全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
反刍动物瘤胃中甲烷的生成会造成饲料能量
的损失，同时甲烷也是造成温室效应的主要气体
之一。它对温室效应的作用是 CO2 的 25 倍，全球
每 年 由 反 刍 动 物 排 放 的 甲 烷 达 8.1×107-9.2×107
t， 这 相 当 于 人 类 制 造 的 甲 烷 的 23%-27%［1］。 产
甲烷菌不足瘤胃微生物总量的 4%，但几乎产生了
反刍动物释放的全部甲烷［2］。将产甲烷菌的活性
和数量控制在最适水平，达到反刍动物最佳的生
产性能而对环境不造成影响是目前研究的重要方
向。产甲烷菌是严格厌氧的古菌，一些在体内可以
发现的产甲烷菌在体外很难分离培养。所以到目前
收稿日期 ：2013-09-03
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31261140365），科技支撑计划项目（2012BAD12B02），中国科学院知识创新工程重要方向项目
（XDA01010301）
作者简介 ：王兴文，男，硕士研究生，研究方向 ：反刍动物营养 ；E-mail ：xing.wen111@163.com
通讯作者 ：卜登攀，副研究员，硕士生导师，研究方向 ：反刍动物营养与代谢调控 ；E-mail ：burdengpan@gmail.com
未培养技术在瘤胃产甲烷菌群研究中的应用
王兴文1，2  王加启1  赵圣国1  李发弟2  卜登攀1
（1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室，北京 100193 ；2. 甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）
摘 要 ： 瘤胃中的产甲烷菌为严格厌氧微生物，很难通过分离培养的方法进行研究。现已经培养并公布的瘤胃产甲烷菌只
有 4 种，成千上万种类的瘤胃产甲烷菌不能培养出来。未培养技术的发展与应用突破了传统分离培养检测方法的限制，使瘤胃产
甲烷菌的研究有了较大的进展。综述了实时定量 PCR、16S rDNA 文库、DGGE 和高通量测序技术等 6 项具有代表性的未培养技术
及其在瘤胃产甲烷菌研究中的应用，为以后瘤胃产甲烷菌的研究提供方法上的参考。
关键词 ： 瘤胃 产甲烷菌 未培养技术 全基因组测序 高通量测序
The Application of Uncultured Methods in the Study of Ruminal
Methanogen Population
Wang Xingwen1，2 Wang Jiaqi1 Zhao Shengguo1 Li Fadi2 Bu Dengpan1
（1. State Key Laboratory of Animal Science，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100193 ；
2. College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract:  The ruminal methanogen are strictly anaerobic, which are hard to culture.The ruminal methanogen which have been cultured
successfully are only 4 species.while hundreds of species of methanogen could not be cultured.The application and development of uncultured
technology promotes the research of ruminal methanogen, which overcome the limitation of the tranditional technology of isolation and culturing.
Several dominant culture-independent technologies used to study ruminal methanogens were introduced in this paper to provide references on
methods for future ruminal methanogen study.
Key words:  Rumen Methanogen Uncultured methods Whole genome sequencing High throughput DNA sequencing
为止，只有很少种类的产甲烷菌从瘤胃中分离出
来，已经分离培养出来的瘤胃产甲烷菌主要为甲
酸 甲 烷 杆 菌（Methanobacterium formicicum）、 布 氏
甲烷杆菌（Methanobacterium byantii）、甲烷短杆菌
（Methanobrevibacter ruminantium）和可移动的甲烷微
菌（Methanomicrobium mobile）［3］。随着分子生物学
的发展，未培养技术已越来越多地应用到瘤胃产甲
烷菌的研究中，通过未培养技术可以不需要产甲烷
菌的分离培养就可以准确地研究瘤胃中的产甲烷菌
性质。本文主要介绍几种未培养技术以及其在产甲
烷菌研究上的应用。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期68
1 产甲烷菌多样性
1.1 产甲烷菌的引物
产甲烷菌研究中目的基因主要为 16S rDNA 和
mcrA 基因，16S rDNA 是编码核糖体 RNA（rRNA）
分子的对应的 DNA 序列，既具有保守性，又具有高
变性。保守性能够反应出生物物种的亲缘关系，为
系统发育重建提供线索 ；高变性则能揭示出生物物
种的特征核酸序列。mcrA 基因编码甲基辅酶 M 还
原酶（MCR）的 α 亚基，甲基辅酶 M 还原酶是甲烷
产生过程中的一种关键酶，这种酶将与它的连接的
甲基还原为 CH4
［4］，它是产甲烷菌所独有的目的基
因。16S rDNA 的常见引物已在表 1 中列出，mcrA
基因的常见引物已在表 2 中列出。
1.2 变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel
electrophoresis，DGGE）
DGGE 技术以 DNA 指纹图谱为基础，利用了
DNA 分子从双螺旋型到局部变性时电泳迁移率会急
剧下降的原理。在得到的图谱中每一个条带都代表
着某个微生物优势菌群。
Zhou 等［26］以 16S rDNA 为目的基因利用 DGGE
研究两种不同日粮 ：生长期的日粮（高能量）和
育肥期的日粮（低能量）对瘤胃产甲烷菌的影响。
从 DGGE 的图谱中发现，两种日粮的优势条带不
同，测序发现低能量日粮主要以 Methanobrevibacter
ruminantium NT7 为主，而高精料日料含有 Methano-
brevibacter smithii、Methanobrevibacter sp. AbM4 和 M.
