全 文 ：·综述与专论· 2013年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2013-08-07
基金项目 ：吉林省科技厅项目（20130206068NY）
作者简介 ：张庆田，男，硕士，助理研究员，研究方向 ：果树遗传育种与分子生物学 ；E-mail ：tcszqt@163.com
通讯作者 ：路文鹏，男，硕士，副研究员，研究方向 ：果树栽培与育种 ；E-mail ：182104074@qq.com
山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是葡萄属中最抗
寒的一个种，枝蔓可耐 -45℃低温，根系可耐 -14-
-16℃低温。主要分布于我国东北黑龙江完达山、小
兴安岭，吉林省长白山脉，辽宁省北部的山区、半
山区［1，2］，朝鲜和俄罗斯的远东地区，内蒙古乌兰
察布盟以东大青山、蛮汉山，河北省燕山山脉及山
东省泰山、蒙山等亦有分布［3-5］。山葡萄酿酒品质
极佳，风味独特，浓郁爽口，营养丰富，深受国内
外消费者的喜爱。山葡萄对白粉病、白腐病、炭疽
病、黑痘病有较强的抵抗力，没有美洲种的 “狐臭
味”。是培育优质、抗寒、抗病新品种的宝贵种质资
源及砧木育种资源［6-11］。随着分子生物学技术的研
究与发展，葡萄成为继拟南芥、水稻、毛杨果之后
第 4 种完成全基因组测序的开花植物、第一种水果
类植物［12］。葡萄基因组测序的完成和分子生物学的
山葡萄分子生物学研究进展
张庆田  范书田  杨义明  李晓艳  宋润刚  路文鹏
（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）
摘 要 ： 山葡萄作为抗寒、抗病育种的珍贵种质资源，在国内外的利用越来越受到科学家的关注。随着分子生物学的发展，
各种相关技术在山葡萄种质鉴定、系谱分析、性状标记、辅助育种、图谱构建及基因克隆等方面相继得到应用。概述分子生物学
在山葡萄研究中的利用和应用前景，以期为山葡萄利用提供一定的理论依据。
关键词 ： 山葡萄 种质资源 育种 分子生物学
Molecular Biology Research of Amur Grape（Vitis amurensis Rupr.）
Zhang Qingtian Fan Shutian Yang Yiming Li Xiaoyan Song Rungang Lu Wenpeng
（Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science，CAAS，Changchun 130112）
Abstract:  Amur grape was a precious germplasm for cold hardiness, disease resistance breeding. The untilization of amur grape attract
growing attention by scientists. Along with the development of molecular biology, a variety of related technologies have been used in amur grape
germplasm identification, pedigree analysis, morphological marker assisted breeding, map construction, gene cloning. An overview of the use
of molecular biology method in the study of amur grape and application prospect, was given to provide certain theoretical basis for amur grape
utilization.
