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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):131-139
马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）作
为一种植物内寄生线虫，生命周期的大部分时间都
寄生在寄主植物体内。在长期的进化过程中，寄主
植物对病原线虫形成了各种各样的防御体系［1-3］，
其中氧化防御体系是重要的防御体系之一。为应对
线虫侵染，寄主在线虫侵染初期会产生大量的活性
氧（reactive oxygen species，ROS）从而诱导植物产
生相应的防御反应，阻止寄生关系的建立。而线虫
为成功完成其生活史，在暴露于寄主植物各种防御
反应下，相应的进化出了多种保护机制使其免受损
伤。其中，在抗氧化防御机制方面，植物寄生线虫
形成了多种抗氧化酶体系，已知的有过氧化氢酶
收稿日期 ：2015-01-15
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31071667）
作者简介 ：刘洋，男，硕士研究生，研究方向 ：植物线虫及其防治 ；E-mail ：396787917@qq.com
通讯作者 ：丁中，博士，教授，研究方向 ：植物线虫及其防治 ；E-mail ：dingzx88@aliyun.com
马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因（Dd-Gpx）
的克隆与原核表达
刘洋  何旭峰  刘建喜  丁中
（湖南农业大学植物保护学院 植物病虫害生物学与防控湖南重点实验室，长沙 410128）
摘 要 ： 旨在研究植物寄生线虫谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）的结构和功能，通过 RACE 技术克隆了
马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）Gpx 基因，并成功克隆到 pET-41b 载体上进行融合表达。结果表明，该基因 cNDA 全长
950 bp，含有 1 个 681 bp 的开放阅读框，共编码 226 个氨基酸。生物信息学分析显示，该蛋白 N 端有明显信号肽，属于分泌蛋白。
将其克隆到 pET-41b 载体在 BL21（DE3）中进行原核表达，结果显示，在 60 kD 处有一条明显的带。经质谱鉴定，此条带有 7 个
肽段与马铃薯腐烂茎线虫 GPX 匹配。表明重组 Dd-GPX 蛋白表达成功。
关键词 ： 马铃薯腐烂茎线虫 ；谷胱甘肽过氧化物酶 ；基因克隆 ；原核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.022
Cloning and Prokaryotic Expression of Dd-Gpx from
Ditylenchus destructor
Liu Yang He Xufeng Liu Jianxi Ding Zhong
（Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests，College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，
Changsha 410128）
Abstract:  To further understand the structure and function of glutathione peroxidase, a glutathione peroxidase gene was cloned from
plant-parasitic nematode（Ditylenchus destructor）using RACE method, and the gene（DdGpx）was transferred into vector of pET-41b to have
the fusion expression. The full-length cDNA of DdGpx was 950 bp containing an open reading frame of 681 bp and encoding 226 amino acids.
Bioinformatics analysis indicated that the N terminal of the protein had obvious signal peptide, belonging to the secretory protein. The prokaryotic
expression vector pET-41b-DdGpx was constructed and then transformed into BL21（DE3）, there was a apparent band in 60 kD. Mass
spectrum analysis indicated that there were 7 peptides matched with D. destructor GPX protein, implying that the recombinant protein of Dd-GPX
was successfully expressed
Key words:  Ditylenchus destructor ；glutathione peroxidase ；gene cloning ；prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10132
（catalase，CAT）［4］、 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide
dismutase，SOD）［4］、过氧化物还原酶（peroxiredoxins，
PRXs）［5］ 和 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶（glutathione
peroxidase，GPX）［6］。在这些抗氧化酶中，GPX 是
最为重要的抗氧化酶系之一。作为防御 ROS 破坏的
第一道防线，谷胱甘肽过氧化物酶广泛分布于耗氧
生物各组织中。根据活性位点是否含硒，又分为硒
谷胱甘肽过氧化物酶（Se-GPX）和非硒谷胱甘肽过
氧化物酶（non-Se-GPX）两类。在哺乳动物中，当
Se-GPX 缺乏足够的硒浓度时，non-Se-GPX 被当作
