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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
近年来，鸡的烈性病毒性传染病在我国部分地
区及世界范围呈流行趋势，如禽流感、法氏囊病、
新城疫、马立克氏病等，已成为公共卫生的一大危害。
仅 2013 年国内报道了 135 例人感染禽流感病例，造
成 45 例发病死亡，长三角地区因 H7N9 禽流感疫情
扑杀销毁的禽类据不完全统计达到数百万只。同时，
据报道目前种种迹象和最新的科学试验结果都表明
今年秋冬季节天气转冷时 H7N9 禽流感很可能还将
在我国卷土重来［1］。届时，无疑对畜禽业的发展又
将是一场劫难。
随着分子生物学技术的不断发展，加之天然干
扰素在生产和应用中的限制，使得利用基因工程手
收稿日期 ：2013-12-03
基金项目 ：山东省 2011 年科技发展计划资助项目（2011GGH22109）
作者简介 ：姜正军，男，硕士，高级工程师，研究方向 ：蛋白类药物 ；E-mail ：sinostar5555@gmail.com
通讯作者 ：黄金，博士，副教授，研究方向 ：蛋白类药物研发 ；E-mail ：huangjin979@zjut.edu.cn
毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的工艺研究
姜正军1  刘树海1  王茂超1  程全明1  黄金1，2
（1. 山东华辰生物科技有限公司，潍坊 261061 ；2. 浙江工业大学药学院，杭州 310014）
摘 要 ： 考察了 10 L 罐规模条件下 pH、温度、装液量以及碳源流加模式对毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的影响，
确定了最优的生产工艺 ：在 pH5.5、28℃、40% 装液量条件下，当初始碳源耗尽的情况下，进行甘油和甲醇混合（流加体积速率
比为 20∶1）脉冲流加，产物鸡 α-干扰素抗病毒活性最高，可达 3×106 IU/mL。将该工艺在 50 L 发酵罐规模条件下进行放大，重
复 20 批，结果表明此过程重复性较好，且目的蛋白表达量稳定，具有工业化生产的实际应用价值。
关键词 ： 毕赤酵母 鸡 α-干扰素 优化 放大
The Improvement of Chicken Alpha Interferon Expression by a
Recombinant Pichia pastoris with Cultural Condition Optimization
Jiang Zhengjun1 Liu Shuhai1 Wang Maochao1 Cheng Quanming1 Huang Jin1，2
（1. Shandong Huachen Bio-tech Co.，Ltd，Weifang 261061 ；
2. College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014）
Abstract:  To achieve excellent performance of Pichia pastoris for chicken alpha interferon expression, pH value, temperature, culture
volume and carbon source feeding pattern were optimized. The maximum anti-virus activity（3×106 IU/mL）was harvested in the conditions
of pH5.5, 28℃, and 40% culture volume in 10 L fermentor, as well as the glycerol-methanol（20∶1, V/V）co-feeding pattern was conducted
when carbon source exhausted. This process was successfully scaled up to 50 L fermentor and the fermentation performance was also steady,
which could be taken advantage of for its industrial application.