Key words:  Amur grape Germplasm resources Breeding Molecular biology
发展使葡萄的研究进入了分子水平，近年来不少学
者相继开展了山葡萄分子标记、遗传图谱构建、基
因克隆等分子生物学研究，本文是就相关研究作一
综述，并展望今后的发展趋势。
1 分子标记在山葡萄中的应用研究
1.1 种质资源鉴定及遗传多样性分析
山葡萄等果树品种在生产上主要采用扦插等无
性繁殖，不同地区相互引种，存在着同物异名、同
名异物、品种混杂的现象，DNA 指纹图谱为资源的
鉴定提供了有力手段［13］，它是从遗传物质基础上，
也就是从本质上反映生物个体差异的 DNA 电泳图
谱，具有高度个体特异性和稳定可靠性，在鉴定品
种真实性和纯度方面是十分有效的。
王军等［14-17］首先对山葡萄基因组提取方法进
行了研究，以改良 CTAB 法提取的 DNA 质量好可直
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期2
接用于 RAPD 分析，首次利用 RAPD 技术对 7 份山
葡萄种质进行了鉴定。金炳奎等［18］建立了山葡萄
SRAP 技术体系，并利用 2 对引物就可鉴别 6 个山葡
萄品种。樊秀彩等［19］利用 SSR 标记对 239 株山葡
萄和河岸葡萄的杂交后代进行鉴定，并结合田间形
态学分析确定有 161 株后代为真杂种。吴子龙［20］利
用 26 对 SSR 标记能将供试的 124 份山葡萄种质相互
区分，并且初步构建山葡萄核心种质，在遗传相似
性系数 0.39 处将供试山葡萄种质资源分为 6 大类群，
多数种质的聚类和山葡萄长期生长发育的地理分析
研究结果一致。温景辉［21］利用 SSR 技术对 360 份
山葡萄种质资源进行了遗传多样性分析和山葡萄核
心种构建，明确了山葡萄种内亲缘关系和分类地位。
1.2 目标性状连锁基因标记
寻找与目标基因连锁较紧密的分子标记是辅
助选择育种的重要手段。对山葡萄重要性状相关的
连锁基因进行标记、定位，并通过克隆测序转化为
SCAR 标记，直接用于杂种早期选择，抗性鉴定等
将显著提高葡萄育种效率，缩短育种年限，加速山
葡萄育种进程。张剑侠等［22］利用 RAPD 技术找到
与中国野生葡萄抗寒基因相连锁的分子标记 S241-
717 和 S238-854。王军等［23，24］ 利用 RAPD 技术找
到雄性山葡萄相关标记 OPA18-700、山欧杂种后代
果皮白色相关的标记 OPY02-750。唐美玲等［25］利
用 AFLP 技术找到与山葡萄雄花与两性花相关的分
子标记并成功转化成 SCAR 标记，盲测准确率达到
97.6%，可对山葡萄杂交后代在苗期进行性别鉴定，
提高育种效率。
1.3 分子遗传图谱的构建与QTL定位
近年来山葡萄常规杂交育种方面取得了可喜的
进展，但在遗传图谱构建和分子标记辅助育种方面，
明显落后于其他经济作物。刘镇东［26］采用 SSR 和
SRAP 两种分子标记技术分别构建了山葡萄‘双优’
和‘北冰红’的分子遗传图谱，‘双优’分子遗传
图谱形成 20 个连锁群，包含 233 个位点，覆盖总图
距为 1 254 cM，位点之间平均距离为 5.0 cM ；‘北冰
红’分子遗传图谱形成 21 个连锁群，包含 228 个
位点，覆盖总图距为 1 123 cM，位点之间平均距离
为 4.5 cM。成功地对葡萄抗寒性进行了初步的 QTL
定位，在‘双优’遗传图谱中检测到 1 个控制抗寒
性的 QTL 位点，命名为 SCR1，位于连锁群 SY3 上，
单独存在时解释的表型变异为 49.8%。在‘北冰红’
遗传图谱中检测到 1 个控制抗寒性的 QTL 位点，命
名为 BCR1，位于连锁群 BBH14 上，单独存在时解
释的表型变异为 16%。Blasi 等［27］利用 122 对 SSR
引物和 6 个 RGA 标记引物对山葡萄‘Ruprecht’231
株自交后代进行遗传图谱的构建，该图谱形成 19
个连锁群，覆盖总图距为 975 cM，并在第 14 号连
