全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
群体感应（Quorum sensing，QS）［1］是细菌之间
相互交流的一种方式，细菌通过产生一种自诱导物
（Autoinduced，AI）而相互感知，自诱导物随着细菌
密度增加而增加，当达到一定阈值时，会诱导细菌
某些特定基因的表达。自 1970 年首次发现费氏弧菌
（V. fischei）的发光［2］与细菌密度有关以来，许多
研究证明群体感应可调控细菌的生理特性，如铜绿
假单胞菌（P.aeruginosa）生物膜的形成［3］，副溶血
弧菌（V. parahaemolyticus）胞外酶的分泌［4］及霍乱
弧菌（V. cholerae）毒力因子［5］的表达等。革兰氏
阴性菌主要存在 LuxI/LuxR 系统并以 N-酰基高丝氨
酸内酯类（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）［6］物
质作为信号分子，其中 LuxI 蛋白负责信号分子的合
收稿日期 ： 2013-12-18
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31071613），十二五国家科技支撑计划（2012BAD28B05）
作者简介 ：张彩丽，女，硕士研究生，研究方向 ：水产品高值化利用 ；E-mail ：ncuskzhangcaili@163.com
通讯作者 ：曾名湧，男，教授、博士生导师，研究方向 ：水产品高值化利用 ；E-mail ：mingyz@ouc.edu.cn
一株沙雷氏菌的分离及其群体感应现象
张彩丽  朱素琴  汪映  孙秀娇  曾名湧
（中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266003）
摘 要 ： 从腐败的凡纳滨对虾中分离得到一株具有群体感应的菌株，利用 16S rRNA 和生理生化试验鉴定其为黏质沙雷氏
菌，但不产灵红素，命名为 Serratia marcescens AK1。通过生物检测方法对菌株 AK1 进行群体感应检测，薄层层析法鉴定该菌株的
信号分子类型。结合菌株生长规律，测定不同时间段信号分子的含量。结果显示，菌株 AK1 能诱导紫色杆菌 CV026 产生紫色杆菌
素，诱导根癌农杆菌 A136 分解 X-gal 产生蓝色；薄层层析检测结果显示该菌能产生两种群体感应信号分子 C6-HSL 和 3-oxo-C6-HSL，
并具有密度依赖性，信号分子含量在生长对数后期达到最大值。
关键词 ： 沙雷氏菌 鉴定 群体感应 N-酰基高丝氨酸内酯
Isolation，Identification and Quorum Sensing of a Serratia spp.
Zhang Caili Zhu Suqin Wang Ying Sun Xiujiao Zeng Mingyong
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）
Abstract:  One quorum sensing strain was isolated from spoilage Litopenaeus vannamei. Specie was determined by 16S rRNA gene
analysis and classical tests, it can not produce red pigment on medium, named it Serratia marcescens AK1.Quorum sensing was detected by
reporter strains and signal molecules types were identified by thin layer chromatography. Quantitative analysis of the signaling molecule secreted
by AK1 during different growth stages. The result indicates strain AK1 can induce Chromobacterium violaceum CV026 and Agrobacterium
tumefaciens A136 produce purple and blue color respectively. Thin layer chromatography showed that AK1 can produce C6-HSL and 3-oxo-C6-
HSL types of signaling molecules with density-dependent. They reached the maximum in the late logarithmic phase.
