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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-11-29
基金项目 : 河北大学校内博士基金项目（2007-097）, 河北省教育厅资助项目（2007412）
作者简介 : 郑建坡 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: jianpo0009@163.com
通讯作者 : 李继刚 , 副教授 , 研究方向 : 植物基因工程 ; E-mail: lijigang@hbu.edu.cn
马铃薯非共生血红蛋白基因 StHb1 的克隆及表达
郑建坡1 曲占良1 张洪伟1 李继刚1,2
（1河北大学生命科学学院，保定 071002; 2河北省微生物多样性研究与应用实验室，保定 071002）
摘 要: 采用 RT-PCR 技术成功分离了马铃薯 StHb1 基因序列。经半定量 RT-PCR 分析表明 , StHb1 基因的表达在抗性品种 （陇
薯三号）和感性品种（荷兰十五）块茎中均受致病疫霉的侵染所抑制 ；StHb1 基因在正常生长的马铃薯块茎组织中表达量最高 ；外
源 NO 和 H2O2 的作用可明显地抑制 StHb1 基因的表达，但在抗性品种中该基因受抑制的程度低于感性品种。上述试验结果暗示了
StHb1 基因与马铃薯对致病疫霉侵染的抗性应答具有一定的相关性。
关键词: 马铃薯 致病疫霉 非共生血红蛋白 NO H2O2
Cloning and Expression of Non-symbiotic Hemoglobin
Gene（StHb1） in Potato
Zheng Jianpo1 Qu Zhanliang1 Zhang Hongwei1 Li Jigang1,2
（1College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002; 2Key Laboratory of Microbial Diversity Research and
Application of Hebei Province, Baoding 071002）
Abstract: Potato late blight caused by Phytophthora infestans （Mont.） de Bary is a worldwide disease. A cDNA of StHb1 gene was
isolated successfully from solanum tuberosum by RT-PCR. The expression analysis by semi-quantitative RT-PCR showed that the infection of
P. infestans inhibited the expression of StHb1 gene in the tuber of both resistant （Longshu 3） and susceptible （Helan 15） cultivars against P.
infestans. The highest expression level of StHb1 was observed in the tuber of non-stressed potato plants during the analysis of tissue-specific
expression, and the expression of StHb1 gene could be inhibited significantly by exogenous nitric oxide and hydrogen peroxide. However, the
degree of inhibition of StHb1 gene in resistant varieties was lower than the one in susceptible varieties. These results implied that the StHb1 gene