Se-GPX 的后备系统行使抗氧化功能［7］。但在线虫体
内，GPX 常以 non-Se-GPX 形式存在［8，9］。已有研究
证明，non-Se-GPX 不能代谢 H2O2 或者以很低的效率
代谢，但对于脂氢过氧化物等大分子活性氧却有更
高的亲和力［10，11］，而许多重要的植物防御通路均由
脂质氢过氧化物激活［12］。因此，可通过代谢这些脂
氢过氧化物来阻止植物寄主启动一系列防御反应。
目前，国内外对于谷胱甘肽过氧化物酶的研究
主要集中在动物、植物及真核微生物方面［13，14］，对
植物线虫的谷胱甘肽过氧化物酶的克隆和表达少有
报道。为此，本研究利用 RACE 技术获得一条马铃
薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因 Dd-Gpx，并
克隆到 pET-41b 载体上进行融合表达，以期为进一
步研究植物寄生线虫 GPX 的结构和功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 马铃薯腐烂茎线虫为本实验室用
半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）在 25℃条件下进
行纯培养［15，16］。
1.1.2 试 剂 Dynabeads® mRNA DIRECTTM Kit 购 自
Life Technologies 公 司 ；3-Full RACE Core Set with
PrimeScriptTM RTase，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）
Ver.3.0，Ex Taq DNA 聚合酶，Prime STAR GXL 高保
真酶，DNA Marker 购自 TaKaRa 公司 ；pGEM-T easy
载体购自美国 Promega 公司 ；大肠杆菌（Escherichia
coli）DH5α 和 BL21（DE3）感受态细胞，卡那霉素
（Kan）购自北京全式金生物技术有限公司 ；琼脂糖
胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；
DNeasy Blood & Tissue Kit 购自德国 QIAGEN 公司 ；
限制性内切酶 BamH I 和 Xho I 购自 NEB 公司 ；原
核表达载体 pET-41b 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 马铃薯腐烂茎线虫 Gpx 核心片段扩增 收集
新鲜分离的马铃薯腐烂茎线虫，清水及灭菌去离子
水 离 心 清 洗 3 次 后 采 用 Dynabeads mRNA DIRECT
Kit 进 行 mRNA 提 取， 使 用 TaKaRa RNA PCR Kit
（AMV）Ver.3.0 试 剂 盒 合 成 第 一 链 cDNA。 根 据
NCBI 上公布的线虫谷胱甘肽过氧化物酶氨基酸序列
进行比对，找出保守序列并合成简并引物 GPX1R（表
1）。以合成的第一链 cDNA 为模板扩增 Gpx 核心片
段，反应体系为 ：10×Ex PCR buffer 5μL，dNTP Mix
（10 mmol/L）4 μL，GPX1R（10 μmol/L）3 μL，SL1
（10 μmol/L）1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5
μL，cDNA 1 μL，用 ddH2O 补足至 50 μL。PCR 反应
条件为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1
min，35 个循环；72℃延伸 10 min。PCR 产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳鉴定与胶回收后连接到 pGEM-T easy
克隆载体并热激转化到 DH5α 感受态细胞中。菌液
PCR 检测阳性克隆后送上海生工生物工程技术服务
有限公司测序。
1.2.2 Gpx cDNA 全长扩增 根据上一步获得的 Gpx
核 心 片 段 序 列， 采 用 Primer Premier 5.0 软 件 设 计
3 RACE 引 物 GPXJ1 和 GPXJ2（ 表 1）， 以 RACE
cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应体系和扩增
条件按 3-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase
说明书进行。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳后
按照说明书进行回收、连接和转化，菌液 PCR 检测
阳性克隆后送上海生工生物工程技术服务有限公司
测序。
1.2.3 Gpx 基因组 DNA 全长克隆 根据上一步获
得 的 马 铃 薯 腐 烂 茎 线 虫 Gpx cDNA 全 长 序 列， 采
用 Primer Premier5.0 软 件 设 计 基 因 组 全 长 引 物 对
GPXJYZ-1F/GPXJYZ-1R 和 GPXJYZ-2F/GPXJYZ-2R
（表 1），按 DNeasy Blood & Tissue Kit 试剂盒说明提
取基因组 DNA 并以之为模板进行 PCR 扩增。PCR
反应体系和扩增条件参照 1.2.1 进行。PCR 产物经
1.5% 琼脂糖凝胶电泳后按照说明书进行回收、连接
和转化，菌液 PCR 检测阳性克隆后送上海生工生物
2015,31(10) 133刘洋等：马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因（Dd-Gpx）的克隆与原核表达
工程技术服务有限公司测序。
1.2.4 序列分析 使用 DNAMAN5.2 软件进行序列
拼接和比对 ；使用 NCBI 工具 BLAST（http ：//blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和 ORF finder（http：//www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/） 比 对 序 列 和 查 找 开 放 阅 读
框 及 蛋 白 质 翻 译 ；用 MEGA5.0 软 件 的 最 大 似 然
法（maximum likelihood，ML） 构 建 分 子 系 统 进
化 树 ； 使 用 SignalP4.0Server（http ：//www.cbs.dtu.