ruminantium NT7。Popova 等［34］用高精料日粮和低
精料日粮饲喂奶牛，以 mcrA 基因作为目的基因用
DGGE 的方法研究产甲烷菌的多样性，发现高精料
日粮饲喂的奶牛产甲烷菌的多样性明显低于高粗料
日粮组，日粮中的细胞壁成分的含量与瘤胃内的产
甲烷菌的多样性成正比。Monica 等［35］利用 DGGE
观察驯鹿两个时期（即驯鹿采食量的高峰期和低谷
期）瘤胃产甲烷菌多样性发现，两组没有较大差别，
说明采食量不会引起驯鹿瘤胃微生物的多样性的
变化。
Zhou 等［36］在奶牛饲粮中添加外源纤维素酶，
甲烷生成量增加，为了解外源纤维分解酶对瘤胃产
甲烷菌多样性和数量的影响以及甲烷产量和产甲烷
菌群落结构的关系，应用实时定量 PCR 和 DGGE 技
术，发现瘤胃产甲烷菌的数量没有改变，但是瘤胃
产甲烷菌的多样性发生了改变。Cheng 等［37］用 3 对
引 物（344fGC/915r、519f/915rGC 和 1106fGC/1378r）
作 DGGE 研究中国西部绵羊产甲烷菌的多样性发现，
引物 519f/915rGC 产生的条带分辨率最高。
DGGE 直接利用微生物样品中的 DNA 或 RNA
对微生物群体加以区别，能解决微生物无法进行体
外培养的难题，可判断出微生物间的种属关系，甚
至还可以发现新的微生物。但是 DGGE 技术也存在
一些缺点，如 DNA 的分离技术不同，细胞壁的破裂
程度不同，DNA 的回收率不同以及 PCR 不均等扩增
都会造成试验结果的不同。此外，当微生物的 DNA
量不到样品 DNA 量的 1％时，很难检测其条带。有
一些产甲烷菌的基因组中含有多个目的基因的拷贝，
就会过高的估计产甲烷菌的数量。
1.3 16S rDNA/mcrA基因建库
构建 16S rDNA/mcrA 文库可以对某一特定环境
中甲烷菌群落结构和多样性进行分析。用 PCR 技术
扩增特异的产甲烷菌的基因，然后将这种特异的基
因与载体连接，转入大肠杆菌形成文库，选取阳性
克隆测序，在测序的结果中去除载体和嵌合体序列，
得到的序列与 GenBank/RDP 数据库比对，就可以知
道每个克隆中的片段属于那一种微生物。
Franzolin 等［38］ 研究不同粗饲料类型（牧草、
玉米秸秆和甘蔗）对瘤胃产甲烷菌的影响，经 16S
rDNA 建库后，得到 467 个克隆，包含 19 个操作分
类单元 ：其中有 4 个在 3 个文库中都存在，8 个是
特异的，6 个存在于玉米秸秆组和牧草组，1 个存在
于甘蔗组和牧草组，由此发现不同粗饲料类型会改
变瘤胃产甲烷菌的多样性。Huang 等［39］为了解牦牛
甲烷产量少于青藏高原牛的原因，构建牦牛和青藏
高原牛瘤胃产甲烷菌 16S rDNA 文库，在牦牛的文库
中发现了 209 个克隆，青藏高原牛文库中 205 个克
隆，将相似度在 98% 及以上归为一个操作分类单元，
共发现了 95 个操作分类单元 ：牦牛单独含有 46 个
操作分类单元，青藏高原牛含有 34 个操作分类单元，
在两个文库中都存在的操作分类单元有 15 个。牦牛
瘤胃的产甲烷多样性要高于青藏高原牛。
2014年第6期 69王兴文等 ：未培养技术在瘤胃产甲烷菌群研究中的应用
表 1 产甲烷菌 16S rDNA 引物［5］
引物 序列（5-3）
Methano-
brevibacter
Methano-
bacterium
Methano-
sphaera
Methano-
culleus
Methano-
microbium
MeMetha-
nosarcina
Methan-
ococcus
参考文献
Ar1000f AGTCAGGCAACGAGCGAGA + + + + + - - ［6］
Ar1500r GGTTACCTTGTTACGACTT + + + + + + - ［6］
1Af TCYGKTTGATCCYGSCRGAG + + + + + + + ［7］
1100Ar TGGGTCTCGCTCGTTG + + + + + + - ［7］
Archf364 CCTACGGGRBGCAGCAGG + + + + + + + ［8］
Archr1386 GCGGTGTGTGCAAGGAGC + + + + + + + ［8］
D30f ATTCCGGTTGATCCTGC - - - + - - - ［9］
D33r TCGCGCCTGCGCCCCGT - - - - - - - ［9］
0025ef CTGGTTGATCCTGCCAG + + + + + + - ［9］
1492r GGTTACCTTGTTACGACTT + + + + + + - ［9］
Met86f GCTCAGTAACACGTGG + + + + + + + ［10］