Key words:  Serratia marcescens Identification Quorum sensing N-acyl-homoserine lactones
成，LuxR 蛋白作为信号分子受体，通过形成受体-
自诱导物复合体，启动目的基因的转录表达。革兰
氏阳性菌［7］通过双组分的群体感应系统分泌寡肽类
（Autoinducing peptides，AIPs）信号分子。Bassler［8］
在哈维氏弧菌（V. harveyi）中发现了一种依赖于
LuxS 蛋白的细菌间交流的信号分子（Autoinducer-2，
AI-2），并证明 AI-2 是一种呋喃酮硼酸二酯（Furan-
osyl borate diester）。
沙雷氏菌（Serratia marcescens）是肠杆菌科的
一种条件致病菌［9］，存在于土壤、水、植物、动物
以及人类的肠道和呼吸道中，在机体免疫力降低或
环境污染时，可引起原发性和不同程度的继发性感
染。该菌属能够产生核酸酶、蛋白酶、脂肪酶等次
2014年第7期 151张彩丽等 ：一株沙雷氏菌的分离及其群体感应现象
级代谢产物对人类存在潜在危害。目前已有研究证
明沙雷氏菌的生物膜形成、群集运动等性状受群体
感应调控［10］。因此，研究水产品中沙雷氏菌的群体
感应，将为沙雷氏菌的防治和水产品的保鲜提供理
论指导。
本试验从腐败凡纳滨对虾中分离出一株具有群
体感应现象的沙雷氏菌 S.marcescens AK1，并对其群
体感应信号分子进行检测，旨为沙雷氏菌群体感应
调控的致病性研究提供一定科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 验 菌 株 菌 株 S. marcescens AK1 分 离 于
腐败的凡纳滨对虾中，保存于本实验室。群体感
应 报 告 菌 株 紫 色 杆 菌（Chromobacterium violaceum）
CV026 和 根 癌 农 杆 菌（Agrobacterium tumefaciens）
A136（pCF218）（pCF372）均由美国德克萨斯州立
大学 McLean RJC 教授惠赠。CV026 可检测碳链长度
从 C4 到 C8［11］的信号分子，而 A136 可检测较宽范
围的信号分子［12］，从 C4 到 C14，3-oxo-C4 到 3-oxo-C12
均可检测。CV026 和 A136 本身均不产生 AHLs，当
存在外源 AHLs 时，紫色杆菌 CV026 将产生紫色杆
菌素 ；根癌农杆菌 A136 表达 lacZ 基因，分解 X-gal
产生蓝色。
1.1.2 培养基和培养条件 菌株 S. marcescens AK1、
CV026、A136 在 30℃下培养于 LB 肉汤或 LB 琼脂
培养基中［13］。CV026 需添加 50 μg/mL 的卡那霉素，
A136 添加 4.5 μg/mL 四环素和 50 μg/mL 壮观霉素。
1.1.3 主 要 试 剂 和 仪 器 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲
哚 -β-D-吡喃半乳糖苷）、壮观霉素、四环素、卡
那霉素、N-酰基高丝氨酸内酯（C6-HSL、C8-HSL、
3-oxo-C6-HSL）购自 Sigma 公司 ；RP-C18 F254 反相薄
层层析板购自德国 Merck 公司。
1.2 方法
1.2.1 分离纯化菌株 从腐败的虾中利用平板稀释
法进行细菌的分离、纯化。根据细菌菌落特征、革
兰氏染色、镜检、生理生化试验对菌株 AK1 进行鉴定。
1.2.2 提取菌株 16S rRNA 菌株 AK1 液体条件下
培养至生长对数期（OD≈1.0），取 2 mL 新鲜菌液
10 000 r/min 离心 2 min 后弃去上清，利用 EZ-10 柱
式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒（上海生工生物工程
股份有限公司）提取基因组 DNA，所得 DNA 于 -20℃
保 存。 以 提 取 DNA 为 模 板 扩 增 16S rRNA，PCR
体 系 为 50 μL ：模 板 3 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5
μL，引物（1 mmol/L）各 1 μL，10×Taq 缓冲 5 μL，