dk/services/SignalP-4.0/）软件进行信号肽预测，跨
膜结构域的预测则使用 TMHMM 软件（http ：//www.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；使 用 Scanprosite 软 件
分析特征性肽段 ；蛋白质等电点和分子量预测使用
在线软件（http ：//web.expasy.org/compute_pi/）；使用
GSDS 在 线 软 件（http ：//gsds.cbi.pku.edu.cn/） 分 析
基因组结构。使用 SECISearch2.9 在线软件检测 Gpx
是否含硒。
1.2.5 Gpx 阅读框克隆与构建表达载体 根据获得
的 Gpx cDNA 全长进行特异性引物设计（上游引物
41B-B-GPXF 含 BamH Ⅰ酶切位点；下游引物 X-GPXR
含 Xho I 酶切位点，见表 1），用 Prime STAR GXL 高
保真酶扩增 Gpx 阅读框。PCR 反应条件为 ：94℃ 5
min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35 个循环 ；
72℃ 10 min。PCR 产物用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴
定并胶回收。分别将 Gpx PCR 产物和 pET-41b 表达
质粒用 BamH I 和 Xho I 进行双酶切，胶回收后通过
T4 连接酶连接构建 pET-41b-DdGpx 表达载体并转入
BL21（DE3）中。菌液 PCR 检测阳性克隆后送上海
生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.6 重组 Dd-GPX 蛋白表达条件优化及鉴定 吸
取 2 μL 测序正确的阳性菌液在 5 mL 含 50 μg/mL 卡
那霉素（Kan）的 LB 液体培养基中过夜培养，次日
按 1∶100 接种至含 50 μg/mL Kan 的 LB 培养基 37℃
培 养 至 OD600≈0.6， 向 菌 液 中 加 入 适 量 IPTG， 使
IPTG 终浓度为 0.2、0.6、1.0 和 1.4 mmol/L 四个浓
度，25℃继续培养至 OD600=1.4。SDS-PAGE 电泳比
较不同浓度 IPTG 对表达量的影响。选用最适 IPTG
浓度，分别于 18℃、25℃和 37℃培养菌浓度约为
OD600=1.4，超声（3 s+3 s 10 min，功率 10%，3 个循
环）冰浴破解后，4℃ 13 000 r/min 收集上清与菌液
一起进行 SDS-PAGE 电泳比较可溶性表达的最适温
度并切取目的条带送生工生物工程（上海）股份有
限公司做质谱检测。
表 1 马铃薯腐烂茎线虫 Dd-Gpx-1 基因研究中采用的引物
引物名称 序列（5-3） 作用
GPX1R TCRTGRTTYTCNGCNGGYTCYTG 核心片段扩增
SL1 GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG
GPXJ1 GTCCGAATGTAAATCTGCGAATC cDNA 3 末端扩增
GPXJ2 GTGGAGACTCTGGAGGGTGA
GPX2F TGAGGCCAGTAAACAACAATG cDNA 全长扩增
GPX2R ATATTCTTCAATAGTGGTAATC
GPXJYZ-1F CGCTATTATTCGCGTTCGTT 基因组全长扩增
GPXJYZ-1R CTTTTCCATTCTCACGGTTT
GPXJYZ-2F AAACCGTGAGAATGGAAAAG 基因组全长扩增
GPXJYZ-2R CAATGAATGGCTGCACAATT
41B-B-GPXF CGGGATCCAGGCCAGAAAACAACAATGATTAG 阅读框扩增
X-GPXR CCGCTCGAGCGGCTCTGCCTGAAGTTTCTCAATGA
T7TER TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 菌落 PCR 鉴定
