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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
二年生草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）属于菊
科牛蒡属，其肉质根较肥大，具有抗菌、抑制肿瘤的
作用，是一种可食用且营养价值较高的农产品，有
东洋参之称。我国出产的牛蒡多出口到日本、韩国
等地区，经济效益较高。江苏徐州是我国牛蒡主要
产区，其牛蒡种植面积占到全国的 40% 以上［1］。目
前对牛蒡的研究，大多集中在营养、食用和药理等
方面，而与牛蒡产量息息相关的微生态系统，特别
是根际土壤微生物的研究却未见报道［2-6］。作为牛蒡
主要产区的徐州又是我国南方重要的煤炭工业基地，
对徐州地区土壤中铅、铜、镉等重金属的吸附解吸
特性研究显示，镉的迁移能力较强［5］。本研究通过
梯度稀释法分离培养该地区牛蒡根际土壤中的细菌，
利用 16S rDNA 序列分析牛蒡根际细菌的生物多样
性。随后，对牛蒡根际耐镉细菌进行分离，并分析
不同菌株对镉的耐受性，确定牛蒡根际耐镉菌株的
种群特征，旨在为进一步探索根际微生物与牛蒡植
株相互作用，促进该地区牛蒡产业发展提供资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 本试验从徐州丰县（牛蒡主产区）
多个生长点随机取样，采集多株牛蒡及其根际土壤
收稿日期 : 2012-01-14
基金项目 : 徐州市科技计划项目（XZZD0924）, 徐州工程学院校级培育项目（XKY2011110）, 徐州工程学院 2011 年大学生创新创业基金项目
作者简介 : 侯进慧 , 男 , 博士 , 讲师 , 研究方向 : 应用微生物学 ; E-mail: houjinhui0@126.com
牛蒡根际可培养细菌多样性和镉耐性初步分析
侯进慧 樊继强 王富威 蔡侃 孔文刚
（徐州工程学院食品（生物）工程学院，徐州 221008）
摘 要： 从牛蒡根际土壤中分离可培养细菌，进行多样性分析，并对镉耐受性菌株进行筛选及其抗性和种群多样性进行了分
析。限制性内切酶多态性分析显示，分离的菌株可分为 9个操作分类单元（OUT），分别属于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门，分
属于 6个科，9个属，其中隶属于肠杆菌属、芽胞杆菌属和假单胞菌属的是优势物种。分离到的耐镉菌株分别属于 Bacillus subtilis、
Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella sp.、Pectobacterium carotovorum、 Pseudomonas sp.，而 Pectobacterium carotovorum
NP22、Enterobacter ludwigii NP23、Pseudomonas sp. NP39三菌株可在 Cd2+浓度为 400 mg/L固体培养基上生长。
关键词： 牛蒡 根际 镉 可培养细菌 多样性
Priliminary Analysis of Cultivable Bacteria Diversity and Cd2+
Resistance in Burdock Rhizosphere
Hou Jinhui Fan Jiqiang Wang Fuwei Cai Kan Kong Wengang
（College of Food Engineering （Bioengineering），Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008）
Abstract: Cultivable bacterial strains were isolated from burdock rhizosphere, and genetic diversity and Cd2+ resistance was analyzed with
the isolated strains. Restriction enzyme morphology analysis demonstrates that the isolated 36 strains could be grouped into 9 different Operational
Taxonomic Units （OUTs）. The isolated strains belong to 9 genera, 6 families of 3 major phylogenetic groups （Proteobacteria, Firmicutes and
Actinobacteria）. Enterobacter, Bacillus and Pseudomonas are the dominant groups. The isolated Cd2+ resistance strains were identified as
Bacillus subtilis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella sp.、Pectobacterium carotovorum、Pseudomonas sp. and Pectobacte-
rium carotovorum NP22、Enterobacter ludwigii NP23、Pseudomonas sp. NP39 have the highest MIC, which is 400 mg/L Cd2+ on sold plate.
