全 文 ：第 19卷 第 5期 生物化学与生物物理学报
1 9 8 7年 9月 A (即 A B IO C H IM IC A et B IO P H Y S IC A S I N I C A
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蓖麻蚕 5 . 85 r RNA 基因的结构特点带
窦少波 郑仲承 李载平
(中国科学院上海生物化学研究所 )
摘 要
利用计算机分析已知的蓖麻蚕 ( A 云协。 。 r化佃f ) 5 . S r R N A 顺序 , 发现其上有一个 P o lt 位
点。 因此 ,将 r D N A 上 P , 1t 位点两侧的 D N A 片段分别克隆在 pW R 13 质粒上 。 用末端终止
法测定了蓖麻蚕 5 . 85 r R N A 基因全顺序及与之相邻的上 、 下游部分核普酸顺序。 发现 5 . 8 5
r R N人 基因 3’ 端为 p G GG口支于G CT 。 : 。这个结果与 F en g , Y . X . 等报道的蓖麻蚕 5 . SS r R N A
顺序 31 端是 p G G G OC GA U U A A oH 有两个明显不同: 第一 , 从共同顺序 p G G G C O e 算 起 ,
6
.
8 8 r R N 人基因的 3 ` 端有九个核普酸 , 比 F en g Y . X . 等报道的 r R N A 顺序 31 端少两个核
着酸 ; 第二 , 两者在 3’ 末端共同顺序以后的两个核普酸是不一样的 。 此外, 还发现在蓖麻蚕
6
.
SS r R N人 基因上游有一个约 30 个核普酸的 op ly ( A )区。
真核生物核糖体 r R N A 基因 ( r D N A )是唯一由 R N A 聚合酶 工转录的基因 , 它的转
录有许多独特的特征氏 幻。近年来 , 有许多关于聚合酶 工转录基因调控的报道 。 从酵母 、 果
蝇到小鼠 , 比较它们的 r R N A 基因 , 没有发现明显的可用作启动子 ( p or m叭 er ) 的共同顺
序存在。 但在转录起始位点附近的顺序对于转录的调控起重要作用 ; 似乎聚合酶 工转录
基因调控的部位分布在一个较大 ( 一 2 0 ~ + 1 0 0) 的区域中低 ,o3
r D N A为多拷贝基因 , 其重复单位成线性方向排列 , 在每一重复单位中含有 1 8 5 、 5 . 8
S 和 2 8 5 rR N A 基因各一个。 r D N A 的这种特点使得它的每个重复单位在结构上除了含
有编码三种 rR N A 的编码区外 , 还存在转录内间隔区 (IT s) 、 转录外间隔区 (E T s) 和非转
录间隔区 (N T s) 。 非转录间隔区把每一转录重复单位隔开。 真核生物 r D N A 在体 内被
转录成一个肠 S前体 r R N A , 然后经加工成熟为 18 5 、 6 . 8 5 和 28 5 r R N A 即 , 估计在三
种间隔区中有一些顺序在 rR N A 成熟的加工过程中起调节作用。
此外 , 一些研究还表明 , 在原始蛋白质合成中 r R N A 可能是唯一起作用的物质 , 而核
糖体蛋白质成分则是在进化过程中参与到蛋白质合成过程中来的咖。 所以研究 r D N A 的
一级结构 , 对了解各种生物在进化上的亲缘关系 , 了解 R N A 与 R N A 及其它核糖体成分
等的相互关系及作用 , 了解 r R N A 加工成熟的特点和了解 r D N A 转录起始区的结构特点
等都具有卞分重要的意义 。
近些年 , 对各种生物 r D N A 研究的报道很多。 吴祥甫等m 报道 了蓖麻蚕 r D N A 的克
隆 ; 郑仲承等低 们报道了蓖麻蚕 r D N户 . 的酶切图谱和基因的初步定位。 鉴于 5 . S S r R N A
分子较小且容易制得 , 人们已对不同来源的 6 . S S r R N A 的顺序作了不少的测定 。 由克
本文 1 98 6年 6月 6 日收到 -
. 本课题得到国家自然科学基金委员会科学基金资助。
3钵 生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 1 9 卷
隆的基因作顺序分析 , 不仅可以与 r R N A 顺序分析的结果相互查核 , 而且可以探讨转录