注 ：41B-B-GPXF 和 X-GPXR 引物中下划线分别为 BamH I 和 Xho I 酶切位点
2 结果
2.1 Dd-Gpx基因克隆
采用 SL1 及下游简并引物进行 PCR 扩增，获得
3 条明显条带（图 1-A）。对 3 条明显条带均进行回
收、测序，Blast 比对结果显示，大小为 392 bp 的目
的片段与马铃薯金线虫（CAD38523）、秀丽小杆线
虫（CAB02659）和扭转血矛线虫（AAT28332）的
相似度分别为 66%、74% 和 84%，由此推测所获得
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10134
片段为马铃薯腐烂茎线虫 Gpx 5 端片段，再根据此
片段设计 3 RACE 引物 GPXJ1 和 GPXJ2，扩增 Gpx
3 端片段（图 1-B），回收、测序获得了 770 bp 的片
段。与 5 端片段拼接后得到 Gpx cDNA 全长。分别
在 5 端和 3 端设计特异性引物 GPX2F 和 GPX2R 以
验证拼接结果的准确性，PCR 结果显示在约 1 000
bp 处有单一条带，回收、测序结果表明验证序列与
拼接序列一致。谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）cDNA
全长为 950 bp（图 1-C），使用 NCBI ORF finder 分析
开放阅读框（ORF）表明该序列包含 1 个 681 bp 的
ORF，编码 226 个氨基酸，在 5 端起始密码子“ATG”
前存在 36 bp 的非编码区（UTR），3 端终止密码子
“ TAA”后存在 233 bp 的非编码区（UTR），C 末端
包含 12 bp 的 poly（A）尾巴，其上游含有“AATAAA”
加尾信号，表明获得的 GPX 序列为一个完整的基
因，将 cDNA 序列命名为 Dd-Gpx-1，基因登录号为：
JQ609355。
以马铃薯腐烂茎线虫基因组 DNA 为模板，用
GPXJYZ-1F 和 GPXJYZ-1R、GPXJYZ-2F 和 GPXJYZ-
2R 两对引物进行 PCR 扩增，分别得到长度约 2 000
bp 和 1 000 bp 的条带（图 1-D，1-E），测序、拼接
后得到的 Dd-Gpx-1 基因组全长为 2 706 bp，用 GSDS
软件进行基因组结构分析显示 Gpx 基因组包括 9 个
内含子和 10 个外显子（图 1-F）。
bp
2000
1000
750
500
250
100
B M 1
2000
1000
750
500
250
100
E M 1
bpbp
2000
1000
750
500
250
100
D M 1
bp
2000
1000
750
500
250
100
C M 1
bp
2000
1000
750
500
250
100
A
Gpx
0 bp
Legend: Exon Intron
500 bp 1000 bp 1500 bp 2000 bp 2500 bp
3˃5˃
M 1
F
M ：D2000 DNA 标准分子量 ；A ：Gpx 核心片段扩增 ；B ：3 RACE 扩增 ；C ：cDNA 全长扩增 ；D、E ：基因
组全长扩增 ；F ：基因组结构图
图 1 马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及基因组结构图
2.2 Dd-Gpx序列分析
预测蛋白由 226 个氨基酸残基组成多肽，分
子量（Mw）和等电点（pI）分别为 26513.10 Da 和
6.31。信号肽和跨膜结构域分析显示，预测蛋白 N
端有明显信号肽，第 16 个和 17 个氨基酸处为最可
能的剪切位点，信号肽可能性为 78.5%，剪切的可
能性为 45%，无跨膜结构域。采用 Scanprosite 软件
分析表明，预测蛋白存在 3 处特征性肽段，分别在
62-79、99-115 和 186-195 位 氨 基 酸 处， 且 64-79
氨基酸处符合谷胱甘肽过氧化物酶的活性位点签名
序列［GNDRC］-［RKHNQFYCS］-x-［LIVMFCS］-
［LIVMF］（2）-x-N-［VT］-x-［STCA］-x-［CU］-
［GA］-x-［TA］。SECISearch2.9 在 线 软 件 检 测 Gpx