Key words: Arctium lappa Rhizosphere Cd2+ Cultivable bacteria Diversity
2012年第8期 159侯进慧等 ：牛蒡根际可培养细菌多样性和镉耐性初步分析
一同带到实验室，当天完成根际土壤中的菌株分离
工作。采样工作在 2009 年-2010 年里进行了 8 次。
1.1.2 培养基 1 L 液体培养基 ：蛋白胨 10 g，酵母
粉 5 g，NaCl 10 g。1 L 固体培养基另加琼脂粉 12 g。
高温灭菌。向培养基中加入灭菌后的 CdSO4 溶液，配
制 50、100 、200 和 400 mg/L 等不同 Cd2+ 浓度培养基。
1.1.3 试剂 蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂粉等
分析纯生化试剂和 PCR 反应试剂、限制性内切酶、
DNA Marker 等分子生物学试剂购自上海生工生物工
程技术服务有限公司和天根生化科技（北京）有限
公司等生物公司。
1.2 方法
1.2.1 根际菌株分离、计数和镉耐性分析 采用抖
根法将根际土壤与非根际土壤分离，使用梯度稀释
平板法分离根际土壤中的细菌。28℃倒置恒温培养
2-3 d 统计菌落数量。使用划线法进行纯化，获得单
菌落。将单菌落分离培养后，保藏菌种以待分析。
将分离的菌株转接到含 Cd2+ 固体培养基中，改
变培养基里 Cd2+ 的浓度，设置 50、100、200 和 400
mg/L 等浓度梯度，筛选镉耐性菌株。培养条件 ：
30℃，每一种浓度梯度培养 2-3 d，分析菌株的最小
抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。
1.2.2 基因组 DNA 提取 提取菌株基因组 DNA［7］，
作为 PCR 反应模板。
1.2.3 序列分析 用于扩增 16S rDNA 序列的引物
为 ：F ：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，R ：
5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3［8］。引物由上海生
工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.4 PCR 扩增 16S rDNA 序列 PCR 反应体系（50
μL）是 ：10×PCR 反应缓冲液 5 μL，dNTP 4 μL，上
游引物 F 和下游引物 R 各 1 μL，模板 DNA 1 μL，Taq
DNA 聚合酶 0.5 μL，加无菌超纯水补足体积。反应
程序 ：95℃预变性 5 min ；95℃变性 30 s，54℃退火
60 s，72℃延伸 90 s，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。
1.2.5 16S rDNA 序列的限制性酶切分析 使用识
别位点是 5-GTAC-3的限制性内切酶 Rsa I 对 16S
rDNA 的 PCR 产物进行 ARDRA（amplified ribosomal
DNA restriction analysis）分析。酶切体系（10 μL）
是 ：1 μL PCR 产物，1 μL 10×酶切缓冲液，0.5 μL
限制性内切酶 Rsa I，使用无菌超纯水补足体积。酶
切反应在37℃进行2 h，之后用琼脂糖凝胶电泳检测。
酶切图谱相同的归为一个操作分类单元（Operational
Taxonomic Unit，OUT）。
1.2.6 16S rDNA 序列的测序分析 根据限制性酶切
分析结果，选取代表性菌株的 16S rDNA 片段送上海
生工生物工程技术服务有限公司测序。用 BLAST 程
序在 GenBank 基因库中将获得的 16S rDNA 序列进行
序列比对，分析各菌株的分类地位。使用 DNAMAN
程序构建菌株的系统发育树。
2 结果
2.1 菌株的筛选与计数
利用培养基对牛蒡根际土壤样品进行了分离，
筛选得到 32 株菌落表型特征各异的菌株。使用梯度
稀释平板计数法对分离菌株进行的统计结果显示，
牛蒡根际可培养细菌数目为 7.5×105 CFU/g 干土样。
2.2 ARDRA分析
将 16S rDNA 的 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶
电泳分析，获得长度约 1.5 kb 特异条带。采用限制
性内切酶 Rsa I 酶切进行 16S rDNA 序列多态性分析，
结果（表 1）显示，所分离的植株可分为 9 个 OUT。
对每个 OUT 的一个代表菌株进行测序，分析序列特