MgCl2 3 μL，Taq 酶 1 μL，灭菌超纯水 31 μL。PCR
引物序列为 27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；
1492R ：5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。PCR
反应条件 ：95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃
1 min，共 30 个循环后，72℃10 min。将 PCR 产物
利用 0.6% 琼脂糖凝胶电泳。PCR 产物送往上海生
工生物工程股份有限公司测序。
1.2.3 检测菌株群体感应现象
1.2.3.1 报告菌株平板划线法 根据文献［14］的
方法，将被检测菌株与报告菌株 CV026 在 LB 平板
上平行划线 ；用报告菌株 A136 时，需先在 LB 平
板上涂布 20 μL X-gal（20 mg/mL），无菌风吹干后，
28℃培养 18-24 h 观察。分别以报告菌株自身作为
阴性对照，以 C6-HSL 作为阳性对照。
1.2.3.2 制备粗提液 菌株 AK1 在 LB 肉汤中过夜
培养至一定密度（OD ≈ 1.0），10 000 r/min 离心 5
min，取上清，用等量乙酸乙酯提取 3 次，混合有机
相，30℃水浴旋蒸至干，溶解于 1 mL 甲醇，-20℃
保存备用。
1.2.3.3 TLC-Biosensor 检测 分别将信号分子标准
品与乙酸乙酯提取物 2-5 μL 点样于 C18 反相薄层层
析板，利用甲醇 / 水（6040，V/V）充分展开，取
出后在常温下挥干溶剂，按制备报告平板方法制备
含 A136 菌、抗生素、X-gal 的琼脂，倾到于薄层层
析板上，凝固后，28℃培养 18-24 h 观察。以不含
A136 菌的琼脂覆盖作对照。
1.2.4 测定不同时间信号分子含量 过夜活化的菌
株 AK1 接种于液体 LB 培养基，每隔 4 h 取 50 mL
菌液，按照 1.3.2 方法提取信号分子。参照文献［15］
略作修改，β-半乳糖苷酶法检测信号分子活性，96
孔板中依次加入 100 μL 生理盐水、100 μL 过夜培养
A136（OD≈1.0），2.5 μL X-gal，2.5 μL 提取物，以
LB 液体培养基提取物做对照，28℃摇床（150 r/min）
培 养 8-12 h， 测 定 A635。 按 照 1.2.3.1 方 法 制 备 含
A136 菌、抗生素、X-gal 的报告平板，点样 2 μL 提
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期152
取物于灭菌圆纸片，无菌风吹干，放置报告平板上，
28℃培养 18-24 h 观察。
2 结果
2.1 菌株生化试验
将分离纯化的细菌进行生理生化试验，结果显
示，AK1 革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性和葡萄
糖酸盐试验阳性、苯丙氨酸脱氨酶试验阴性 ；不能
产 H2S ；能利用葡萄糖、乳糖、果糖、海藻糖、山
梨醇发酵产酸 ；不能利用阿拉伯糖 ；赖氨酸脱羧酶
阳性、DNA 酶试验阳性，β-半乳糖苷酶阳性。根据
伯杰士手册和肠杆菌科检索系统［16］鉴定其为黏质
沙雷氏菌。
2.2 16S rRNA
将菌株 AK1 的 16S rRNA（图 1）序列提交 NC-
BI 数据库进行 Blast 比对，结果显示该菌株与沙雷
氏菌序列相似度超过 99%。利用 ClustalX1.8 软件排
序，MEGA4.1 软件按照 Neighbour-Joining 聚类，构
建系统发育树如图 2 所示。
2000
bp
1000
750
500
1500
bp
M 1 2
AK199
96
100
38
61 94
87
95
100
34
40
48
0.005
Serratia quinivoransNR 037112
Serratia proteamaculansJF327454
Erwinia amylovoraGQ222272
Serratia liquefaciensFJ811866
Serratia sp.SP005KF201710
Serratia grimesiiKC167881
Serratia liquefacuensNR 042062
