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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3），指一系列能在油 -
水界面水解三酯酰甘油的酶类。其中米黑根毛霉脂
肪酶（Rhizomucor miehei lipase，RML）是一种重要
的、有代表性的脂肪酶，它可以催化酯水解、酯合
成、酸解、醇解、氨解、内酯化、转酯化等多种类
型的反应［1］。由于 RML 具有独特的催化结构，并
且能显示高度的底物 1，3 位置专一性［2］，使其相
收稿日期 ：2012-08-20
基金项目 ：国家“863”计划项目（2011AA100905）
作者简介 ：薛冲冲，男，硕士研究生，研究方向 ：CBM 整合木聚糖酶、脂肪酶 ；E-mail ：x16c06@163.com
通讯作者 ：韩双艳，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物酶学 ：E-mail ：syhan@scut.edu.cn
毕赤酵母高效表达整合有 CBD 的米黑根毛霉脂肪酶
薛冲冲  张俊辉  林影  韩双艳
（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要 ： CBD 是一类存在各种水解酶（木聚糖酶，纤维素酶等）中的能够结合并识别纤维素的结合域，能有效地增加酶在
底物周围的浓度，增强酶水解底物的能力。尝试将来源于哈茨木霉内切葡聚糖酶 II（THEGII）的 CBD 及连接肽基因融合到 S7-xyn
的 N-末端区域中，以期能获得高酶活力的融合米黑根毛霉脂肪酶应用于工业生产，研究通过将融合基因克隆到 pPICZαA 载体中，
构建分泌性表达质粒 pPICZαA-CBD-RML，载体经线性化后在毕赤酵母 GS115 中融合表达。通过与没有融合 CBD 的 RML 比较，两
者具有相似的最适温度和温度稳定性曲线，而融合蛋白 CBD-RML 的分泌量提高了 17%。研究结果表明，来源于 THEGII 的 CBD
可以作为异源蛋白在毕赤酵母中表达的分泌增强子。
关键词 ： 毕赤酵母 米黑根毛霉脂肪酶 CBD 分泌表达
High Expression of Rhizomucor miehei Lipase in Pichia pastoris by
Fusion to CBD
Xue Chongchong Zhang Junhui Lin Ying Han Shuangyan
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract:  Rhizomucor miehei lipase（RML）, one of the important enzymes applied in industries, has a broad prospect of application.
CBD, which is capable of tightly binding cellulose, has been found in diverse hydrolytic enzymes（cellulose, xylanase）. The presence of a CBD
is shown to increase the effective concentration of enzyme on substrates, thereby assisting the enhancement of hydrolytic enzyme activity. Here
the CBD from Trichoderma harzianum endoglucanase II（THEGII）was connected to the N-terminal of RML through an endogenous linker
peptide. Then the fusion genes were cloned into the secreted expression vector pPICZαA to construct recombinant plasmid pPICZαA-CBD-RML.
The plasmid was linearized and transformed into Pichia pastoris GS115 to obtain Pichia pastoris recombinant strain. Compared with that of the
mature RML without CBD-fusion, secretion of CBD-RML by this fusion construct was about 17% enhanced in addition to similar temperature
activity and stability between RML and CBD-RML. Therefore, the CBD from THEGII can be used as a secretion enhancer for secretory
production of heterologous protein in Pichia pastoris.