后加工所要求的顺序特征 。 本文将 含 有 6 . S S r R N A 基 因的 r D N A 片段克 隆在质 粒
p W R 13 上 , 用末端终止法。 们测定了蓖麻蚕 5 . 8 5 r R N A 基因及邻接的上 、 下游部分核昔
酸顺序 。 发现 5 . S S r R N A 基因 3’ 末端比已报道的蓖麻蚕 5 . S S r R N A 顺序〔山 3’ 末端少
两个核昔酸 , 而且两者的 3’ 末端有两个核昔酸不一致 。 比较蓖麻蚕 (A云云如。 : 咖耐 ) 5 . 8 5
r D N A 与粪生覃蝇 (冼协 , a c叩: 叩成 Za) 和果蝇 (D : 韶叩耐玩 * 沁。 go 娜 e灼 6 . 8 5 r R N A 基
因区的核昔酸顺序 , 可 以看到它们之间具有很大的同源性 , 并具有一些其他的共同特征。
材 料 与 方 法
1
.
r D N A 取 克 隆 在 p B R 32 上 的蓖麻 蚕 r D N A 的 B a m泊I[ 一B a m班 片段即
P A R l l 〔7〕 (图 1 ) 。
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一 g e n e tar n s c r i P七i o n a l d i r e e t i o n :B , 现 m H I : E , 及o R 工; P , P s七I ; S , aS l l ;
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2
. 工具晦及其他 限制性内切酶由冯宗铭 、 朱绳组等同志提供 , 大肠杆菌 D N A
聚合酶 1( 大片段 )购自 B . R . L . , pW R 1 3 质粒由细胞所郭礼和同志赠送 。 p W R 13 质粒
顺序测定引物 I d ( p A A C A G C T A T G A O A T G o 。 )购自 N o w E n g l a n d , B 主o L a b S。
3
. 计算机 (A即 le l )分析 由王静英同志帮助进行 。
4
.
5
.
S S r R N A 基 因的 次 级 克 隆 将 带 有 6 . S S r R N入 基 因 的 r D N入 片 段
伪A lR l) 用 B a m班 和 P的工酶解 , 回收所需的 D N人 片段 , 将其 连 接在 p WR 1 3 质粒
D N A 上 , 转化和筛选重组质粒按 〔1刃方法进行 , 这样就可得到重组质粒 p L (图 2 ) 。 同样 ,
将 p A R l 用 P s七工和 8缸工酶解 , 回收 SP 企8缸工片段 , 克隆在 p WR 13 质粒上 , 就得到了
另一个重组质粒 p M 。
5
. 质杜 D N A 的制备 基本按 [ 1。〕进行。
6
. 石. S S r R N人 基因的顺序测定 为了测定蓖麻蚕 r D N A 上 r 的 I 位点所在区 段
的顺序 , 将两个重组质粒 p L 与 p M 都用 S七叮 切成线性 , 然后加入顺序测定引物 工进行退
5 期 蓖麻蚕 5. S S r R N A 基因的结构特点 3 75
火 。 将退火后的反应物转移到含 a[ 一 3毕」dA T P 的管中 , 混匀后分成四等份 , 依次标为 A 、
仪 O 及 T , 然后按 〔1刃中顺序测定方法反应 , 进行电泳和 X 光片放射自显影 。
结 果 与 讨 论
一 、 6 . s s r R N A 基因的顺序测定
按照 已确定的 18 5 和 2 8 5 r R N A 基因的位置 9[] , 参考 F o n g , Y . X . 等仁?1 报道的蓖
麻蚕 6 . S S r R N A 核昔酸顺序结果 , 应 用
微计算机分析找到一个 sP 证 位点。 但蓖麻
蚕 r D N A 的完整重复单位上只有一个 P 的I
位点 , 因此认 为 6 . S S r R N A 基因就 座 落
在 P就 I 位点 所 在 的 区段 , 所 以我 们 将
r D N A 上 P的工位点两侧的 D N人 片段分别
克隆在 p W R 13 质粒上 , 得到重组质粒 p L
(含 P s t-l 玩m H I 片段 ) 和 p M (含 P漪 I一