表明 GPX 属于 non-Se-GPX。
将马铃薯腐烂茎线虫 GPX 与其他线虫 GPX 进
行氨基酸序列比对，结果（图 2）表明，马铃薯
腐烂茎线虫 Dd-GPX-1 与马铃薯金线虫（Globodera
rostochiensis，CAD38523）、捻转血矛线虫（Haemonchus
contortus，AAT28332）、秀丽小杆线虫（Caenorhabditis
elegans，CAB02659）、 锡 兰 钩 口 线 虫（Ancylostoma
ceylanicum，AEO32082） 的 相 似 度 分 别 为 71%、
80%、76% 和 78%。
将 已 在 NCBI 登 录 的 部 分 线 虫 GPX 序 列 采
用 MEGA5.0 软 件 中 的 最 大 似 然 法（Maximum
2015,31(10) 135刘洋等：马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因（Dd-Gpx）的克隆与原核表达
Likelihood，ML） 进 行 系 统 发 育 树 的 构 建。 结 果
（图 3）显示，植物寄生线虫和动物寄生线虫各聚
为一支，马铃薯腐烂茎线虫 DD-GPX 与捻转血矛
线 虫 HC-GPX（AAT28332）、 锡 兰 钩 口 线 虫 AC-
GPX（AEO32082）、 秀 丽 小 杆 线 虫 的 CE-GPX-5
（CAB02659） 和 CE-GPX-3（CAB02655） 以 及 马 铃
薯金线虫 GR-GPX（CAD38523）聚为一支，且与马
铃 薯 金 线 虫 GR-GPX（CAD38523） 有 较 近 的 亲 缘
关系。
2.3 Dd-Gpx阅读框克隆与构建表达载体
以 Dd-Gpx cDNA 为模板，用分别带有 BamH I
和 Xho I 酶 切 位 点 的 引 物 41B-B-GPXF 和 X-GPXR
（表 1）扩增开放阅读框，经 1.5% 的琼脂糖凝胶电
泳检测显示在 700 bp 左右有一条单一明亮的特异
条带。分别将 Gpx PCR 产物和 pET-41b 表达质粒用
BamH I 和 Xho I 进行双酶切，胶回收后通过 T4 连接
酶连接并转入 BL21（DE3）中。用 41B-B-GPXF 和
T7TER 引物进行菌落 PCR 鉴定及酶切鉴定后，随机
取 3 管阳性菌液送生工生物工程（上海）股份有限
公司测序，测序结果表明 Gpx 阅读框成功克隆进入
pET-41b 载体上。
2.4 重组Dd-GPX蛋白表达条件优化及鉴定
重组质粒 pET41b-Dd-GPX 在大肠杆菌 BL21 中
表达，表达的融合蛋白分子量约 60 kD，与预期的
理论值相符（图 4）。经质谱鉴定（图 5）分析，此
条带有 7 个肽段与马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧
化物酶匹配。结果表明，重组 Dd-GPX 蛋白表达成功。
IPTG 浓度优化结果显示，0.2、0.6、1.0 和 1.4
DD-GPX ：
HC-GPX ：
GR-GPX ：
DD-GPX ：
* 20
* 100
* * * *200 220 240180
* 120 * 140 * *160
40 60 80***
BP-GPX ：
CE-GPX-5 ：
CE-GPX-3 ：
： 46
： 46
： 84
： 72
： 70
： 68
： 69
DD-GPX ：
HC-GPX ：
GR-GPX ：
DD-GPX ：
BP-GPX ：
CE-GPX-5 ：
CE-GPX-3 ：
： 129
： 129
： 169
： 157
： 153
： 151
： 152
DD-GPX ：
HC-GPX ：
GR-GPX ：
DD-GPX ：
BP-GPX ：
CE-GPX-5 ：
CE-GPX-3 ：
： 200
： 207
： 250
： 226
： 223
： 223
： 224
方框为谷胱甘肽过氧化物酶的活性位点签名序列 ；Dd-GPX ：马铃薯腐烂茎线虫（AFJ15101）；GR-GPX ：马铃薯金线虫
（CAD38523）；HC-GPX ：捻转血矛线虫（AAT28332）；AC-CAT ：锡兰钩口线虫（AEO32082）；CE-GPX-5 ：秀丽小杆线虫