Met1340r CGGTGTGTGCAAGGAG + + + + + + + ［10］
Archf TTCCGGTTGATCCYGCCGGA - + + + + + + ［11］
Archr YCCGGCGTTGAMTCCAATT + + + + + + + ［11］
A109f ACKGCTCAGTAACACGT + + + + + + + ［12］
21f TTCCGGTTGATCCYGCCGGA - + + + + + + ［13］
958r YCCGGCGTTGAMTCCAATT + + + + + + + ［13］
Arch69f TAAGCCATGCAAGTCGACG - - - - - - - ［14］
146f GGSATAACCYCGGGAAACTCC - - - - - - - ［15］
1324r GCGAGTTACAGCCCWCRA + + + - - - + ［15］
519r GWATTACCGCGGCKGCTG + + + + + + + ［16］
380r TTTCGCGCCTGCTGC + + + + + + + ［16］
A2Fa TTCCGGTTGATCCYGCCRGA - + + + - + + ［17］
A348r CCCCRTAGGGCCYGG + + + + + + + ［18］
A329r TGTCTCAGGTTCCATCTCCG + + + - - + - ［19］
A24f TCYGKTTGATCCYGSCRGA + + + + + + + ［18］
ARC344f ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA + + + + + + + ［20］
A357f CCCTACGGGGCGCAGCAG + + + + + + + ［19］
A693r GGATTACARGATTTC + + + + - + - ［19］
ARC915r GTGCTCCCCCGCCAATTCCT + + + + + + + ［21］
UNI-b-rev GACGGGCGGTGTGTRCAA + + + + + + + ［22］
A1040f GAGAGGWGGTGCATGGCC + + + + + + + ［18］
A1204r TTMGGGGCATRCIKACCT + + + + + + + ［18］
Met448F GGTGCCAGCCGCCGC + + + + + + - ［23］
Met1027F GTCAGGCAACGAGCGAGACC + + + + + + - ［23］
Met448R GCGGCGGCTGGCACC + + + + + + - ［23］
Met1027R GGTCTCGCTCGTTGCC + + + + + + - ［23］
Met83F ACKGCTCAGTAACAC + + + + + + + ［23］
Archr934 GTGCTCCCCCGCCAATTC + + + + + + + ［8］
Archf331 GAGATGGAACCTGAGACAAG + + + - + - - ［8］
Archf2 TTCYGGTTGATCCYGCCRGA - + + + + + + ［8］
MSrr859 TCGCTTCACGGCTTCCCTG - + - + - + - ［8］
Mccr WASTVGCAACATAGGGCACGG - - - - - - + ［8］
fMbb1 CTCCGCAATGTGAGAAATCG + - + - - - - ［8］
fMbium CGTTCGTAGCCGGCYTGA + + + - - - - ［8］
ArcF915 AGGAATTGGCGGGGGAGCAC + + + + + + + ［24］
ArcR1326 TGTGTGCAAGGAGCAGGGAC + + + + + + + ［24］
1392R ACGGGCGGTGTGTRC + + + + + + + ［25］
M301F TACGGGTTGTGAGAGCAAGA + + + + - + - ［14］
uniMet1-F CCGGAGATGGAACCTGAGAC + + + _ + + + ［26］
uniMet-R CGGTCTTGCCCAGCTCTTATTC + + + _ + + + ［26］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期70
裴彩霞等［40］采用 3 对特异性引物扩增瘤胃古
菌 16S rRNA 基因分别建立克隆文库研究晋南牛瘤
胃产甲烷菌的多样性，引物 Archf364/r1386 建立的
克隆库中，克隆分为 4 类，分别与 Methanobrebacter.