8 al 工片段 ) (图 2) , 以进行顺序测定。
本文用末 端终止 法 测 定 了蓖麻 蚕
r D N A 上 P的工位点两侧 的核昔酸顺序 ,
共测得 4 38 个核昔酸 (图 3 、 图 匀 。 由图 4
可知我们测定的这一段 D N A 顺序中含有
石 . s s r R N A 基因 。 结果表明 , 我们测定的
蓖麻蚕 5 . 8 5 : R N A 基因顺序与 F e n g , Y 。
X
.等 1t 习所报道的 5 . 8 5 r R N直 顺序基本一
致 。但在 3’ 端上有所不 同。 F en g , Y . X . 等
报道的结果 3’ 端 顺序为 p G G G CC G A U U
A A on
, 而本文测得的蓖麻蚕 5 . 8 5 r R N A
基因 3’ 端顺序 却是 p G G G CC G G C T G T二
(图 3 , 图 4 ) 。 这个结果怎么分析? 首先 ,
F ig
.
2 S u b e lo n e o f t h e 5
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S S r D N A o f
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aS m e as 还 乃 9 . 1
我们注意到了 F uj 恤时 a , H . 等山」报道过家蚕 (B O叮必少 仍 , 动的 5 . S S r R N A顺序结果 。 家
蚕 5 . 8 8 r R N A 3’ 端为 p G G G O C G GO U oH , 这与 F e n g Y . X . 等测定 的蓖麻蚕 5 . 8女R N A
g 端顺序结果相比 , 有两点差异 : 其一是在长度上 , 家蚕 5 . S S r R N A 比蓖麻蚕 5 . S S r R N A
少两个核昔酸 ; 其二是在末端的共同顺序后面有两个核昔酸不一样。 但是 , 本文测定的蓖
麻蚕 5 . S S r R N A 基因顺序在 3 尸端上却与 F uj i w ar a, H . 等测定的家蚕 石 . S S r R N A 3 , 端
顺序一致 , 只是我们的结果在 3’ 末端多出 G T 两个核昔酸。 据此 , 我们估计本文测定的
蓖麻蚕 5 . S S r R N人 基因顺序 在 3’ 端 与家蚕 5 . 8 S r R N A 3’ 端 顺序 是一 样 的 , 也 是
川 G G O C G GO T oH 。 其次 , 为了证实上面的设想 , 我们又测定了蓖麻蚕 (白黄种 , 来自南宁蚕
研所 ) 6 . 8 S rR N A 3’ 端部分的核昔酸顺序 , 结果是 p G G G 0 O GG C oU (H 待发表 ) 。 这个结
果证实了我们的想法 , 与本文测定的石. S S r R N A 基因顺序 3’ 端完全一致 , 而与 F On .g
生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 19卷
乃 g· 3S Zq u n eo i馆 an ly as es of s .SS r DN人
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Y
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. 等报道山 ,的结果不同。
本文测定的蓖麻蚕 6 . S S r R N A 基因 3’ 端顺序所以与 F e n g , Y . X . 等测定的蓖 麻
蚕 5 . S S r RN人顺序 3’ 端不一致 , 可能是由于来源于不同品系的蚕所致 , 我们用的是南宁
蚕研所的白黄种 , 而 万en g , Y . X . 等用的则是镇江来的蚕。 当然 , 镇江种的蓖麻蚕 5 . 8 5
节呱万A 基因顺序测定工作尚未见报道 , 因此这种差异是否来源于基因顺序尚待最后确定。
本文测定的蓖麻蚕 6 . S S r R N人基因顺序与 F luj w ar , H
. 等报道 。 幻的家蚕 6 . S S r R N A
顺序 3’ 端一致 , 表明这种蓖麻蚕与家蚕的亲缘关系相近。 可是 , 在口端 , 蓖麻蚕和家蚕的
5
.