could play an important role in the resistance response of potato against the infection of P. infestans.
Key words: Potato Phytophthora infestans Non-symbiotic hemoglobin NO H2O2
马铃薯是世界上重要的粮蔬作物之一。据世界
粮农组织统计，我国马铃薯的种植面积及产量已位
居世界首位。致病疫霉（Phytophthora infestans）引
起的马铃薯晚疫病是导致马铃薯品质和产量下降的
主要因素之一。其发病情况视种植地域的气候条件
而定，一般情况下可减产 10%-20%，严重时可达
50% 以上，甚至绝收。我国每年因此造成的损失预
计达 80 亿元［1］。
植物非共生血红蛋白（nsHb）普遍存在于植物
界。根据系统发生学分析、基因表达特性和对 O2 的
亲和性等特征，将 nsHb 分为 nsHb1 和 nsHb2 两种
类型［2］。nsHb1 属于胁迫诱导型，低氧胁迫和过量
的氮营养均可诱导其表达［3］。nsHb1 与 O2 有极高的
亲和力，而解离效率却很低，因此推测其在植物体
内不承担 O2 的运输和储存等功能。有研究表明，低
氧胁迫诱导产生的 nsHb1 可降低植物在缺氧环境下
产生的 NO，这一过程被称为血红蛋白 / 一氧化氮循
环 ［4］。除此之外，Wang 等［5］ 首次证实番茄非共生
血红蛋白的表达受矿质营养的调控。同时组织缺氧、
渗透压、冷胁迫、NO 迸发和真菌侵染等条件均可上
调 nsHb1 的表达［6］。
本研究旨在通过 RT-PCR 技术克隆获得马铃薯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期76
非共生血红蛋白基因 StHb1，并对该基因的表达与
致病疫霉孢子、外源 NO 和 H2O2 对马铃薯的作用的
相关性进行研究。以探讨 StHb1 基因在马铃薯抗病
应答反应中的表达模式，为明确该基因在马铃薯抗
病应答反应中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
陇薯三号（马铃薯晚疫病抗性品种）由安徽省
农业科学院园艺研究所提供 ；荷兰十五（马铃薯晚
疫病感性品种）购自希森马铃薯产业集团有限公司；
致病疫霉由河北大学生命科学学院蒋继志教授提供；
DH5α 菌种由本实验室保存，M-MLV、高保真 Taq 酶、
限制性核酸内切酶及 DNA Marker 等均购自 TaKaRa
（大连）公司、载体 pUCm-T 购自生工生物（上海）
有限公司 ；TRIquick Reagent 购自 Solarbio 公司。
1.2 方法
1.2.1 StHb1 基 因 的 克 隆 根 据 GenBank 收 录 的
StHb1（AY151389.1） 的 基 因 序 列［7］， 通 过 Primer
Premier 5.0 软件设计基因特异性扩增引物，StHb1-F:
5-AAGTTTGATCATCAATCATCATGAGTAG-3，
StHb1-R: 5-GAGCCGATAGTCCATCGGAATCAG-3 ；
按 TRIquick Reagent 试 剂 说 明 书 提 取 马 铃 薯 荷 兰
十五块茎的总 RNA，以此总 RNA 为模板，反转录
获得 cDNA 并进行 PCR 扩增，反应程序 ：预变性
94℃ 3 min ；循环 94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，
35 个循环；补偿延伸 72℃ 10 min。 扩增产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测，用 Gel Extraction Kit 回收目的
条带。连接 pUCm-T 载体并转化大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞。 经蓝白斑筛选，挑取阳性单克隆提取质