ap.1Y（61%）、SM9（23%）、NT7（14%） 和 AK-87
（2%） 相 似。 引 物 1Af/1100Ar 建 立 的 克 隆 库 中，
克 隆 分 为 两 类， 分 别 与 Methanobacterium aarhus-
ense（72%）和 Methanosphaera stadtmanae DSM3091
（28%）相似。引物 Met86F/Met1340R 建立的克隆文
库反映的古菌种类较为全面，除 4 种甲烷短杆菌（所
占比例分别为 47%、26%、11% 和 3%）外，还有
Methanomicrobium mobile（2%）、以及类似 Methano-
bacterium aarhusense（1%）和 Methanosphaera stadtm-
anae（3%）的序列，还有 7% 的未匹配序列。Tyme-
nsen 等［41］分别利用 16S rDNA 和 mcrA 建立文库研
究瘤胃液和附着在原虫上的产甲烷菌的多样性，结
果表明瘤胃液中产甲烷菌的多样性要显著高于附着
在原虫上的产甲烷菌。Hook 等［42］通过 16S rDNA 建
库和 DGGE 的方法研究莫能菌素对瘤胃产甲烷菌多
样性的影响发现，莫能菌素不会影响产甲烷菌的多
样性。
建立基因文库较为准确，可以精确地了解瘤
胃内产甲烷菌的系统分类。在实际研究中常常与
DGGE 相结合。但是要得到全面准确的数据，就要
得到足够的克隆，挑取克隆的过程和步骤较为繁琐，
测序的费用也相当高。而且即使有相当量的克隆也
有可能遗漏一些丰度较低的基因。
1.4 限制性片段长度多态性（Restriction fragment
length polymorphism，RFLP）技术
RFLP（T-RFLP）技术通过检测 DNA 在限制性
内切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小以识别
限制性片段长度的多态性。现在已经发展出末端限
制性片段长度多态性技术等，T-RFLP 在技术上与
RFLP 相似，只是其中的一个引物的 5 端用荧光物
质标记，将 PCR 产物进行特异的酶切后就产生了许
多不同长度的限制性片段，其中带有荧光标记的目
标片段就可以被 DNA 自动测序仪检测到。
Frey 等［43］为了了解泌乳牛瘤胃、十二指肠、
回肠和粪便中产甲烷菌的多样性，应用 RFLP 技术
研究发现在 4 个部位的产甲烷菌多样性差异不显著。
Danielsson 等［44］应用 T-RFLP 技术和 16S rDNA 建库
结合研究不同日粮精粗比例对瘤胃产甲烷菌的影响，
发现日粮精粗比与瘤胃产甲烷菌的多样性成反比。
1.5 高通量测序
高通量测序是通过对小亚基核糖体（如 16S
rRNA）基因高变区进行测序快速的检测样本中产甲
烷菌的多样性。在转录组学研究中，RNA-seq 直接
定量检测瘤胃产甲烷菌的转录出来的 mRNA 的数量，
从而了解产甲烷菌中代谢所需酶的活性［45，46］。
Fout 等［47］利用高通量测序来检测瘤胃产甲烷
菌多样性，得到 138 个序列，97% 相似度序列归
类分析，发现了 20 个 OTU。其中 18 个 OTU 为数
据库中已存在的序列，2 个 OTU 为新菌，分别与
Methanobrevibacter 和 Thermogymnomonas 最为相似。
Hristov 等［48］利用高通量测序检测日粮中添加
不饱和脂肪酸对瘤胃中产甲烷菌的影响，发现添加
不饱和脂肪酸可以明显增加 Methanosphaera 的数量
而减少 Methanobrevibacter 的数量。
Lee 等［49］研究韩国本地 1 种羊和 3 种牛的瘤胃
产甲烷菌群落结构，高通量测序发现在 4 种动物的
体内都不存在未知的产甲烷菌，都可以在数据库中
找到。
表 2 产甲烷菌 mcrA 基因引物［5］
引物 序列（5-3） 参考文献
ME1 GCMATGCARATHGGWATGTC ［27］
mcrAforward GGTGGTGTMGGATTCACACARTAY- ［28］
GCWACAGC
mcrAreverse TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT ［28］