8 5 了RN A 顺序有所不同 , 因此可能 5’ 端在种族关系上具有更大的保守性。 可能蓖麻
蚕和家蚕的共同祖先在进化史上某一时期发生了变异而进化成了不同的蚕 , 而在蓖麻蚕
中 , 5 . 8 8 r R N A 3’ 端的顺序差异则是在进化史上稍后的某一时期发生了变异而演化为不
同的品系 。
根据本文测得的顺序结果可知 , 6 . S S r R N入基因处在限制酶湘杠位点所在区段 (图
l)
, 其精确位置是 P日证 位点处于 石. S S r R N人 基因中第 79~ 84 个核昔酸上 , 或者 6 . 8 8
, R N A 基因座落的区城是从加订位点口 端前第花 个核昔酸起到 P s证 位点 3’ 端后第 8 3
5期 蓖麻蚕 6 .S S rRN人 基因的结构特点 77 3
一 149
5
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5
.
8 5 r R N A g e n e ; u n d e r li
n e , 5
.
8 5 r RN A ; 加二 , P st l s it 。
3 拍 生 物 化 学 一 与 生 物 物 理 学 报 19 卷
个核昔酸止 。 由 5. S Sr RN A基因的顺序结果可知 pL中的 B am H 工于。订 片段 包 含 有
石. 8 5r RN A基因的 泞 端部分 , 而 p M 中的 P 3红一 S al 工片段 包 含 的是 5 . S S r R N A 基 因
3’ 端部分 。 因此 , 基因转录的方向 (图 1 )应该是从 E , ” B , ” P ” S ” … , 这与【13 〕的结
果是一致的。 根据基因定位的结果还可 以知道 , 蓖麻蚕 r D N A 起始转录位点在 E , 附近 。
这样就可以初步定下蓖麻蚕 r D N A 上 I T S 区、 E T S 区以及 N T S 区的位置 , 为进一步确
定这些区域的位置打下了基础 。
二 、 6 . S S r R N A 基因的一级结构特点
1
. 了 端上游有一个 p ol y (A ) 区 由 r D N A 顺序测定结果可以看到在 5 . 8 5 r R N A
基因的口端上游有一个 p ol y (A )区 (一 28 ~ + 3) , 其上大约共有 30 个 人 (图 4) 。 从整体
上看 , 这些 A 存在于 r D N A 的 工T S 区内。 这么多的 A 集中存在于 6 , 8 5 rR N A 基因的
5
, 末端上游 , 说明它可能起到一个信号的作用 , 例如作为 r R N A 加工酶的识别或结合位
点 , 在 r R N A 的成熟加工过程中起一定的作用。 有趣的是由图 5 可 以见到 , 同是昆虫纲但
属双翅目的粪生覃蝇 ( cS 协护 a c哪卿,叩耐乙司和果蝇 (介。soP 械。 饥碗“助 g a 对肿 )拟 〕 , 它 们 的
石. 8 8 r R N A 基因 的 了端上游也存在较多的 A , 尤其在 一 1 ~ 一 1 6 位置 , 三者有一个共
同的 A A A A A 存在 。 似乎双翅 目与鳞翅 目 (蚕 ) 5 . S S r R N A 的成熟加工需要有类似的结
构顺序。
2
.
