构类型 数量（比例）
α-螺旋（Hh） 142（42.39%）
β-折叠（Tt） 25（7.46%）
延伸连 （Ee） 55（16.42%）
无规卷曲 （Cc） 113（33.73%）
表 3 StSnRK2.1 基因编码蛋白的亚细胞定位分析
位置 几率（%）
细胞质 45
微体 30
线粒体基质 10
叶绿体囊体膜 10
图 10 StSnRK2.1 基因磷酸化位点分析
图 9 StSnRK2.1 基因编码蛋白的三级结构
0
Ph
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ph
or
yl
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n
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nt
ia
l
0 50 100 150 200 250 300
1
Sequence position
SerineThreonineTyrosine
Threshold
2013年第3期 89刘思妍等 ：马铃薯 StSnRK2.1 基因克隆与生物信息学分析
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（责任编辑 李楠）