全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-04-18
作者简介 ：吴世根，男，硕士，研究方向 ：发酵法生产富马酸 ；E-mail:genshiwu@126.com
通讯作者 ：邓利，男，博士，研究方向 ：生物催化 ；E-mail:dengli@mail.edu.cn
丙酮酸羧化酶基因的过量表达对富马酸代谢的影响
吴世根 张婷 邓利
（北京化工大学生命科学与技术学院 北京生物加工过程重点实验室，北京 100029）
摘 要: 旨在研究丙酮酸羧化酶胞质同工酶（PC）基因在毕赤酵母中的过量表达对 TCA 还原途径碳源分流及草酰乙酸、L-
苹果酸生产的影响，构建了表达载体 pPIC3.5K-PC，并转化了毕赤酵母 GS115。转化子经过表型鉴定，PCR 分析和 G418 浓度梯度
筛选获得了高拷贝的重组子（pas-01）。甲醇诱导表达后，经 SDS-PAGE 分析及 PC 活性检测，发现酶活提高了 3 倍，说明 PC 在
毕赤酵母中获得了成功表达。以 pPIC3.5K 转化菌为对照，对该重组子进行了草酰乙酸及苹果酸的发酵研究。结果显示，草酰乙酸
产量（177.4 mg/L）提高了 109.6%，L-苹果酸的产量（127.45 mg/L）提高 33.7%，菌体生物量提高 15.7%，表明 PC 的过量表达有
助于 L-苹果酸和草酰乙酸的积累，并且对菌体的生长有一定的促进作用。
关键词: 丙酮酸羧化酶 草酰乙酸 L-苹果酸 pPIC3.5K 毕赤酵母
Effect of Over-expressing of Pyruvate Carboxylase
Gene on Production of Fumarate
Wu Shigen Zhang Ting Deng Li
（Beijing Key Lab of Bioprocess，College of Biology Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029）
Abstract: We overexpressed PC gene in Pichia pastoris GS115，and investigated its influence on the diversion of carbon to the reductive
TCA pathway and the yields of the oxaloacetate and L-malic acid. The expression vector pPIC3.5K-PC was constructed，and was introduced
in Pichia pastoris GS115. A high-copy recombinant（pas-01）was screened out from 30 positive transformants by phenotypic identification，
PCR analysis and G418 concentration gradient selection. After methanol induction，recombinant protein was analysed by SDS-PAGE and PC
activity was detected. Results showed that PC was overexpressed in the Pichia pastoris，and the activity was increased 3-folds. Compared to the
control（pPIC3.5K transformant），oxaloacetate production（177.4 mg/L）of the recombinant（pas-01）was increased by 109.6%，L-malic
acid production（127.45 mg/L）increased by 33.7% and cell biomass increased by 15.7% through the fermentation. These results indicated
that overexpression of PC is propitious to the accumulation of oxaloacetate and L-malic acid，which also play a significant role in promoting the
growth of strain.
Key words: Pyruvate carboxylase Oxaloacetate L-malic acid pPIC3.5K Pichia pastoris
丙酮酸羧化酶（PC，EC 6.4.1.1）是一种生物素
依赖性多功能酶，位于丙酮酸代谢途径中的一个分
支点上，是 TCA 胞质还原途径中的关键酶 [1]，在中
间代谢途径中具有重要的作用，它催化丙酮酸转化
为草酰乙酸，期间伴随 ATP 的分解，催化生成的草
酰乙酸主要参与糖异生途径，TCA 还原途径，同时
需要参与回补 TCA 循环 [2]。各种丝状真菌如根霉属
（Rhizopus），在液体培养基中能够积累富马酸、L- 苹