（NP_509615）；CE-GPX-3 ：秀丽小杆线虫（NP_509616）；BP-GPX ：彭亨布鲁线虫（CAA48882）
图 2 马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶（DD-Gpx-1）与其它线虫同源谷胱甘肽过氧化物酶
的氨基酸序列比对结果
0.05
100
44
90
71 HC-GPXAAT28332
AC-GPXAEO32082
CE-GPX-5CAB02659
CE-GPX-3CAB02655
DD-GPXAFJ15101
GR-GPXCAD38523
DI-GPXP52033
WB-GPXEJW76486
BP-GPXCAA48882
BM-GPXEDF323588510090
HC ：捻转血矛线虫 ；AC ：锡兰钩口线虫 ；CE ：秀丽小杆线虫 ；DD ：马铃
薯腐烂茎线虫 ；GR ：马铃薯金线虫 ；DI ：犬丝虫 ；WB ：班氏丝虫 ；BP ：彭
亨布鲁丝虫 ；BM ：马来丝虫。Bootstrap 取 1 000 次重复
图 3 基于最大似然法（ML）构建的线虫谷胱甘肽过氧化
物酶系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10136
mmol/L 四个浓度的 IPTG 对重组 Dd-GPX 蛋白的表
达量无明显影响（图 4-A）。采用 IPTG 浓度为 0.2
mmol/L，分别于 18℃、25℃和 37℃培养检测温度对
重组 Dd-GPX 蛋白可溶性表达的影响，超声破解取
上清，SDS-PAGE 电泳显示，当温度在 18℃时，重
组 Dd-GPX 蛋白基本以可溶性形式表达（图 4-B），
25℃时，表达部分可溶性蛋白（图 4-C），37℃时，
全部以包涵体形式表达（图 4-D）。
66.4
kD kD
M 1 2 3 4 5
44.3
60
66.4
kDkD
M1 2 3
44.3
60
66.4
kDkD
M1 2 3
44.3
60 66.4
kD kD
M 1 2 3
44.3
60
A B
C D
M：即用型蛋白质分子量标准（低）；A：1-5：分别为 IPTG 浓度为 0、0.2、0.6、1.0 和 1.4 mmol/L 时重组 DdGpx 蛋白表达量。 B：1，2：
分别为 18℃下，BL21（DE3）感受态细胞表达重组 DdGpx 蛋白超声破菌的上清和全菌液 ；3 ：无 IPTG 诱导的全菌液。 C ：1，2 ：分
别为 25℃下，BL21（DE3）感受态细胞表达重组 DdGpx 蛋白超声破菌的上清和全菌液 ；3 ：无 IPTG 诱导的全菌液。 D ：1 ：无 IPTG
诱导的全菌液，2，3 ：分别为 37℃下，BL21（DE3）感受态细胞表达重组 DdPrx 蛋白全菌液和超声破菌的上清
图 4 诱导 IPTG 浓度及温度对重组 DdGPX 蛋白表达量的影响
3 讨论
本研究首次克隆了马铃薯腐烂茎线虫 Gpx 基因。
使用 SECISearch2.9 在线软件分析发现 Dd-GPX 不含
编码硒代半胱氨酸残基的 UGA 密码子，也不含 Se-
GPX mRNA 的 3 端非编码区特有的茎环结构，此
结构是识别 UGA 编码硒代半胱氨酸而不是终止密
码子的功能结构。多肽预测显示蛋白 N 端具有明
显信号肽。由此推测，Dd-GPX 为一个分泌型 non-
Se-GPX。氨基酸序列对比发现 Dd-GPX 具有与其它
GPX 相同的催化三联体 C-Q-W，表明 Dd-GPX 属于
GPX 超家族中的一员。系统发育树分析发现，植物
寄生线虫马铃薯腐烂茎线虫 DD-GPX 和马铃薯金线
虫 GR-GPX（CAD38523）聚为一支，可自由生活的
秀丽小杆线虫 CE-GPX-5（CAB02659）和 CE-GPX-3
（CAB02655）聚为一支，动物寄生线虫捻转血矛线
虫 HC-GPX（AAT28332）、 锡 兰 钩 口 线 虫 AC-GPX
（AEO32082）等则聚集在其它分支。表明 GPX 在进
化上具有保守性，但又各自具有特有的进化机制使
其展现出不同功能。有研究发现，线虫 non-Se-GPX
中许多与催化底物谷胱甘肽作用的氨基酸并不具有