Key words:  Pichia pastoris RML CBD Secreted expression
对于其他一些工业脂肪酶，如南极假丝酵母脂肪酶
B（CALB）具有更好的底物选择性和特异性。因此
其在油脂、制药、香精香料、化工等领域有着重要
的应用价值［3］。
毕赤酵母表达系统具有可进行高密度发酵、表
达量较高、对蛋白质进行修饰、糖基化程度低等优
点，应用该系统成功地表达了大量的外源蛋白［4，5］。
2013年第2期 119薛冲冲等 ：毕赤酵母高效表达整合有 CBD 的米黑根毛霉脂肪酶
本实验室也将 RML 在毕赤酵母中进行了表达，但是
其表达量比较低，造成生产成本较高，和商业化酶
相比仍有较大的差距。因此有必要提高 RML 在毕赤
酵母中的表达水平，降低其成本和价格，促进其工
业化大规模使用。
许多半纤维素和纤维素降解酶具有模块化的结
构，通常由一个催化域（CD）、一个或多个非催化
的碳水化合物结合结构域（CBM）和连接肽（Linker）
构成，CBM 是组成酶的一个独立区域，可以和一个
或多个 CD 通过连接肽串联在一起［6］。其中有一类
CBM 能够促进纤维素酶同微晶纤维素结合，人们将
之称为纤维素结合域（CBD），并分类到 CBM 家族
的第 1-13 家族。作为非催化域的 CBD 具有识别并
结合纤维素的能力，从而能促进酶与底物的可及度，
增强酶在底物的周围的有效浓度，与异源蛋白融合
表达时能改变异源蛋白的酶活力。因此 CBD 在生物
技术行业中将具有许多潜在的应用［7］。
2004 年 Ahn 等［8］将来源于哈茨木霉内切葡聚
糖酶 II（THEGII）的 CBD 与嗜热脂肪芽孢杆菌的
L1 脂肪酶在酿酒酵母中融合表达，融合蛋白 CBD-
Linker-L1 Lipase 相比较 L1-Lipase 的分泌量会显著提
高 7 倍。故本研究尝试通过该 CBD 与 RML 在毕赤
酵母中进行高效的融合表达，以期获得高酶活力的
RML，为进一步的降低应用于工业生产的 RML 的生
产成本，有目的改善 RML 的相关酶学性质奠定坚实
的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 Pichia pastoris GS115、菌株 E.coli
Top10F 由本实验室保存，重组质粒 pPICZαA-RML
由本实验室构建、pUC57-CBD-L 由金斯瑞生物科技
有限公司合成，质粒 pPICZαA 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 培养基 LB 培养基 ：1% 胰蛋白胨，0.5% 酵
母抽提物，1% 氯化钠，根据需要添加 100 mg/mL
博来霉素，终浓度为 25 μg/mL。培养基 YPD、 MD、
BMGY、 BMMY 配方参考 Invitrogen 公司操作手册。
1.1.3 试剂 酵母氮源 YNB（Yeast Nitrogen Base）、
蛋白胨均购 Difco 公司；酵母抽提物购自 Oxford 公司；
Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker 和
限制性内切酶购自 TaKaRa 公司，其他试剂均为市
售国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 PCR 引物的设计 为了获得相应的目的基因
片段 CBD 和 RML 需设计特异性的引物进行扩增。
其中扩增来源于 THEGII 的目的片段 CBD 使用模板
pUC7-CBD，上游引物 CBDp1 ：CCGGAATTCCAGCA-
GACAGTTTG，含 EcoR I 酶切位点（以下划线示出）
及保护碱基 ；下游引物 CBDp2 ：ATAACCGCGGTGA-
TGAGGTTG，含 Sac II 酶切位点（以下划线示出）
及 保 护 碱 基。 扩 增 RML 基 因 使 用 模 板 pPICZαA-
RML，上游引物 RMLp1 ：ATAACCGCGGGTTCCAA-
TTAAGAGACAAT，含Sac II 酶切位点（以下划线示出）
及保护碱基 ；下游引物 RMLp2 ：ATTATTGCGGCCG-
CTAGTACACAAACCAGT，含 Not I 酶切位点（以下
划线示出）及保护碱基。引物合成由上海捷瑞生物
科技有限公司完成。
1.2.2 CBD-RML 的 克 隆 以 pUC7-CBD 为 模 板，
CBDp1 和 CBDp2 为 引 物 进 行 PCR 扩 增 目 的 片 段
CBD， 反 应 体 系 为 模 板 1 μL ；primerstar HS 为 25