Serratia quinivoransHQ588852
Serratia plymuthicaAY394724
Serratia symbioticaGU394001
Serratia ficariaNR 041979
Serratia ureilyticaNR 042356
Serratia nematodiphilaNR 044385
Serratia marcescensAY498856
M ：DNA 标准品（DL2000）；1，2 ：菌株 AK1 基因组
图 1 菌株 AK1 的 16S rRNA PCR 扩增产物电泳图
图例 0.005 表示遗传距离 ；分支上的数字表示 1 000 次 Bootstrap 重抽样分析的支持百分比
图 2 沙雷氏菌 AK1 与其他沙雷氏菌之间的系统发育关系
2.3 平板划线法检测群体感应
报告菌株 CV026 和 A136 与待测菌株 AK1 平行
划线结果如图 3 所示，菌株 AK1 可以诱导紫色杆菌
CV026 产生紫色色素，诱导 A136 水解 X-gal 产生蓝
色。阴性对照无颜色变化，阳性对照分别产生紫色
和蓝色。因菌株 AK1 具有 β-半乳糖苷酶活性，所以
在 A136 平板上可看到菌株 AK1 也变为蓝色。
2.4 TLC-Biosensor
反相薄层层析法分析结果显示，对照不产生蓝
色，表明粗提物不是能水解 X-gal 的 β-半乳糖苷酶。
含 A136 的 TLC 板显示烷酰基类型信号分子迁移良
好，形成规整圆形，而氧代信号分子则具有拖尾现象。
根据迁移值及形状与标准品比对，菌株 AK1 可以产
生两种信号分子 C6-HSL 和 3-oxo-C6-HSL。报告菌株
A136 对氧代信号分子较敏感，图 4 显示 3-oxo-C6-
HSL 显色范围较大。该菌产生的信号分子类型可能
还有其他种类，其含量可能因太低而无法利用 TLC-
Biosensor 方法检测到，信号分子的进一步确定需依
2014年第7期 153张彩丽等 ：一株沙雷氏菌的分离及其群体感应现象
赖于 HPLC/MS 或 GC/MS。
2.5 不同时间信号分子含量
菌株 AK1 不同时间的信号分子分泌规律（图
5）显示，菌株 AK1 在对数前期便开始产生信号分
子且具有密度依赖性，对数后期（约 16 h）达到最
大值（约为对数前期的 3.2 倍），随着细菌进入衰亡
期，信号分子的含量也减少。报告平板法结果（图
6）与此一致。测定培养基的 pH 值，到达稳定期后，
由于次级代谢产物的积累，培养基 pH 值从开始的
pH6.97（0 h）增加到 pH7.40（16 h），并在稳定期达
到 pH8.10（24 h）。N-酰基高丝氨酸在碱性条件下不
稳定，信号分子的减少可能由于培养基 pH 值的改变。
3 讨论
革兰氏阴性菌利用 N-酰基高丝氨酸内酯类化
合物作为相互交流的信号分子［17］ 早有报道，国
内外基于 AHLs 生物表达报告基因（如 lacZ，gfp，
luxCDABEG）已构建多种不同特异性的基因工程菌
株。本研究利用群体感应报告菌株 CV026 和 A136
对腐败凡纳滨对虾中分离的粘质沙雷氏菌 AK1 的
群体感应进行检测，均呈现阳性结果。利用 TLC-
Biosensor 法检测信号分子类型，结果显示菌株 AK1
能 产 生 3-oxo-C6-HSL 和 C6-HSL 信 号 分 子， 与 Yu
TzeHorng 报道的 S. marcescens SS-1［18］产生的信号分
子类型一致，S. marcescens SS-1 可产生至少 4 种群体
感 应 信 号 分 子 3-oxo-C6-HSL、C6-HSL、C7-HSL 和
C8-HSL。S. marcescens MG1，S. plymuthica RVH1 和
S. proteamaculans B5a 均可产生 C6-HSL。可见，C6-
HSL 信号分子在沙雷氏菌属中较为普遍。菌株 AK1
可能还产生其他类型信号分子，需借助更灵敏方法
进行鉴定。AK1 产生的两种信号分子中，3-oxo-C6-
HSL 含量较为丰富，而 C6-HSL 相对较低。同时，
CV026
CV026
CV026
CV026
CV026
C6-HSL
A136
AK1
A136
C6-HSL
A136
AK1
A136
A136
AK1
AK1
图 3 利用报告菌株 CV026 和 A136 分别平行划线检测菌
株 AK1 信号分子
3-oxo-C6-HSL