Key words:  Pichia pastoris Chicken alpha interferon Optimization Up-scale
段介入干扰素的生产成为了生产和研发的主流。20
世纪 70 年代起，研究者就开始探索利用基因工程手
段进行 IFN 的生产，取得了很大进步。近年来，国
内对鸡干扰素的研究陆续展开，但多数侧重于鸡 II
型干扰素（IFN-γ）的研究和开发，而对鸡 I 型干扰
素（IFN-α）的研究和开发主要集中在基因克隆及其
表达上［2，3］。因中下游发酵技术以及高密度培养理
论未能有效衔接上游分子改造，致使利用重组工程
菌高密度培养生产干扰素过程中遇到高密度培养困
难、工艺控制复杂、生产稳定性差、生产规模放大
困难等问题，已成为制约我国干扰素生产和应用的
瓶颈问题。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期116
本课题组前期研究利用毕赤酵母表达系统成功
地进行了鸡 I 型干扰素（IFN-α）的表达，将去掉全
阅读框的信号肽序列后的鸡干扰素成熟蛋白的基因
序列整合到酵母表达载体 pPICZa-A 上。重组菌获得
外源蛋白（鸡 IFN-α）纯度大于 70%，经过 65 636
倍稀释发现能完全抑制 100-1 000 TCID50 的水疱性
口炎病毒的攻击。同时其对 VSV 和禽流感病毒的转
录、翻译阶段抑制能力尤为明显［4，5］。本研究在前
期试验的基础上，进行毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-
干扰素的工艺优化和放大试验，获得较为成熟的工
艺，旨在为鸡 α-干扰素规模化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 鸡 α-干扰素重组酵母菌 Pichia pastoris
IFNα-pPICZαA，由南京农业大学农业部动物疫病诊
断与免疫重点开放实验室保藏。
1.1.2 培 养 基 活 化 培 养 基 ：1% 酵 母 粉，2% 胰
蛋 白 胨，2% 葡 萄 糖，18.218% D-山 梨 醇。115℃，
20 min 灭菌。
种子培养基：1% 酵母粉，2% 胰蛋白胨，1% 甘油，
1.34% YNB 和 4×10-7 生物素（灭菌后过滤添加），
用磷酸缓冲液调节初始 pH6.0，121℃，20 min 灭菌。
初始发酵培养基：1% 酵母粉，2% 胰蛋白胨，0.5%
甲醇、1.34% YNB 和 4×10-7 生物素（灭菌后过滤添
加），用磷酸缓冲液调节初始 pH6.0，121℃，20 min
灭菌。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 将从平板单菌落挑 2 环接入活化
培养基（100 mL/500 mL 摇瓶）中，在 30℃，220 r/min
下培养 24 h 后，以 10 %（V/V）接种量接入装有 2.5
L 种子培养基的 5 L 种子罐中进行扩大培养，培养
温度为 30℃，pH6.0，转速 300 r/min，通风量为 1.0
vvm，培养至 OD650 = 40 以上时，以 10%（V/V）接
种量压入 10 L 发酵罐中，初始转速为 300 r/min，初
始装液量 60%，温度 30℃，pH6.0 ；对于 50 L 规模
发酵放大试验，以 10 L 罐为二级种子罐（其培养
条件同 5 L 种子罐），初始发酵条件与 10 L 规模试
验相同，过程调控转速和通气量保持溶解氧浓度大
于 10% ；发酵过程脉冲流加甲醇、甘油或葡萄糖，
通过测定和监控使甲醇、甘油或葡萄糖浓度控制在
0.1%-0.5%。
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 菌体生长 采用比浊法，使用紫外分光光
度计测定。将发酵液样品经适当稀释，测定其在
650 nm 下的光密度 OD650 ；测定细胞干重时，将从发
酵罐中所采具有不同 OD650 值的样品，离心洗涤 2 次，
80℃下烘干至恒重，得到表达鸡 α-干扰素重组毕赤
酵母的细胞干重与 OD650 之间的关系为 ：Y（DCW）
= 0.417 OD650。
1.2.2.2 抗病毒活性测定 测定用细胞和病毒由南
京农业大学赠送，细胞为鸡胚成纤维细胞（CEF），
病毒为水泡性口炎病毒（VSV）。测定方法参照参考
文献［6］的抗病毒活性测定方法。
1.2.2.3 甘 油 浓 度 测 定 采 用 HPLC 法，Agilent
1100 液 相 色 谱 仪，C18 反 向 柱，5 μm，4.6 mm×
250 mm ； 流 动 相 ：70% 乙 腈，30% 水 ； 流 速 ：