μL ；20 mmol/L 的上下游引物各 1 μL，加无菌水至
总体积为 50 μL。反应条件为 ：98℃预变性 5 min ；
98℃变性 15 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共
25 个循环 ；第 25 个循环，72℃延伸 5 min。同理，
以 pPICZαA-RML 为模板，RMLp1 和 RMLp2 为引物
进行 PCR 扩增目的片段 RML，反应体系和反应条件
同上。所获得的 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳
检测并切胶回收纯化。
1.2.3 重组质粒 pPICZαA-CBD-RML（简称“pPICZ-
αA-CRML”） 的 构 建 当 构 建 重 组 质 粒 pPICZαA-
CRML 时，将 PCR 产物 CBD 用 EcoR I 和 Sac II 双酶
切，RML 用 Sac II 和 Not I 双 酶 切， 同 时 将 质 粒
pPICZαA 用 EcoR I 和 Not I 双酶切，在 T4 连接酶的
作用下构建重组质粒 pPICZαA-CRML，然后用 CaCl2
转化法转入 Top10F，在 Zeocin+ 的 LB（25 μg/mL）
平板上涂板，过夜培养。提取阳性转化子质粒，对
pPICZαA-CRML 进行 EcoR I 和 Not I 双酶切鉴定 ；鉴
定正确后，委托上海美吉生物医药科技有限公司进
行测序。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期120
1.2.4 重组毕赤酵母的构建 通过 LiCl 法将 Sac I 线
性化的重组质粒 pPICZαA-CRML 转化宿主菌 GS115
转化物涂布于 YPDS（Zeocin+）平板上，30℃培养
2-3 d。
1.2.5 毕赤酵母重组菌株产重组米黑根毛霉脂肪酶
酶的水解平板检测 挑取在 YPDS（Zeocin+）平板上
正常生长的阳性转化子，转接到 MD 平板上，30℃
培养 2-3 d。然后挑取水解圈较大的转化子进行摇瓶
发酵试验。
1.2.6 重组转化子的鉴定及摇瓶培养 经过水解
平板筛选后，从 MD 平板上挑取水解圈较大的阳性
转化子进行摇瓶培养，并命名为 GS115/pPICZαA-
CRML ；同时以重组菌 GS115/pPICZαA-RML 为阳性
对照进行摇瓶发酵试验。
将不同菌株分别接种于 25 mL BMGY 培养基中，
30℃，250 r/min 振荡培养约 40 h 至 OD600 到 25-30。
离心收集菌体，再将其悬浮于 25 mL BMMY 培养基
中，继续振荡培养，每隔 24 h 向 BMMY 培养基中补
加甲醇至终浓度为 2.0% 进行诱导。
1.2.7 重组脂肪酶的酶活测定 以对硝基苯基辛酸
酯最为重组脂肪酶 CR 和 RML 的最适底物，利用
pNPC 法测定发酵上清液中脂肪酶的活力［9］。酶活
单位（U）定义为 ：每分钟水解底物生成 1 μmol 对
硝基苯酚所需的酶量。
1.2.8 表 达 产 物 的 SDS-PAGE 分 析 重 组 转 化 子
GS115/pPICZαA-CRML 和 对 照 菌 GS115/pPICZαA-
RML 诱导培养 120 h，取发酵上清液 50 μL，以 20
μL 上样，进行 12% SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝
R250 染色，检测目的蛋白的表达。
2 结果
2.1 重组质粒pPICZαA-CRML的构建
构建重组质粒 pPICZαA-CRML，经双酶切鉴定
（图 1）显示目的片段大小约为 1 200 bp（含 210 bp
前导肽序列），重组质粒测序结果显示插入片段大小
为 1 233 bp，与拟克隆的 CRML 序列一致，且读码
框正确。
2.2 重组转化子的三丁酸甘油酯MM平板鉴定筛选
将构建好的重组质粒进行毕赤酵母转化试验，
所获得的重组转化子接种于 MM 平板（混合三丁
酸甘油脂），倒置培养皿，在盖上涂 100 μL 甲醇，
30℃诱导培养 72 h 后，重组转化子相对于阳性对照
菌 GS115/pPICZαA-RML，在菌落周围均能产生较大
的透明圈，说明重组转化子能够有效地分泌脂肪酶，
图 2 所示为 MM 平板上其中一个重组转化子（GS115/
pPICZαA-CRML） 和 阳 性 对 照 菌（GS115/pPICZαA-
RML）的水解圈比较，GS115/pPICZαA-CRML 周围