C6-HSL
C8-HSL
1 2 3 4
1 ：3-oxo-C6-HSL ；2 ：C6-HSL ；3 ：C8-HSL ；4 ：菌株 AK1 粗提液
图 4 TLC 检测 AHLs
Time (h)
0 2 4 8 12 16 20 24 36
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0
2
4
6
8
10
12
β-galactosidase activity
growth curve
Lg
䠄cfu䠅/ mLΑ635
图 6 利用报告菌株 A136 检测菌株 AK1 上清中 AHLs 变化
图 5 β-半乳糖苷酶法检测菌株 AK1 上清中 AHLs 变化
4h
16h 12h
24h
0h
8h
20h
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期154
利用 β-半乳糖苷酶法和报告菌株法对菌株 AK1 产信
号分子能力进行评价，结果显示 AK1 具有较强的信
号分子产生能力，进入对数初期（约 4 h）便可产生
信号分子，对数末期（约 16 h）达到最大值，约为
对数初期的 3.2 倍。由于碱性次级代谢产物的产生
或自身的利用，信号分子在稳定期减少但仍能维持
较长时间。
沙雷氏菌易于存活，生物膜形成能力强，使
其对环境和抗生素有较强的抵抗力，由于它具有鞭
毛调节的群集运动分化行为，因而加大了其对自然
界的侵袭能力。群体感应作为一种细菌相互交流
的“语言”，当细菌释放的信号分子达到一个临界阈
值时，会相互感知，协调它们之间的生理行为。群
体感应调控沙雷氏菌的多种生理行为［19］，包括 S.
plymuthica RVH1 核酸酶、蛋白酶、几丁质酶的产生；
Serratia sp ATCC 39006 抗生素的产生 ；S. marcescens
MG1 生物膜的形成等。生物膜和群集运动增强了沙
雷氏菌对环境和抗生素的抵抗力，对人类造成潜在
危害，然而受群体感应调控的沙雷氏菌产生的某些
抗生素和灵红素［20］，具有抗菌、抗疟原微生物活性。
因此，探究沙雷氏菌的群体感应现象，可以为沙雷
氏菌的防治和利用提供依据。
本试验从腐败的凡纳滨对虾中分离的沙雷氏菌
AK1 与大部分沙雷氏菌一样能产生群体感应信号分
子，但较于其他黏质沙雷氏菌，AK1 显示出的易于
生存和极强的群体感应信号分子分泌能力，可能因
为其分离环境不同，从水生环境分离后，通过迅速
产生群体感应信号分子应对外界条件的改变。这些
信号分子对水产品食源性疾病的爆发存在怎样的威
胁，沙雷氏菌与食品体系中的腐败菌间存在怎样的
关系都有待进一步研究。通过对水产品中沙雷氏菌
群体感应的研究，可以为条件致病菌沙雷氏菌的防
治和水产品的保鲜提供一定的理论依据，为食品保
鲜剂和杀菌剂的研究指出新方向。
4 结论
腐败凡纳滨对虾中分离的黏质沙雷氏菌 AK1 具
有极强的环境适应能力，能产生两种类型信号分子，
C6-HSL 和 3-oxo-C6-HSL，且氧代类型较为丰富。信
号分子在对数初期即可产生，对数末期达到最大值，
并能在稳定期维持较长时间。
参 考 文 献
［1］Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP. Quorum sensing in bacteria ：
the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional
regulators［J］. Journal of Bacteriology, 1994, 176（2）：269-275.
［2］Nealson KH, Platt T, Hastings JW. Cellular control of the synthesis
and activity of the bacterial luminescent system［J］. Journal of
Bacteriology, 1970, 104（1）：313-322.
［3］Davies DG, Parsek MR, Pearson JP, et al. The involvement of cell-to-
cell signals in the development of a bacterial biofilm［J］.Science,
1998, 280（5361）：295-298.