0.6 mL/min ；柱温 ：30℃ ；进样量 ：5 μL ；检测器 ：
示差折光检测器。
1.2.2.4 甲醇浓度测定 参照文献方法［7］用气相
色谱仪测定。
1.2.2.5 葡萄糖浓度测定 利用 SBA-40 生物传感仪
测定（山东省农业科学院）。
2 结果
2.1 pH对毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰素的
影响
在 10 L 罐发酵水平，维持不同的 pH 条件下，
考察其对干扰素表达及菌体合成的影响。结果（图
1）显示，维持 pH5.5 条件下，发酵 42 h，细胞干重
达到 25.5 g/L，产物鸡 α-干扰素 IFN-α 抗病毒活性达
0
5
10
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20
25
30
35
5 5.5 6 6.5 7
pH
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500000
1000000
1500000
2000000
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图 1 pH 对毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的影响
2014年第6期 117姜正军等 ：毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的工艺研究
到 2×106 IU/mL。虽在 pH6.0 条件下获得的细胞干
重与 pH5.5 相比更高，但产物抗病毒活性相对较低，
所以选择维持 pH5.5 进行后续试验。
2.2 温度对毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰素
的影响
通过考察不同温度条件下对菌体合成和产物鸡
α-干扰素抗病毒活性的影响发现，维持全过程温度
28℃时，产物鸡 α-干扰素抗病毒活性最高，可达到
2×106 IU/mL（图 2）。
随着装液量的减少，P/V（单位体积功率系数）将增大，
从而对菌体细胞产生较大的剪切力，造成细胞破碎。
2.4 碳源流加模式对毕赤酵母高密度培养表达鸡
α-干扰素的影响
考察不同流加模式对毕赤酵母高密度培养表达
鸡 α-干扰素的影响，结果（表 1）显示，以模式 1，
即甘油和甲醇混合（流加体积速率比为 20∶1）脉
冲流加，在获得最大菌体量的同时，获得鸡 α-干扰
素最大的抗病毒活性为 5.1×106 IU/mL。
表 1 碳源流加模式对毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰
素的影响
模式
发酵周期
（h）
底物消耗速率
（g/L/h）
菌体干重
（g/L）
抗病毒活性
（IU/mL）
1 56 6.2 51.5 5.1×106
2 40 10.1 21.4 4.7×105
3 60 8.5 34.3 5.5×105
4 42 13.2 30.1 3.1×106
初始碳源耗尽的情况下，溶氧开始迅速上升，此时进行以下模式的控制。
模式 1：进行甘油和甲醇混合（流加体积速率比为 20∶1）脉冲流加；模式 2：
进行葡萄糖（80% 浓缩糖）和甲醇混合（流加体积速率比为 20∶1）脉冲流加；
模式 3 ：进行甘油、葡萄糖和甲醇混合（流加体积速率比为 10∶10∶1）脉
冲流加 ；模式 4 ：进行甲醇流加
2.5 规模放大试验
将 10 L 自控发酵罐的补料批次发酵过程（图 4）
显示，在 50 L 规模进行放大，重复 20 批。结果显
示，与 10 L 罐上的各项表观参数相比，50 L 罐发酵
过程各项目标参数与 10 L 没有较大的变化，结果重
现性较好，生产过程各项参数较为稳定（表 2），且
目的蛋白表达量稳定（图 5），具有工业化生产的实
际价值。
0
5
10
15
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30
35
26 28 30 32 34⑙ᓖć
0
500000
1000000
1500000
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图 2 温度对毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的影响
2.3 装液量对毕赤酵母高密度培养表达鸡α-干扰
素的影响
鉴于装液量对于工程菌发酵的重要性（影响营
养物及氧气的传递性能），考察了 10 L 发酵罐中不