的水解圈要明显大于 GS115/pPICZαA-RML。
5000
bp
3500
1500
1000
500
M 1
M ：DNA Marker 500 bp ；1 ：重组质粒 pPICZαA-CRML 经 EcoR I 和 Not I 双
酶切的产物
图 1 重组质粒 pPICZαA-CRML 的双酶切鉴定
GS115/ pPICZαA -CRML
GS115/pPICZαA-RML
图 2 三丁酸甘油酯 MM 板检测酵母重组菌
2.3 CBD-RML 和RML在毕赤酵母中的表达
将筛选获得的重组酵母和对照菌进行摇瓶培养，
添加终浓度 2% 的甲醇诱导，每隔 24 h 取样，检测
重组酶酶活力和 OD600 值，结果（图 3，图 4）表明，
在甲醇诱导的 120 h 期间，GS115/pPICZαA-RML 的
生长状况明显好于重组菌 GS115/pPICZαA-CRML，
可能是由于外源基因的加入，宿主菌表达新基因需
要消耗更多的资源，导致宿主菌代谢负担增加，从
而影响重组菌的生长。当整合哈茨木霉的 CBD 到
RML 的 N-末端后，重组酶 CRML 的酶活力整体比
2013年第2期 121薛冲冲等 ：毕赤酵母高效表达整合有 CBD 的米黑根毛霉脂肪酶
RML 要高，甲醇诱导发酵产酶 96 h 时，CRML 相对
RML 酶活提高了近 16.7%，分析可能是 CBD 的加入
提高了融合蛋白的分泌量。
当甲醇诱导 120 h 时，分别取以上发酵上清液
20 μL 上样进行 10% SDS-PAGE 考马斯亮蓝 R250 染
色，结果（图 5）显示，重组菌诱导表达后，整合有
CBD 的重组脂肪酶 CRML 分子质量要略高于 RML
（30 kD），而且重组酶 CRML 蛋白浓度要明显高于
RML，与发酵数据基本一致，即因为 CBD 整合到
RML 中，导致重组酶 CRML 的分泌量提高，进而在
SDS-PAGE 分析结果显示出重组酶 CRML 的蛋白条
带浓度高于 RML 的现象。
60
50
40
30
20
10
0
24 48 72 96 120
䈡ሬᰦ䰤h
O
D
60
0
GS115/pPICZαA-CRML
GS115/pPICZαA-RML
0.45
0.35
0.25
0.15
0.10
0.20
0.30
0.40
0.05
24 48 72 96 120
0
䈡ሬᰦ䰤h
䞦⍫
U/m
l
GS115/pPICZαA-CRML
GS115/pPICZαA-RML
图 3 两种重组毕赤酵母的发酵生长曲线 图 4 两种重组毕赤酵母产酶曲线
2.4 CRML 和RML的酶学性质
在 pH 值 8.0 的磷酸缓冲液中配制底物，分别在
不同反应温度下进行酶促反应，在 30-60℃内温度
曲线见图 6。由图 6 可知，RML 在 45℃时酶活力最
高，而重组脂肪酶 CRML 的最适温度为 50℃，并且
在 45-60℃范围内均有超过 60% 的酶活力。
酶的热稳定测定时，将酶置于 65℃时保温，每
隔 2 min 取样测酶活力，并绘制酶的热稳定性曲线，
97.2
kD
66.4
44.3
29.0
20.1
M 1 2
M：蛋白 Marker；1：GS115/ pPICZαA-RML 诱导 120 h 发酵液上清；
2 ：GS115/ pPICZαA-CRML 诱导 120 h 发酵液上清
图 5 两种重组酵母发酵上清液的 SDS-PAGE
由图 7 可知，两者酶的热稳定性曲线基本类似，随
着时间的延长两者的热稳定性逐渐下降，反应到第
8 min 时，CRML 的相对酶活力降到仅剩 7.5%，而
RML 的相对酶活力也只剩 11%。
3 讨论
当前，微生物脂肪酶至投入工业生产 20 多年
来，其应用领域相当广泛，包括食品工艺、造纸业、
精细化学品合成业、化妆品制造业和制药等行业中，
一直是酶学研究领域的热点，米黑根毛霉脂肪酶
RML 正是这样一种在各行业中具有潜在应用价值的
酶，但是关于对 RML 酶活改进的文章报道还比较少，
Zhang 等［10］尝试将 RML 在酿酒酵母表面进行展示
表达发现，其酶活力比较低，只有 280 U/L。但在实
际的生产过程中，RML 的应用出现了急需解决的两
个主要问题 ：第一，较高的成本投入 ；第二，酶的
稳定性和酶活力较差。
CBD 在蛋白质工程的应用是个新的领域，许多
研究表明当将 CBD 与异源蛋白融合表达时，大部
分可以提高融合蛋白的表达量。Johanna 等［11］研究
了 CALB 和融合 CBD（CBM 第一家族）的 CALB 在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期122