D N A 顺序的保守性 是图 5 中也可以看到蓖 麻蚕 6 . S S r D N A 与粪生 覃蝇
( 5
.
c p铆 .叩无韶a) 和果蝇 (D . 懈玩。 og as 云州 5 . 8 5 r D N A 相比 , 它们的基因编码区核昔酸
顺序有很大的同源性, 但在非编码区 , 这三种 r D N A 顺序叮T S 区 )同源顺序较少 , 这可 以
说明 5 . 8 5 r D N A 在进化上有较大的保守性。 此外 , 由于 5 . 8 5 r R N A 与 2 8 S r R N A 之
间因有部分碱基互补而以氢键相连系 , 因此 , 5 . 8 5 r D N A 的保守性也就暗示着它 们 的
2 8 5 r D N A 也会有相当大的保守性。 这种保守性表明它的结构顺序可能有重要的功能意
义 。 还有 , 非编码区的顺序不那么保守 , 对这些区域进行比较研究可能会为物种间的进化
关系提供重要的线索。
3
. 有一个 p s七工位点 文献报道以 5, 1。 ,一些昆虫的 r D N A 内有某些保守 的限制性
内切酶位点 , 比如是 18 S r R N A 基因上有一个 E co R工位点 , 5 . S S r R N A 基因上存在一个
sP 杠 位点等 。 本文测定的蓖麻蚕 5 . S S rR N A 基因也存在这个几杠 位点 (图 4) , 从图 5
可以看到粪生覃蝇 (兮. 。仍卿 ,叩肪乙a) 和果蝇 (D . 。 。 la 、 og a st 二 ) 的 5 . 8 5 r R N A 基因 中也存
在这样一个 P的工位点。 从图 6 可 以见到 , P s七I 位点正好处在一个大发夹结构突出环的端
点 , 这个巧杠 位点顺序在核糖体的 6 . S S r R N A 功能中可能起重要作用。
4
. 没有擂 入顺序 有一些昆虫的 5 . S S r R N A 基 因中存在一个小的插入顺序山气
因此它所编码的 6 . S S r R N A 被断成两个片段 17t , 。 如图 5 所示粪生覃蝇 ( 8 . 。 。夕甲叩 h咖 )
和果蝇 (D . 。 邵a朋夕哪`盯 )的 5 . 8 5 r R N A 基因中间都有一个小插入片段 , 前者有 2 个核
昔酸 , 后者有册 个核昔酸 。 但是蓖麻蚕 5 . S S r R N A 没有发现分成两段的现象1[ 1」, 我们
测定的蓖麻蚕 5 . S S r R N A 基因也不存在插入顺序 。 这说明尽管 这 些 昆 虫 5 . S S r R N A
基因有较大的同源性 , 但 也存在明显的分离 。
三 、 6 . 8 5 r R N A 的二级结构特点
分析一下 5 . S S r R N A 基因编码部分及与之相邻的上、 下游区核昔酸顺序就可 以看
5期 蓖麻蚕 5. S Sr N R人 基因的结构特点 3伪
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8 3O 生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 1 9卷
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5 期 蓖麻蚕 5 . 8 8rR N人 基因的结构特点
到 , 蓖麻蚕 6 . S S r R N A 基因与其他小分子 R N人 基因一样 , 它的核昔酸顺序使之可形成
一些环状或发夹状的结构 (图 6 ) 。 这些结构对维持 5 . S S rR N人 结构的稳定是必需的 , 在
工T S 区内核昔酸顺序的特点也可以使它们形成若干个发夹结构。
许多生物的 6 . 8 8 r R N A 的二级结构都有一个共同的模式 (b u r p g u n m o d ol ) 〔18 ) 蓖
麻蚕 5 . 8 8 r R N A 也可以形成这样的二级结构 , 这可能是其生物功能所必需的。 如果比
较环状结构区的顺序 , 那么可以见到 G A U O人OU U G G 环 、 A A G A A 环 、 sP 任 位点所在的
A A C U GO人 G G人环及 A U UU OGA A 环等 , 在昆虫的 5 . S S rR N A 中都是高度保守的 , 所
以环状结构及其特异顺序 , 可能在功能上也具有重要意义 。
我们还在进一步由 5 . S S r R N A 基因起向 2 8 S r R N A 基因方向测定 r D N A 的顺序 ,
试图找出 6 . S S rR N人 与 2 8 S r R N人 之间形成氢键的相互作用区域及其结构特征 , 以进
一步在一级结构中探讨与 : R N A 基因转录和转录后加工等有关的结构及其特点。
[ 1 〕
[ 2 」
参 考 文 献
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