同装液量（80%、70%、60%、50% 和 40%）对菌体
合成及鸡 α-干扰素表达的影响。结果（图 3）表明，
随着装液量的增加菌体合成量大致呈下降趋势。而
在装液量为 50% 条件下，在获得较大菌体量的同时，
产物获得了最高的抗病毒活性（3×106 IU/mL）。在
40% 装液量条件下的发酵液经镜检发现大量细胞碎
片的存在，推测原因可能是在相同搅拌功率条件下，
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40 50 60 70 80
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图 3 装液量对毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的影响
0
20
40
60
80
100
120
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000ⓦ䀓≗⎃ᓖ 㧼փᒢ䟽 ᣇ⯵∂⍫ᙗ
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图 4 10 L 自控发酵罐的补料批次发酵过程图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期118
3 讨论
目前利用毕赤酵母表达系统进行鸡 I 型干扰素
（IFN-α）表达的报道已经屡见不鲜，且其表达产物
IFN-α 对 VSV 和禽流感病毒的转录、翻译阶段具有
确切的抑制作用［4，5］。温度对毕赤酵母高密度流加
培养表达外源蛋白表达过程有极大的影响，过高的
温度会导致细胞代谢活性低（表现为过低的 AOX 活
性），而过低的温度同样会带来大量毒性物质甲醛和
过氧化氢积累［8，9］。在通常条件下，毕赤酵母利用
甲醇表达外源蛋白过程中，甲醇同时充当诱导剂、
碳源和能源的角色，直接导致能量再生速度不足限
制目标蛋白的高效可持续表达 ；另一方面，甲醇代
谢途径过重的能量再生运转负担还会诱发中间毒性
代谢产物（如甲醛）的生成积累，造成细胞过早
衰亡［10］。
一般来说，重组毕赤酵母进行干扰素表达多采
用补料-分批发酵形式进行，以指数形式补料使细胞
以恒定速率生长，易于实现菌体生长的高密度，从
而对重组蛋白的表达十分有利。此过程分为两个阶
段 ：高密度流加培养和蛋白诱导表达阶段。对于高
密度流加培养过程报道主要集中在基于比生长速率
的最优甲醇流加控制以及甲醇浓度的控制方面。而
高生长速率条件下，溶解氧通常是一个限制性因素，
通过富氧提供、提高罐压、保持培养液中甲醇低浓
度等手段来维持和改善细胞呼吸代谢往往成为现有
生产过程控制的主要方式。但提供富氧和提升罐压，
往往会造成细胞毒性和呼吸代谢受到抑制等问题。
由于甲醇充当碳源、能源和诱导剂的三重角色，致
使维持培养液中甲醇低浓度对能量 / 呼吸代谢也是
无益的（外源蛋白的形成和生产过程中需要消耗大
量的能量，能量的供给和储存与外源蛋白表达的同
化合成途径严重地互相依存），同时甲醇浓度过低诱
导强度不够，蛋白表达效率将受到影响［11-13］。
本研究从 pH、温度、装液量以及碳源流加模式
等方面对毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的生
产工艺进行了摸索，并进行了发酵规模的放大试验，
以期获得适用于工业化生产的工艺条件。而基于高
密度环境条件下的能量 / 呼吸代谢的响应机理正在
研究之中。
4 结论
本研究首先在 10 L 罐规模条件下考察了 pH、
温度、装液量以及碳源流加模式对毕赤酵母高密度
培养表达鸡 α-干扰素的影响，确定了最优的生产工
艺 ：在 pH5.5、28℃、40% 装液量条件下，当初始
碳源耗尽的情况下，进行甘油和甲醇混合（流加体
积速率比为 20∶1）脉冲流加，产物鸡 α-干扰素抗
病毒活性最高，可达 3×106 IU/mL。在 50 L 发酵罐
规模条件下，将该工艺进行放大，重复 20 批，结果
表明此过程重复性较好，且目的蛋白表达量稳定，
具有工业化生产的实际应用价值。
参 考 文 献
［1］ Cowling BJ, Jin L, Lau EHY, et al. Comparative epidemiology of
human infections with avian influenza A（H7N9）and A（H5N1）
viruses in China ：a population-based study of laboratory-confirmed
cases［J］. Lancet, 2013, 382（9887）：129-137.