粒，经 PCR 及酶切分析并由北京博迈德公司测序鉴
定。
1.2.2 StHb1 基因在马铃薯不同组织中的表达 收
集长势良好，无病虫害马铃薯的根、茎、叶、花、
块茎 5 种组织材料，用 TRIquick Reagent 试剂提取
各 组 织 材 料 总 RNA， 通 过 RT-PCR 扩 增 StHb1 基
因。以马铃薯 β-actin 基因作为内参，引物序列为
Actin-F: 5-GATGGTGTCAGCCACAC-3，Actin-R:
5-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3。扩增结果经 1.0 %
琼脂糖凝胶电泳检测以分析 StHb1 基因在马铃薯不
同组织中的表达情况。
1.2.3 P. infestans 的 侵 染 对 StHb1 基 因 表 达 的 影
响 参考 Douches［ 8］的方法，培养 P. infestans 并制
备终浓度为 1×106 个 /mL 游动孢子悬液。分别将陇
薯三号、荷兰十五马铃薯块茎切成厚度为 0.5 mm 的
厚薯片，用孢子悬液浸泡 5 min，取出薯片，用无
菌滤纸吸干表面液体，放于铺有一层滤纸及垫圈的
玻璃平皿中，分别在致病疫霉孢子处理 6、12、24、
48、72 和 96 h 后收取试验材料。同时，以灭菌蒸馏
水处理的薯片作为空白对照。分别提取各种处理试
验材料的总 RNA，利用半定量 RT-PCR 扩增 StHb1
基因，以马铃薯 β-actin 基因作为内参，扩增后经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.2.4 外 源 NO 和 H2O2 对 StHb1 基 因 表 达 的 影
响 将陇薯三号、荷兰十五马铃薯块茎切成厚度为
0.5 mm 的薯片，用 0.1 mmol/L ［9］ 的 SNP（NO 供体）
和 5.0 mmol/L［10, 11］的 H2O2 溶液分别进行处理。在
分别处理 6、12、24、48、72 和 96 h 后收取薯片，
同时以灭菌蒸馏水处理的马铃薯薯片作为空白对
照。分别提取上述各组处理材料的总 RNA，利用
半定量 RT-PCR 扩增 StHb1 基因，以马铃薯 β-actin
基因作为内参，扩增后经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检
测扩增结果。
1.2.5 切割损伤对 StHb1 基因表达的影响 为了验
证 StHb1 基因的表达是否亦受切割损伤的诱导，分
别将马铃薯两品种陇薯三号和荷兰十五的块茎切成
0.5 mm 的薯片，以灭菌的蒸馏水进行处理。在处理
0、6、12、24、48、72 和 96 h 后分别收集两品种薯
片。提取各组处理材料的总 RNA，通过半定量 RT-
PCR 扩增 StHb1 基因，同样以 β-actin 基因作为内参，
扩增结果用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2 结果
2.1 StHb1基因的分离
通过 RT-PCR 技术获得扩增产物，琼脂糖凝胶
电泳结果显示大约 650 bp 处有一条特异性扩增条带，
与预期结果（645 bp）相符。回收片段与 pUCm-T 载
体的重组质粒转化大肠杆菌 DH5α 后经 PCR 扩增与
Pst I 酶切鉴定。阳性克隆送北京博迈德公司测序分
析，结果显示扩增获得了长度为 645 bp 的 StHb1 基
2012年第2期 77郑建坡等 ：马铃薯非共生血红蛋白基因 StHb1 的克隆及表达
因片段，其中包含完整的 ORF，编码 152 个氨基酸，
终止密码子为 TAG。通过 BLAST 比对，与 GenBank
已收录的序列号为 AY151389.1 的核酸序列同源性为
100%。
2.2 StHb1基因在马铃薯不同组织中的表达
StHb1 基因在马铃薯不同组织里的表达有显著
的差异。由图 1 可以看出，感性品种荷兰十五中
StHb1 基因在块茎组织中表达量最高，其次是在根
组织中，而在叶和花中几乎没有表达。而抗性品种
陇薯三号中 StHb1 基因在各组织部位中的表达趋势