锁群上检测到了控制抗霜霉病的主效 QTL，命名为
RPV8，该 QTL 可解释的表型变异高达 86.3%。
2 基因工程在山葡萄研究中的应用
目前，抗逆分子生物学的基础研究工作是国际
上的研究热点，随着分子生物学技术的不断发展，
大量的逆境诱导表达基因被克隆分离出来，为采用
基因工程手段进行植物抗逆育种及有关生理的研究
奠定了基础。针对山葡萄的高度抗寒性，Dong 等［28］
分离到山葡萄低温诱导上调表达的抗寒转录因子
VaCBF1，并且提高了转基因烟草的抗寒性。Wang
等［29］采用 RT-PCR 技术对山葡萄转录因子 CBF3 基
因进行克隆与序列分析，构建了 CBF3 原核表达载
体 pGEX-4T-CBF3，研究了其在大肠杆菌中融合表达
的情况。张哲敏等［30］克隆到山葡萄‘北冰红’抗
寒转录因子 CBF2，并构建了植物表达载体 pBI121-
CaMV35S-CBF，为深入研究 CBF2 基因在葡萄抗寒
性中的作用提供了基础资料。王宁［31］利用电子克
隆技术从山葡萄 EST 数据库中拼接到两个 ICE1 基
因，分别命名为 VaICE1a 和 VaICE1b，并应用半定
量 PCR 对两个基因进行研究，同时成功构建了两个
基因的植物双元表达载体。李凤等［32］和李波等［33］
成功构建了山葡萄‘双红’成熟果皮和‘双丰’转
色期果皮 cDNA 文库，为克隆山葡萄花色苷生物合
成、果实成熟，以及防御抗病相关的基因奠定了基础。
刘海峰［34］ 从山葡萄成熟期果皮中克隆到了类黄
酮 -3-羟化酶（VAmF3H）、类黄酮 -3，5-羟化酶
（VAmF35H）、黄烷酮醇 4-还原酶（VAmDFR）、无
色花色素双加氧酶（VAmLDOX）、类黄酮 3-O-葡萄
糖基转移酶（VAm3GT）、O-甲基转移酶（VAmOMT）、
谷肤甘肽转移酶（VAmGST4）和类黄酮 5-O-葡萄糖
2013年第12期 3张庆田等 ：山葡萄分子生物学研究进展
基转移酶（VAmOGT）等 8 个基因的 cDNA 全长序
列。序列多重比较发现，各基因与欧亚种葡萄（Vitis
inifera L.）相关基因的相似性均超过 90%，构建了这
8 个基因与其他物种相应基因的分子进化树，分析
了与其他物种相关基因的亲缘关系，并对这些基因
在山葡萄幼叶、成熟叶、茎、果肉和果皮中的表达
进行了研究。江源等［35］从山葡萄中分离到降解病
原真菌细胞壁功能的山葡萄 PR 蛋白 -几丁质酶基因
VCH3，并构建该基因的植物表达载体，为葡萄抗霜
霉病的分子育种奠定了基础。李海燕等［36］从山葡
萄叶片中分离到一个维管组织特异表达的水杨酸强
诱导型 VCH3 启动子，并发现该启动子发挥其最大
活性需要两个反向水杨酸顺式作用元件（TGACG）
的协同作用，该启动子将在基因工程中具有很大的
应用潜力。
近几年，越来越多的药理学试验表明，白藜
芦醇具有抗菌、抗脂质过氧化、预防心脏病、抗
癌、抗血小板凝集、降血脂和抗诱变等作用。俄罗
斯科学院远东分院的学者在山葡萄次生代谢物白藜
芦醇的诱导合成与相关基因表达方面进行了研究。
Kiselev 等［37］成功地将 rolB 基因导入山葡萄悬浮细
胞中，转基因的愈伤组织白藜芦醇产量为 3.15%（干
重），是对照的 100 倍。进一步研究证实其合成能力
与 rolB 基因转录水平密切相关。rolB 基因通过选择
性的增强表达 PAL 和 STS 基因家族的个别基因而提
高白藜芦醇含量［38］。Dubrovina 等［39，40］研究表明，
转 rolB 基因愈伤组织中白藜芦醇的积累过程是 Ca2+
依赖性，Ca2+ 通道阻断剂显著的降低其合成含量 ；
比较转 rolB 基因与 rolC 愈伤组织中相关基因 PAL 和
STS 的表达后推测两者是通过不同的途径提高白藜
芦醇含量。最新研究表明［41，42］甲基化抑制剂 5-azaC
能够提高转 rolB 基因和对照山葡萄愈伤组织中白藜
芦醇的含量，其作用机理是 5-azaC 降低了 VaSTS10
基因启动子和编码区的甲基化程度而提高了该基因