保守性，因此推测线虫 non-Se-GPX 可能具有与其
他类型 GPXs 不同的作用机制［7］。如 Tang 等［17］对
彭亨布鲁线虫（Brugia pahangi ）、Jones 等［11］对马
铃薯金线虫和 Sun 等［10］对捻转血矛线虫的 non-Se-
2015,31(10) 137刘洋等：马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因（Dd-Gpx）的克隆与原核表达
10
0
899.0
F:\...\B21_MS_93.t2d
Acquired:
1421.6 1944.2 2466.8 2989.4 3512.0
Mass/m/z
20
30
40
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70
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100 1.9E+4
导入重组 DdGPX 质粒的 BL21（DE3）菌液诱导培养后经 SDS-PAGE 电泳，切取目的条带送生工生物工程（上海）股份有限公司
进行质谱检测，结果为 7 个肽段与马铃薯腐烂茎线虫 GPX 蛋白匹配，图中用箭头和红色字体标记。
图 5 GPX 质谱鉴定图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10138
GPX 研究发现，真核表达的 non-Se-GPX 重组蛋白
对 H2O2 无明显活性，且均推测 non-Se-GPX 存在修
复细胞膜氧化损伤的功能。但这一推测目前还没有
找到直接的证据。此外，Jones 等［11］对马铃薯金线
虫的研究还发现，在取食和快速生长的 J2 期，Gpx
mRNA 被大量转录，且一个分泌型 non-Se-GPX 蛋白
gr-gpx-1 被大量分泌到线虫表皮，表明马铃薯金线虫
在受到寄主植物防御体系攻击时 gr-gpx-1 具有汇聚
于线虫表皮抵抗寄主攻击的能力，包括清除脂氢过
氧化物等大分子活性氧来减轻或消除氧化应激反应
及阻止由脂氢过氧化物启动的植物寄主的一系列防
御反应，以及可能的修复细胞膜氧化损伤功能。而
Dd-GPX 与 gr-gpx-1 同属于分泌型 non-Se-GPX，是否
也具有 gr-gpx-1 的相关功能还有待进一步验证。
在 Dd-GPX 原核表达的实验中，为获得较多的
可溶性表达蛋白，本研究对 Dd-GPX 融合蛋白的表
达做了 IPTG 浓度及温度的优化。结果表明，0.2-
1.4 mmol/L 的 IPTG 对 Dd-GPX 融合蛋白的表达无明
显影响，而培养基中高浓度的 IPTG 会阻碍蛋白的表
达［18］，所以，本研究选用 0.2 mmol/L IPTG 作为诱
导浓度。在温度优化方面，18℃条件下，Dd-GPX 融
合蛋白几乎全是可溶性表达，25℃时包涵体和可溶
性蛋白共存，但两个温度条件下都不能获得可观的
表达量。37℃条件下，表达量有所提高，但蛋白又
均为包涵体形式存在，不利于体外活性研究。此外，
本研究还在蛋白表达方面做了一些其他条件的优化，
如 pH 值优化（pH7.2 和 pH7.5），表达时长的优化（4、
6 和 8 h 及 过 夜 培 养 ）， 载 体（pET-41b、pET-42a）
和宿主菌［BL21（DE3）、Transetta（DE3）］的更换，
溶氧量优化（包括封口膜透气性的选择及培养基体
积的选择），但仍然无法获得可供实验用量的可溶性
蛋白。即使以包涵体形式表达，表达量也不高，因
而无法尝试复性。因此，还需对诱导时间、培养基
成分、菌体密度［19］、表达载体和表达菌株［20］等条
件做进一步优化，以期获得可观的可溶性 GPX 蛋白，
为后续 GPX 蛋白功能研究奠定基础。
4 结论
本研究克隆了马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧
化物酶基因 Dd-Gpx-1，通过原核表达获得了大小约
60 kD 的目的蛋白，经质谱鉴定此蛋白为重组 Dd-
GPX 蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）