与荷兰十五基本一致，表达量最高的为块茎组织，
在叶和花中亦几乎没有表达，但在茎组织中其表达
量达到了较高水平。
铃薯块茎切片，通过半定量 RT-PCR 分析 StHb1 基
因在 NO 作用下的表达情况。如图 3-A 所示，在荷
兰十五中，对照组 0 h 时 StHb1 基因表达量最高，
随 NO 作用时间的延长，其表达呈下降趋势，72
h 后被完全抑制。而在陇薯三号中，对照组 0 h 时
StHb1 基因的表达亦最高，在 NO 作用 6 h 时 StHb1
基因的表达明显地被抑制。但是与荷兰十五相比该
基因在陇薯三号中被抑制的效果较弱。在 NO 作用
48 h 时 StHb1 基因的表达就开始有所上升，到 96 h
时其表达基本趋于正常。
图 3-B 显示马铃薯抗、感栽培品种在外源 H2O2
处理下 StHb1 基因的表达情况。在荷兰十五栽培品
种中，对照组 0 h 时 StHb1 基因表达量最高，处理
6 h 后该基因的表达明显降低，直至处理 96 h 后表
达仍被抑制。在陇薯三号的对照组中 StHb1 基因的
表达量最高，此结果与荷兰十五相一致，外源 H2O2
处理 6-48 h 之间该基因的表达呈逐渐下降趋势，而
在 H2O2 处理 72 h 时 StHb1 基因的表达又有所上升。
值得注意的是，当外源 H2O2 对陇薯三号作用 6 h 后，
该基因的表达明显高于在荷兰十五中同样处理 6 h
后的表达。这些结果表明 StHb1 基因的表达受外源
H2O2 胁迫的抑制作用，且在晚疫病抗性品种中其表
达受抑制程度低于感性品种。
1. 根 ; 2. 茎 ; 3. 叶 ; 4. 块茎 ; 5. 花
图 1 StHb1 基因在马铃薯不同组织里的表达
2.3 P. infestans的侵染对StHb1基因表达的影响
用 P. infestans 的悬浮孢子分别侵染抗性品种
（陇薯三号）和感性品种（荷兰十五）马铃薯块茎切
片，在不同侵染时间（6、12、24、48、72 和 96 h）
后收集马铃薯薯片，提取总 RNA，通过半定量 RT-
PCR 分析 StHb1 基因的表达情况见图 2。在对照组（侵
染 0 h）中，StHb1 基因在荷兰十五与陇薯三号中的
表达均表现为最高。P. infestans 侵染后，StHb1 基因
在两个品种中的表达趋势均明显被抑制。随着侵染
时间的延长（感、抗性品种分别大约为 48 h 和 24 h），
P. infestans 对 StHb1 基因表达的抑制效应呈现下降
趋势。
图 2 P. infestans 诱导 StHb1 基因的表达
2.4 外源NO、H2O2对StHb1基因表达的影响
SNP 作为外源 NO 供体处理晚疫病抗、感性马
A. 0.1 mmol/L SNP 处理马铃薯 ; B. 5.0 mmol/L H2O2 处理马铃薯
图 3 NO 和 H2O2 诱导 StHb1 基因的表达
2.5 切割损伤对StHb1基因表达的影响
对马铃薯两品种（荷兰十五 / 陇薯三号）块茎
分别进行切片处理，RT-PCR 技术分析 StHb1 基因的
表达在切割处理条件下的变化。如图 4 所示，在易
感品种荷兰十五中 StHb1 基因于 0 -12 h 之间表达量
呈现上升的趋势，当至 96 h 时表达量又趋于正常水
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期78
品。而陇薯三号中 StHb1 基因则在各时间段的表达
量明显高于对照组 0 h。
礼香等［16］研究表明拟南芥 AtGLBl 在低氧胁迫条件
下可与 H2O2 相互作用，AtGLBl 的超表达可提高拟
南芥对 H2O2 胁迫的耐受性。 Doke［17］于 1983 年在
致病疫霉侵染马铃薯过程中就观察到 O2 - 快速转化
为 H2O2。Wu 等［18］发现在转葡萄糖氧化酶基因的马
铃薯中 H2O2 水平的增加可提高马铃薯对晚疫病的抗
性。大量研究亦表明，nsHb1 的一个显著功能是调
节植物体内 NO 的动态平衡。Perazzolli 等［19］发现拟
南芥非共生血红蛋白 AHb1 在冷胁迫条件下可将 NO
氧化成 NO3 -，从而调节 NO 的水平。同时 Cantrel 等［20］