ME1 GCMATGCARATHGGWATGTC ［27］
ME2 TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT ［27］
AOM39-F GCTGTGTAGCAGGAGAGTCA ［29］
AOM40-R GATTATCAGGTCACGCTCAC ［29］
qmcrA-F TTCGGTGGATCDCARAGRGC ［30］
qmcrA-R GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC ［30］
MrtAfor AAACAATCAACCACGCACTC ［31］
MrtArev GTGAGCCCAATCGAAGGA ［31］
mlas GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA ［32］
mcrA-rev CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT ［32］
MLf GGTGGTGTMGGATTCACACARTAY- ［33］
GCWACAGC
MLr TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT ［33］
2014年第6期 71王兴文等 ：未培养技术在瘤胃产甲烷菌群研究中的应用
2 产甲烷菌的定量分析
实时定量 PCR（Real-time quantitative PCR，RT-
PCR）是在 PCR 的体系中加入荧光标记物后，模板扩
增产物的量与荧光信号的强弱成正比，即每个模板
的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关
系。利用已知拷贝数的标准品可做出标准曲线，只
要得到未知样品的 CT 值，就能算出起始拷贝数。
Zhou 等［25］以 16S rDNA 为目的基因用 3 种不同
的 特 异 性 引 物 AbM4-F/AbM4-R，Stad-F/Stad-R 和
uniMet1-F/uniMet1-R 分别定量测定 Methanobrevibacter
sp. strain AbM4，M. stadtmanae 和 Total methanogens
来研究日粮消化效率对牛瘤胃产甲烷菌数量的影响，
发现消化率对总产甲烷菌的数量没有影响，但是高
消化率组的 Methanosphaera stadtmanae 和 Methanob-
revibacter sp. strain AbM4 的数量是低消化组的 1.92
和 2.26 倍。Tymensen 等［50］ 利 用 引 物 NestmetF/
NestmetR，Nest-MbbF/NestMbbR，NestRCCF/NestR-
CCR 和 NestMmF/NestMmR 分别扩增总甲烷菌 Metha-
nobrevibacter spp.，RCC 和 Methanomicrobium spp. 来
研究与原虫共生的产甲烷菌，发现 Methanobrevibacter
spp. 和 RCC 是与原虫连接的主要产甲烷菌。Hook
等［51］以 mcrA 基因为目的基因应用实时定量 PCR
和建库研究能量高低不同的日粮对奶牛瘤胃内的产
甲烷菌的影响发现，日粮能量的高低对瘤胃产甲烷
菌的影响不大。Denman 等［30］用 mcrA 基因作实时
定量 PCR 研究溴氯甲烷对瘤胃产甲烷菌的影响发现，
日粮中添加溴氯甲烷可显著减少瘤胃中产甲烷菌的
数量。David 等［52］利用 mcrA 基因定量总产甲烷菌
发现饲喂干草的绵羊瘤胃内的产甲烷菌要多于饲喂
混合日粮的产甲烷菌。
实时定量 PCR 技术能够准确地定量研究瘤胃中
产甲烷菌，但是要研究每一种产甲烷菌的数量必须
得到相应的引物，但因一些产甲烷菌的引物还没有
得到或在 PCR 过程中效率太低或特异性不好，因此
不能定量研究。
3 产甲烷菌基因组
全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行
个体的基因组测序，从整体上研究微生物的功能和