以甲醇为诱导的毕赤酵母中功能性的表达，该 CBD
来自于厌氧性瘤胃真菌 Neocallimastix patriciarum 的
纤维素酶 A。研究结果显示，分泌到培养基的重组
蛋白（CBD-CALB）水平近 25 mg/L，CBD-CALB 和
CALB 相比有相似的比活力，且 CBD-CALB 吸附纤
维素的能力远大于 CALB。Sarath 等［12］将来源于里
氏木霉纤维二糖水解酶（CBHII）的 CBD（CBM 第
二家族）融合到 Saccharomycopsis Wbuligera 的 β-葡
糖糖苷酶（BGL1）中并以酿酒酵母作为表达宿主菌，
结果表明，整合 CBD 的融合蛋白对纤维素的水解能
力提高了 2-4 倍，其中融合一个 CBD 的蛋白比融合
两个 CBD 蛋白水解纤维素能力更强。另外 Ahn 等［8］
将 THEGII 的 CBD（CBM 第一家族）与嗜热脂肪芽
孢杆菌的 L1 脂肪酶在酿酒酵母中融合表达后，相
比 较 L1-Lipase， 融 合 蛋 白 CBD-Linker-L1 Lipase 的
分泌量会显著提高 7 倍。本研究通过将 THEGII 的
CBD 融合到 RML 上后，融合蛋白 CRML 的表达量
也有一定程度的提高，达到 17%。该 CBD 能促进异
源蛋白表达量的提高可能原因是 CBD 含有异源蛋白
不具有的二硫键结构，而这种二硫键结构有助于融
合蛋白稳定性的提高，从而阻止因与一些硫醇氧化
还原酶的接触导致融合蛋白聚沉［8］。本研究中的融
合蛋白 CRML 酶活力相比较单一的 RML 却只提高了
17%，这可能与不同的融合酶在不同的宿主菌中表
达有关系。
另外，融合蛋白 CRML 相比较 RML，其最适温
度提高了 5℃，并且两者具有相似的热稳定性曲线。
为了满足苛刻的工业生产条件，研究了 65℃ 时两种
酶的热稳定性曲线，结果表明 CRML 和 RML 在保温
2 min 中后，两者相对酶活均下降超过 50%，说明
如何能提高 RML 的热稳定性也是当前的研究重点。
在相关报道中，Ravalason 等［13］将来源于黑曲霉纤
维二糖水解酶的第一家族 CBM 融合到 Pycnoporus
cinnabarinus 的漆酶上后，融合蛋白的最适温度相对
于原始漆酶有一定程度的提高，但热稳定性却有所
下 降 ；Shin 等［14］ 通 过 将 Clostridium stercorarium 木
聚糖酶中的木聚糖结合域从催化域的 N-末端转移到
C-末端，改造后重组酶的最适温度下降了 35℃。当
增加 CBM 融合到不同的水解酶上后，能够引起这些
水解酶的最适温度或热稳定性的各种改变，因此，
很难去预测 CBM 的加入会对某种酶的最适温度或热
稳定性的绝对变化。
基于米黑根毛霉脂肪酶 RML 的低酶活力，生产
高成本等缺陷，并在食品、化工等领域的广泛应用
前景，本研究尝试将来源于哈茨木霉的 CBD 整合到
RML 的 N 端并在毕赤酵母中高效表达，相比单一的
RML，重组酶的酶活力最高提高了 17%。获得的高
活力重组脂肪酶不仅为其在工业生产中应用降低成
本奠定基础，同时为人们探究 CBD 如何影响 RML
的相关酶学性质提供一定的理论依据。
4 结论
本研究成功构建了分泌型的重组质粒 pPICZαA-
CRML，实现了整合有 CBD 的米黑根毛霉脂肪酶
CRML 在 毕 赤 酵 母 GS115 中 的 高 效 表 达， 同 时 对
RML 和 CRML 的相关酶学性质进行了比较。结果显
示，RML 和 CRML 具有相似的最适温度和温度稳定
120
100
80
60
40
20
30 35 45 55 605040
0
⑙ᓖć
⴨ሩ
䞦⍫
%
RML
CRML
图 6 温度对重组脂肪酶 CRML 和 RML 的酶活影响 图 7 重组脂肪酶 CRML 和 RML 的热稳定性测定（65oC）
120
100
80
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40
20
0
0 2 4 6 8؍⑙ᰦ䰤min
⴨ሩ
䞦⍫
%
RML
CRML
2013年第2期 123薛冲冲等 ：毕赤酵母高效表达整合有 CBD 的米黑根毛霉脂肪酶
性曲线，两者的最适作用温度分别为 45℃和 50℃ ；
相比较 RML，融合蛋白 CRML 在毕赤酵母中的表达
分泌量提高了近 17%，说明来源于 THEGII 的 CBD
可以作为异源蛋白在毕赤酵母中表达的分泌增强子。
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（责任编辑 李楠）