征后发现，这些物种分别属于 3 个门，6 个科，9 个属。
分别是变形菌门（Proteobacteria），包括 ：肠杆菌属
（Enterobacter），假单胞菌属（Pseudomonas），泛菌属
（Pantoea），克雷伯氏菌属（Klebsiella），果胶杆菌属
（Pectobacterium），不动杆菌属（Acinetobacter）；厚壁
菌门（Firmicutes）仅有芽孢杆菌属（Bacillus）一个
属的菌株 ；放线菌门（Actinobacteria），包括 ：节杆
菌属（Arthrobacte），微杆菌属（Microbacteriu）。
2.3 根际菌株多样性
在使用限制性内切酶切割多态性分析的基础
上，将 9 个 OUT 的代表菌株的 16S rDNA 部分序列
进行分析，并从 GenBank 数据库中找寻相关的序列，
进行相似性比对。选取亲缘关系较近的菌株，使用
MEGA4.0 软件对 16S rDNA 序列进行 Neighbor-joining
法构建系统发育树（图 1）。分离获得的牛蒡根际菌
株属于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门等 3 个门，
分别属于 6 个科，9 个属。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期160
2.4 耐镉菌株分析
改变培养基中 Cd2+ 浓度，分离到牛蒡根际镉耐
受浓度分别为 50、100、200 和 400 mg/L 的菌株，最
高获得镉耐受浓度为 400 mg/L 的菌株（图 2）。菌株
镉耐受性分析显示，低浓度时菌落较大，随着浓度
升高，菌落直径变小，生长变缓慢 Bacillus subtilis、
Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella
sp.、Pectobacterium carotovorum、Pseudomonas sp.，
利用相关耐性菌株的 16S rDNA 序列构建了系统发
育树（图 3）。其中，Enterobacter ludwigii NP23、Pec-
tobacterium carotovorum NP22 和 Pseudomonas sp. NP39
在 Cd2+ 浓度为 400 mg/L 的固体培养基中可生长，耐
OUT 操作分类单元（登录号） GenBank 数据库中最接近物种（登录号） 相似性（%） 分类
NP20（GU217537） Enterobacter aerogenes strain TJ-D （FJ796202） 100 Enterobacter（Proteobacteria）
NPR（FJ908095） P. putida isolate Tg （EU275363） 99 Pseudomonas（Proteobacteria）
NP43（GU217540） P. sp. RL32.2（GU056355） 99 Pantoea （Proteobacteria）
NP28（GU217539） K. sp. D81 （DQ923489） 99 Klebsiella（Proteobacteria）
NP25（GU217538） P. carotovorum subsp. carotovorum strain Ecc5-1（FJ527461） 99 Pectobacterium （Proteobacteria）
NP47（GU217542） A. calcoaceticus strain LUH 5820 （FJ867364） 99 Acinetobacter（Proteobacteria）
NP10（FJ908093） Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168（AL009126） 100 Bacillus（Firmicutes）
NP45（GU217541） A. sp. YM-M-25（GU220063） 99 Arthrobacter（Actinobacteria）
Y19（FJ654469） M. paraoxydans strain N2S6（EU221351） 99 Microbacterium（Actinobacteria）
表 1 牛蒡根际可培养细菌类群
图 1 牛蒡根际菌株（9个 OUTs）及其在 GenBank数据库中相关种属细菌的 16S rDNA为基础的系统发育树
Bootstrap 值（%）（1 000 次抽样）标注于分支处
图 2 Cd2+浓度为 400 mg/L的培养基上菌落生长状况
1. Enterobacter ludwigii NP23；2. Pectobacterium carotovorum NP22；