组成。在新西兰、澳大利亚和韩国正在进行着瘤胃
产甲烷菌的基因组测序（表 3）。
到目前为止，已有 2 种产甲烷菌测序完成并公
布，第一个为 Methanobrevibacter ruminantium M1［53］，
它 是 由 Bryant 在 1965 年 分 离 得 到 的， 全 长 2.93
Mb。通过全基因组测序在 M1 的基因组中发现前噬
菌体的基因组、分解酶基因以及内异肽酶 PeiR 基
因，这些基因与 M1 的代谢息息相关。此外，还在
M1 的基因组中还发现了非核糖体肽合成酶基因，这
是此基因在古菌基因组中第一次发现，从而揭示一
些未知的代谢机理。另一个测序完成的产甲烷菌为
Methanobrevibacter sp. JHI，它是在韩国土牛瘤胃中分
离得到的［54］，通过基因组测序发现 JHI 的基因组与
Methanobrevibacter sp. AbM4（从新西兰羊皱胃分离，
并测序完成，未发表）相似，说明它们在系统发育
学上属于同一种类。但是在 JHI 的基因组中发现了
前噬菌体基因，而 AbM4 没有，说明两者在进化上
出现了分支。全基因组测序在 JHI 的基因组中也发
现了与甲烷生成利用的 H2、CO2 和甲酸盐相关的酶。
通过全基因组测序可以清楚地了解目的产甲烷
菌的代谢过程和系统发育的位置。在此基础之上，
应用免疫方法和代谢阻遏物可以控制代谢过程中酶
的活性来减少甲烷的排放［55］。但是全基因组测序是
一项很大的工程，而且只有分离培养出来的产甲烷
菌才能进行全基因组测序，成功分离培养的产甲烷
菌只占瘤胃产甲烷菌很小的一部分。
表 3 瘤胃产甲烷菌基因组测序计划［56］
产甲烷菌 来源 状态 国家
Methanobrevibacter ruminantium M1 牛 发表 新西兰
Methanobrevibacter sp. YLM1 羊 草图 新西兰
Methanobrevibacter sp. YE286 牛 草图 澳大利亚
Methanobrevibacter sp. SM9 羊 完成 新西兰
Methanobrevibacter sp. D5 羊 草图 新西兰
Methanobrevibacter sp. AbM4 羊 完成 新西兰
Methanobrevibacter sp. JHI 牛 草图 韩国
Methanobacterium sp.. YE299 牛 草图 澳大利亚
Methanobacterium sp. BRM9 牛 完成 新西兰
Methanosphaera sp. ISO3-F5 羊 草图 新西兰
Methanosarcina sp. CM1 牛 完成 新西兰
Rumen Cluster C sp. BRNA1 牛 完成 澳大利亚
Rumen Cluster C sp. ISO4-H5 羊 完成 新西兰
在实际的研究过程中，DGGE 技术、16S rDNA/
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期72
mcrA 基因建库、RFLP 技术以及高通量测序主要用
于研究产甲烷菌群落结构，包括菌落的多样性，丰
富度。实时定量 PCR 主要用于定量产甲烷菌。若
要了解产甲烷菌的功能和性质则需要全基因组测
序。有时，为了更加准确具体地研究产甲烷菌，几
项技术可以同时运用，克服彼此的缺点。如在一些
研究中 DGGE 与 16S rDNA/mcrA 基因建库联合使用，
DGGE 可以发现主要的产甲烷菌，而 16S rDNA/mcrA
基因建库可以提高覆盖率全面地研究菌种的多样性，
两者相互补充，互相验证。16S rDNA/mcrA 基因建
库与定量 PCR 的联合使用常常用于研究影响产甲烷
菌的因素。
4 展望
未培养技术已经应用到了很多瘤胃产甲烷菌的
研究中。随着高通量测序的普及，基于高通量测序
的多样性研究是未来的发展趋势，全基因组测序也
是未来研究产甲烷菌代谢途径和系统发育的重要内
容。利用这些技术可以了解瘤胃中产甲烷菌的群落
结构和生理状态，为合理有效控制甲烷的生成提供
理论依据。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）