［2］ 葛忠源 , 张秀云 . 鸡干扰素研究进展［J］. 家禽科学 , 2010, 5 ：
46-48.
［3］ 岳道友 , 索勋 , 汪明 , 等 . 鸡 α-干扰素研究进展［J］. 中国家禽 ,
2010, 32（17）：45-47.
［4］ 陈溥言 , 蔡梅红 , 曹瑞兵 . 一种重组鸡 α 干扰素的生产方法及
表 2 50 L 发酵规模毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素
过程稳定性
批次
发酵周期
（h）
底物消耗速率
（g/L/h）
菌体干重
（g/L）
抗病毒活性
（IU/mL）
1# 56 6.2 51.5 5.1×106
2# 56 5.8 48.7 4.9×106
3# 56 6.1 50.1 5.0×106
4# 56 6.0 50.6 5.0×106
5# 56 5.9 52.5 5.3×106
从 20 批中随机选取 5 批发酵过程的各项参数进行统计
71
kD
1 2 3 4 5M
50
35
25
16 ⴞⲴ㳻ⲭ
8
M ：标准蛋白 ；1 ：1# 批次 ；2 ：2# 批次 ；3 ：3# 批次 ；4 ：4# 批次 ；5 ：5# 批次
图 5 50 L 发酵罐中不同批次重组鸡 α-干扰素的表达
2014年第6期 119姜正军等 ：毕赤酵母高密度培养表达鸡 α-干扰素的工艺研究
其重组载体 ：中国 , CN200410041075.0［P］.2004-06-24.
［5］ 蔡梅红 , 张素芳 , 曹瑞兵 , 等 . 重组酵母鸡 γ 干扰素的抗病毒活
性测定及临床初步应用［J］. 微生物学报 , 2006, 46（1）：115-
119.
［6］ 蔡梅红 , 曹瑞兵 , 曹景立 , 等 . 重组酵母鸡干扰素的诱导表达
及其抗 MDV、NDV 能力［J］. 西北农林科技大学学报 , 2010,
38（9）：37-41.
［7］ 邓兵兵 , 方宏清 , 薛冲 , 等 . 甲醇营养型酵母高密度培养过程
中甲醇和乙醇的 GC 快速检测［J］. 工业微生物 , 2001, 31（2）：
69-72.
［8］ Wegner G. Emerging applications of the methylotrophic yeasts［J］.
FEMS Microbiol Rev, 1990, 87（3-4）：279-283.
［9］ Li ZJ, Xiong F, Lin QS, et al. Low-temperature increases the yield of
biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris［J］.
Protein Express Purif, 2001, 21（3）：438-445.
［10］ Ramón R, Ferrer P, Valero F. Sorbitol co-feeding reduces metabolic
burden caused by the overexpression of a Rhizopus oryzae lipase in
Pichia pastoris［J］. J Biotechnol, 2007, 130（1）：39-46.
［11］ Kobayashi K, Kuwae S, Ohya T, et al. High level secretion of
recombinant human serum albumin by fed-batch fermentation of the
methylotrophic yeast, Pichia pastoris, based on optimal methanol
feeding strategy［J］. J Biosci Bioeng, 2000, 90（3）：280-288.
［12］ Zhang W, Bevins MA, Plantz BA, et al. Modeling Pichia pastoris
growth on methanol and optimizing the production of a recombinant
protein, the heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin,
serotype A［J］. Biotechnol Bioeng, 2000, 70（1）：1-8.
［13］ Krainer FW, Dietzsch C, Hajek T, et al. Recombinant protein
expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol
utilization pathway［J］. Microb Cell Fact, 2012, 11 ：22.
（责任编辑 马鑫）