果酸或者草酰乙酸等有机酸，最重要原因之一就是
细胞质中 PC 的存在，并且具有较强的活力 ；而在哺
乳动物细胞、植物细胞以及大部分的真核细胞胞质
中不存在 PC，它们的 PC 只存在于线粒体中 [3]，因
此正常情况下这些细胞不会积累有机酸，只有当哺
乳动物细胞在病理状态下，突变体的真核细胞才可
能会积累富马酸、L-苹果酸和草酰乙酸 [4] ；对于丝
状真菌而言，细胞在正常生长情况下，由于其胞质
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期176
中 TCA 还原途径的存在，也可以积累这些有机酸 [3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）与丝状真菌的相似
之处在于，其胞质中也存在 TCA 还原途径，但是
丙酮酸羧化酶胞质同工酶（PC）等关键酶酶活很
低，所以很难提高草酰乙酸、L-苹果酸等有机酸的
代 谢 流 [6]。 在 酿 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）
细胞中含有两种丙酮酸羧化酶基因 PYC1 和 PYC2，
Rintze 等 [7] 对 PYC2 基因进行强化表达研究，通过
增强丙酮酸的羧化作用，以增加草酰乙酸和 L-苹果
酸的积累，结果发现它们的代谢流并未发生明显的
变 化。2004 年 Henry 等 [6] 在 大 肠 杆 菌（Escherichia
coli）DH5α 中 研 究 了 PYC（ 丙 酮 酸 羧 化 酶， 来
自 Lactococcus lactis）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
（PEPC）基因的共表达对琥珀酸生产的影响，试验
中发现 PYC 的过量表达不仅有助于增加琥珀酸途径
的碳源分流，而且也可以减少副产物乳酸的产量。
经过氨基酸序列对比发现，酿酒酵母中 PYC2 和乳
酸球杆菌中 PYC 蛋白与毕赤酵母中 PC 蛋白相比只
有 84% 的同源性，在毕赤酵母中丙酮酸羧化酶只有
一个基因编码，表达的蛋白分布在胞质中所以叫做
胞质同工酶，而酿酒酵母中的两种丙酮酸羧化酶同
工酶分别由 PYC1 和 PYC2 两种基因编码。研究表
明，缺失 PC 的毕赤酵母突变体，菌体生长非常缓慢，
并且异柠檬酸酶和 NAD 等一些重要酶的表达也会受
到影响 [8]。
草酰乙酸、L-苹果酸和富马酸都是重要的有机
酸，在医药、食品、化工等行业有着广泛的应用，
目前这些有机酸的生产方法主要有化学法（如富马
酸）和转化法（如 L-苹果酸），但是化学法环境污染
较为严重，转化法成本较高。微生物发酵是一个绿
色环保，成本较低的 L-苹果酸的生产方法，但是限
于菌株自身的产酸能力，难以实现工业化 [3]。因此，
欲改变菌株的产酸瓶颈，必须采用分子生物学的手
段对菌株进行代谢途径改造，提高 L-苹果酸的代谢
流。丙酮酸羧化酶（PC）在 L-苹果酸的代谢途径中
具有重要的作用，在 L-苹果酸基因工程菌的构建过
程中，PC 基因的过表达是不可或缺的研究内容。
毕赤酵母的遗传背景清晰，现已成功克隆表达
外源蛋白近 500 种，其具有高效、成熟的表达载体，
营养要求简单 [9]，因此本研究选用毕赤酵母来研究
PC（来自毕赤酵母 GS115）的过表达对草酰乙酸、L-
苹果酸生产的影响，可操作性更强。pPIC3.5K 质粒，
利用 AOX1 启动子强化表达毕赤酵母中 PC，从而提
高 PC 的活力，进而考察 PC 的过量表达对菌体的生
长及有机酸代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 用于基因操作的菌株为毕赤酵
母 Pichia pastoris GS115 和 大 肠 杆 菌 Escherichia coli
DH5α（北京化工大学基因组实验室保藏）。毕赤酵
母表达载体 pPIC3.5K 为本实验室保存，克隆载体
pGEM-T 购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶（Not Ⅰ、BamH Ⅰ、
Sac Ⅰ）、T4 DNA 连接酶、Easy TaqTM DNA 聚合酶及
dNTPs 等购自宝生物工程（大连）有限公司，测序
及引物由北京三博生物科技有限公司完成，胶纯化
回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京博迈德
科技发展有限公司，卡那霉素、氨苄霉素、无氨基
酸的硫氨酸酵母氮源培养基（YNB）、抗生素 G418、
生物素购自上海生工生物工程技术服务有限公司，
其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 LB、YPD、MD、BMGY 及 BMMY 培
养基按照 Invitrogen Pichia Expression Kit 使用手册推
荐的方法配制。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 毕赤酵母 GS115 接种于 YPD 培
养基中，28℃培养 3 d 后，收集菌体，采用氯化卞
法提取基因组 DNA[10]。