3. Pseudomonas sp. NP39
镉性最高（图 2）。
2012年第8期 161侯进慧等 ：牛蒡根际可培养细菌多样性和镉耐性初步分析
3 讨论
在德国学者 Lorenz Hiltner 提出根际概念的 100
多年中，根际研究不断发展，而分子生物学技术的
应用又极大地推动了根际微生物的研究，比如变性
梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）、
末端限制性片段长度多态性（T-RFLP），以及本研
究所采用的扩增 rDNA 限制酶分析（ARDRA）在根
系微生物研究中都有采用［9-13］。ARDRA 技术一般
是对某一特定基因进行 RFLP 分析，其优点是产生
的条带较少，使电泳结果较易分析，但也存在着分
辨率低的缺陷。在 ARDRA 试验时，限制性内切酶
的选用也比较重要，常选用到的有 Csp6 I、HaeⅢ、
Hinf I 和本研究所用的 Rsa I 等。相关文献表明，选
择适合的限制性核酸内切酶处理 16S rDNA，有助于
获得可靠的 ARDRA 分析结果，限制性核酸内切酶
Rsa I 就是很好的选择［9-12］。因此，本研究也是选择
这种限制性核酸内切酶。
植物根际分泌物和根的脱落物都位于根际，其
中富含有机物质，这就导致植物根际微生物的种
类和数量与非根际土壤的都有所不同。细菌是数
量最多的一类根际微生物，每立方厘米根际土样
细菌数目可达 106-108 CFU。对缙云山和天目山毛
竹（Phyllostachys pubescens）林根际细菌的分析［14］
显示细菌数量是 4.0×105 CFU/g 和 7.1×105 CFU/g，
处于较低的水平。有研究分析冷箭竹（Bashania
fangiana）根际［15］ 可培养细菌为 4.3×106 CFU/g
干 土 样， 本 溪 山 樱（Cerasus sachalinensis）［16］ 根
际可培养细菌数量在 2×108 CFU/g 左右，而番茄
（Lycopersicon esculentum）根际可培养细菌数量则达
到 109 CFU/g［17］。可见，牛蒡根际可培养细菌数目
处在中等偏低的水平。本研究显示，牛蒡根际可培
养细菌数目偏低，为 7.5×105 CFU/g 干土样，这可
能与牛蒡根部生理结构和生理活动相关，比如牛蒡
表皮分泌抗菌物质。另外，还有一些根际微生物的
拮抗作用会影响细菌数目。本研究筛选到的菌株
NPR 就是一株假单胞菌属的拮抗性菌株，这株菌的
拮抗作用与牛蒡根系菌株多样性的关系，以及该菌
对牛蒡生长的影响还有待进一步分析。植物根际主
要存在着革兰氏阴性杆菌，牛蒡根际细菌类群也是
这样。变形菌门在牛蒡根际可培养细菌中占优势，
而厚壁菌门和放线菌门数目较少。具有防病促生潜
能的根际细菌，如假单胞菌属、芽胞杆菌属、肠杆
菌属等，也是牛蒡根际可培养细菌的主要种群。镉
耐性菌株主要是阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、芽孢杆菌、
假单胞菌等类群［18-22］。本研究在牛蒡根际也发现了
分属于肠杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、果胶杆菌
和芽孢杆菌的镉耐性菌株，与他人研究结果相吻合。
本研究从牛蒡根际分离到一株耐镉芽孢杆菌，耐性
为 50 mg/L，同时发现一株耐 400 mg/L 镉的果胶杆
菌 NP22，这些菌株均有深入研究的价值。
图 3 牛蒡根际镉耐性菌株 16S rDNA系统发育树
Bootstrap 值（%）（1 000 次抽样）标注于分支处
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期162
4 结论
本研究对牛蒡根际可培养细菌多样性和相关
菌株镉耐性进行的分析表明，牛蒡根际有丰富的
细菌类群，可培养细菌数目大约是 7.5×105 CFU/g
干土样，分别是变形菌门的肠杆菌属、假单胞菌
属、泛菌属、克雷伯氏菌属、果胶杆菌属、不动杆
菌属（Acinetobacter），厚壁菌门的芽孢杆菌属和放
线菌门的节杆菌属、微杆菌属。从牛蒡根际分离到
B. subtilis、E. aerogenes、E. ludwigi、Klebsiella sp.、
P. carotovorum、 Pseudomonas sp.等多株镉耐性菌株，
其中 E. ludwigii NP23、P. carotovorum NP22 和 P. sp.
NP39 耐镉性最高，可在 Cd2+ 浓度为 400 mg/L 的固
体培养基中生长。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）