［4］Lee CY, Su SC, Liaw RB. Molecular analysis of an extracellular
protease gene from Vibrio parahaemolyticus［J］. Microbiology,
1995, 141（10）：2569-2576.
［5］Miller MB, Skorupski K, Lenz DH, et al. Parallel quorum sensing
systems converges to regulate virulence in Vibrio cholera［J］. Cell,
2002, 110（3）：303-314.
［6］Pongsilp N, Triplett EW, Sadowsky MJ. Detection of homoserine
lactone-like quorum sensing molecules in Bradyrhizobium
strains［J］. Current Microbiology, 2005, 51（4）：250-254.
［7］Miller MB, Bassler BL. Quorum sensing in bacteria［J］. Annual
Reviews in Microbiology, 2001, 55（1）：165-199.
［8］Schauder S, Shokat K, Surette MG, et al. The LuxS family of bacterial
autoinducers ：biosynthesis of a novel quorum-sensing signal
molecule［J］. Molecular Microbiology, 2001, 41（2）：463-476.
［9］Grimont PAD, Grimont F, Richard C, et al. Deoxyribonucleic acid
relatedness between Serratia plymuthica and other Serratia species,
with a description of Serratia odorifera sp. nov.（type strain ：ICPB
3995）［J］. International Journal of Systematic Bacteriology, 1978,
28（4）：453-463.
［10］Rutherford ST, Bassler BL. Bacterial quorum sensing ：its role in
virulence and possibilities for its control［J］. Cold Spring Harbor
Perspectives in Medicine, 2012, 2（11）：1-25
［11］Mclean KH, Winston MK, Fish L, et al. Quorum sensing
and Chromobacterium violaceum ：exploitation of violacein
production and inhibition for the detection of N-acyl-homoserine
lactones［J］. Microbiology, 1997, 143（12）：3703-3711.
［12］Zhu J, Beaber JW, Moré MI, et al. Analogs of the autoinducer
3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibits activity of
the TraR protein of Agrobacterium tumefaciens［J］. Journal of
2014年第7期 155张彩丽等 ：一株沙雷氏菌的分离及其群体感应现象
Bacteriology, 1998, 180（20）：5398-5405.
［13］Rice SA, Koh KS, Queck SY, et al. Biofilm formation and sloughing
in Serratia marcescens are controlled by quorum sensing and
nutrient cues［J］. Journal of Bacteriology, 2005, 187（10）：
3477-3485.
［14］Chu W, Vattem DA, Maitin V, et al. Bioassays of quorum sensing
compounds using agro bacterium tumefaciens and Chromobacterium
violaceum［M］.Quorum Sensing. Humana Press, 2011 ：3-19.
［15］Tang K, Zhang Y, Yu M, et al. Evaluation of a new high-throughput
method for identifying quorum quenching bacteria［J］. Scientific
Reports, 2013, 3 ：1-9.
［16］蔡妙英 , 东秀珠 . 肠杆菌科检索系统［J］. 微生物学通报 ,
1989, 5（19）：314-319.
［17］Bassler BL, Miller MB. Quorum Sensing［M］.The Prokaryotes.
Springer Berlin Heidelberg, 2013 ：495-509.
［18］Horng YT, Deng SC, Daykin M, et al. The LuxR family protein
SpnR functions as regulator of N-acyl-homoserine lactone
dependent quorum sensing in Serratia marcescens［J］.Molecular
Microbiology, 2002, 45（6）：1655-1671.
［19］Van Houdt R, Givskov M, Michiels CW. Quorum sensing in
Serratia［J］. FEMS Microbiology Reviews, 2007, 31（4）：407-
424.
［20］Holly S, Matthew C, Lee E, et al. Phosphate availability regulates
biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, in
Serratia via both quorum-sensing-dependent and -independent
pathways［J］. Molecular Microbiology, 2003, 47（2）：303-320.
（责任编辑 李楠）