的表达量。
3 高通量测序技术在山葡萄研究中的应用
分子生物学的发展离不开测序技术，第二代测
序技术的兴起和发展使人们对一个物种的转录组和
基因组进行细致全面的分析成为可能。Wu 等［43］利
用 Solexa 技术对左山一感染霜霉病和未感染霜霉病
叶片进行转录组测序，去除杂质数据及单拷贝标签
后从感病的叶片文库中获得 8 226 683 个标签，而
对 照 未 感 病 叶 片 7 272 151 标 签， 从 中 分 别 获 得
233 653 个和 203 514 个独特的标签。对其功能进行
注释，结果感病文库中有 15 249 条序列得到了功能
注释，而对照有 14 549 条序列得到了功能注释。并
对 12 个差异表达基因的表达水平进行了实时 RT-
PCR 验证。Xin 等［44］对非冷处理和冷处理下的山
葡萄茎尖转录组进行 Solexa 测序，去除杂质数据及
单拷贝标签后从非冷处理文库中获得 9 019 990 个
标签，而冷处理中获得 8 940 607 标签，分别聚合成
202 174 和 205 283 个独特的标签，分别有 74.46%
和 78.76% 的标签能够匹配到参考基因组上。差异
表达基因功能类别分类显示上调转录的基因与代
谢，转运，信号转导等相关。小分子 RNA 是一类
长度约为 19-25 个核苷酸的具有调控功能的非编
码 RNA，在生物体内扮演着重要的角色，近几年受
到科学界的广泛关注。较短的序列长度虽然是目前
高通量测序难以打破的瓶颈，但正好可以覆盖小分
子 RNA 的长度。科研工作者通过测序，可以预测
新的 miRNA，研究 miRNA 的保守性，建立 miRNA
表达谱，比较 miRNA 表达丰度以及发现其他非编
码 RNA 等。Wang 等［45］ 利用 Solexa 技术对山葡萄
小 RNA 文库进行了测序，共确定了 27 个 miRNA
家族的 126 个保守 miRNAs，同时发现了 34 个非保
守的已知 miRNAs，72 个新的潜在的山葡萄特定的
miRNA。这些新的潜在的 miRNA 通过 miR-RACE 验
证，18 个新的 miRNA 在 7 个葡萄组织中积累通过
实时定量 RT-PCR 分析证实。对 346 个新的 miRNA
的靶基因进行了预测，包括一些抗逆性基因、花青
素的合成和糖代谢调节基因等。
4 展望
山葡萄具有酸高、单宁多酚高、干浸物多、营
养成分高和糖低、出汁率低的特点，只能酿造半汁
低档甜红葡萄酒，采用抗寒早熟的山葡萄与欧亚种
酿酒葡萄著名品种进行种间杂交和重复杂交，使抗
寒山葡萄与不抗寒的欧亚种酿酒葡萄品种的优良性
状相聚合在一起，选育出穗大、含糖高、总酸和单
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期4
宁低、抗寒、抗病、高产、可酿造干红和冰红葡萄
酒的新品种是育种者的目标。然而传统的杂交育种
方法周期长、花费大、见效慢。利用与目标性状基
因紧密连锁的分子标记，可以对杂种后代进行早期
辅助选择，从而提高育种效率，加快育种进程。但
是山葡萄等果树的许多农艺性状，如产量、品质、
抗病性和抗逆性等都是数量性状，因此构建山葡萄
高密度遗传图谱尤其是利用简化基因组测序技术开
发 性 状 关 联 SNP（Single nucleotide polymorphism ）
标记、对重要性状基因进行 QTL（Quantitative trait
locus）定位及克隆，利用基因工程技术生产山葡萄
重要次生代谢产物将是未来的研究热点。
将 传 统 育 种 与 分 子 标 记、 比 较 基 因 组 学
（Comparative genomics）和功能基因组学（Function
genomics）等学科相结合，继续向深度和广度发展，
必将在山葡萄品种鉴定、品种创新、亲本选配、辅
助选择育种等多个领域发挥越来越重要的作用。
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（责任编辑 狄艳红）