研究亦表明在冷胁迫诱导下，拟南芥 AHb1 的超表
达可有效减少 NO 的产生。曲占良等［21］研究显示
超表达棉花非共生血红蛋白 GhHb1 的拟南芥可提高
对 NO 的耐受性，且其中 H2O2 的含量高于野生型。
Dordas 等［22］在转大麦非共生血红蛋白基因的苜蓿
中发现，组织缺氧条件下反义表达植株中 NO 的含
量明显高于正义表达植株中的含量。
试验中用外源 NO 供体 SNP 和 H2O2 分别对马
铃薯抗性品种和感性品种进行处理，半定量 RT-
PCR 结果显示马铃薯 StHb1 基因的表达受外源 NO
和 H2O2 胁迫的抑制。且相对于荷兰十五而言，上述
两种抗性相关信号分子对陇薯三号中 StHb1 基因的
抑制效果偏低。这表明在马铃薯晚疫病抗性品种中
StHb1 基因对外源 NO 和 H2O2 胁迫的耐受性高于感
性品种。
为了排除各诱导过程中，切割损伤对马铃薯
StHb1 基因表达结果的影响，通过 RT-PCR 的方法对
切割单一因素下马铃薯 StHb1 基因的表达变化情况
进行了探讨。结果表明，马铃薯两品种在切割条件
下 StHb1 基因的表达呈现上升趋势，其中陇薯三号
的上升趋势较荷兰十五更加明显。这表明切割损伤
对该基因的表达具有明显上调作用。综合以上切片
后分别用 P. infestans、SNP 和 H2O2 进行处理的结果
可以确定上述 3 种处理对 StHb1 基因的表达是具有
下调作用的，推测该基因在马铃薯晚疫病的抗性机
制发挥某种作用。
综合以上分析可以得出结论，StHb1 基因的表
达存在组织差异性，且一定浓度的 P. infestans、SNP
和 H2O2 对其表达具有抑制效应。因此推测马铃薯
StHb1 基因的表达与马铃薯对致病疫霉侵染应答反
图 4 StHb1 基因的切割损伤表达模式
3 讨论
植物非共生血红蛋白于 1988 年首次在 Trema
tomentosa 的非侵染组织中发现［12］，此后相继在许多
物种中发现。到目前为止，人们对其生物学功能尚
未完全弄清楚。Larsen ［7］ 于 2003 年在马铃薯中克隆
得到血红蛋白基因 StHb1，并对其进行了初步的组
织表达鉴定。本研究参考其公布的核酸序列，克隆
获得马铃薯 StHb1 基因，利用半定量 RT-PCR 进行
的组织特异性表达鉴定结果显示，StHb1 基因在马
铃薯块茎中表达量最高，其次为根（荷兰十五）或
茎（陇薯三号）组织，而在叶和花中几乎没有表达。
而 Larsen 等的结果表明 StHb1 基因在马铃薯根组织
中的表达量最高，其次是在块茎中。这些试验结果
的微小差异，可能是由于所用马铃薯栽培品种基因
型的特异性或栽培环境等因素的不同而致。
已有文献报道，nsHb1 基因的表达可能与植物
体抗病过程相关。Seregélyes 等［13］发现在转基因烟
草中过表达苜蓿 Mhb1 基因可降低由假单胞菌属致
病菌或烟草坏死病毒引起的烟草坏死反应。曲占
良等［14］利用 SSH 方法从棉花中分离和鉴定出受
黄萎病菌侵染上调的差异表达基因 GhHb1，低氧
胁迫可诱导其表达，用大丽轮枝菌侵染后其表达
量进一步上升。本试验利用 P. infestans 孢子侵染
马铃薯块茎，通过半定量 RT-PCR 进行分析，结
果显示随着致病疫霉侵染时间的延长，StHb1 基
因的表达量明显下降。
NO 和 ROS 在植物体抗病应答反应中起着至关
重要的作用。植物与病原体相互作用引发过敏性反
应（HR），HR 过程中导致 ROS 迸发，其中包括 O2-
的产生和 H2O2 的积累。超氧化物歧化酶可加快 O2-
歧化为 H2O2，从而降低 NO 与 O2 - 反应造成的损失。
而 NO/H2O2 相互配合引发过敏性细胞死亡［15］。杨
2012年第2期 79郑建坡等 ：马铃薯非共生血红蛋白基因 StHb1 的克隆及表达
应之间具有相关性，可能通过与 NO 和 H2O2 相互作
用在马铃薯晚疫病抗病反应中起作用。今后的试验
将利用转基因技术深入探讨该基因在马铃薯抗致病
疫霉侵染机制中的生物学功能。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）