1.2.2 丙酮酸羧化酶胞质同工酶基因（PC）的克
隆与序列分析 根据 GenBank 数据库注册的 PC 序
列设计上、下游引物 ：P1（5-CGGGATCCATGGCC
GAAGAAGACTACT-3）和 P2（5-ATAAGAATGCGGC
CGCTTACTCAGCCTTGACGATT-3），下划线分别为
BamH Ⅰ和 Not Ⅰ酶切位点 ；以基因组 DNA 为模板
扩增毕赤酵母 GS115 中的丙酮酸羧化酶胞质同工酶
基因（大小约为 3 524 bp）。PCR 产物经电泳回收后，
连接至 pGEM-T 载体，转化进 E.coli DH5α。阳性重
组子送北京三博生物科技有限公司测序，用 NCBI
数据库对测序结果进行序列分析，得到正确的克隆
2011年第12期 177吴世根等 ：丙酮酸羧化酶基因的过量表达对富马酸代谢的影响
载体 pGEM-T-PC。
1.2.3 重 组 质 粒 pPIC3.5K-PC 的 构 建 将 pGEM-
T-PC 载体用 BamH Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切，回收大小
为 3 524 bp 的目的片段，并与同样双酶切回收的
pPIC3.5K 载体片段连接，转化 E.coli DH5α 菌株，经
菌落 PCR（使用引物 P1 和 P2，反应程序为 ：94℃ 4
min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 3.5 min，30 个循环；
72℃ 10 min）初步鉴定得到阳性克隆，提取阳性克
隆细胞中的质粒，然后进行双酶切鉴定。将鉴定为
阳性的重组质粒送北京三博生物科技有限公司测序，
测序结果正确的阳性重组质粒命名为 pPIC3.5K-PC。
1.2.4 毕 赤 酵 母 的 转 化 和 His + Mut + 重 组 子 的 筛
选 制备毕赤酵母感受态细胞，并将 7 µg 经 Sal Ⅰ
酶切线性化的质粒 pPIC3.5K 和 pPIC3.5K-PC 分别电
转化毕赤酵母 GS115 的感受态细胞中，电转化条件
为 1 500 V、25 µF。转化后涂布 MD 平板，30℃培
养至转化子出现。用灭菌的牙签挑取转化子分别点
种于 MD 和 MM 平板上，确定其甲醇利用表型，在
MD 平板上正常生长，MM 平板上不生长或生长缓慢
的为 His + Mut +转化子。将表型鉴定为 His + Mut +的阳
性转化子分别点种于含有 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5
和 3.0 g/L 遗传霉素 G418 的 YPD 平板上，30℃培养
2 d，在高浓度 G418 平板上生长的菌株为含有高拷
贝的 His + Mut +重组子。
1.2.5 重组毕赤酵母的 PCR 鉴定 将高拷贝 His +
Mut +表型重组子接种于 100 mL YPD 培养基中，30℃
培养 2 d，提取基因组进行 PCR 鉴定，所用引物为通
用引物 5AOX（5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3）
和 3AOX（5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3），
PCR 反应程序与 1.2.3 中菌落 PCR 一致。
1.2.6 重组毕赤酵母的诱导表达 将 PCR 鉴定正确
的 His + Mut +表型重组子接种于 25 mL BMGY 培养基
中，30℃培养至 OD600=2.0-6.0，离心收集菌体，用
100 mL BMMY 重悬，30℃诱导培养 120 h，每隔 24
h 取样 1 mL，并同时补加甲醇至总体积的 0.5%。样
品 5 000 r/min 离心收集样品，进行 SDS-PAGE 分析。
1.2.7 PC 活性的测定 [2] 重组菌诱导培养 36 h 时
离心收集菌体，加入 10 mL 裂解缓冲液（pH7.8）超
声破碎，12 000 r/min 离心 10 min，取上清进行蛋
白浓度的测定。酶活力定义为在 25℃，pH7.8 条件
下，每分钟催化 1 μmol 草酰乙酸生成所需要的酶量。
反 应 总 体 系 为 1 mL ：100 mmol/L Tricine（pH7.8），
10 mmol/L pyruvate，10 mmol/L HCO3-，2.5 mmol/L
MgATP，2.5 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L acetyl-CoA。
1.2.8 重组毕赤酵母摇瓶发酵生产草酰乙酸及苹果
酸 将重组菌及对照菌按照 1% 接种量分别接入 100
mL Basal Salts（NH4H2PO4 50 g/L，CaSO4 0.93 g/L，
K2SO4 18.2 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，KOH 3 g/L，
葡萄糖 50 g/L，KH2PO4 5 g/L）培养基中，摇瓶发酵
120 h，每 24 h 取一次样，检测重组菌生物量（OD600）
的变化。并用 HPLC 分析检测草酰乙酸和苹果酸产
量的变化，检测条件 ：有机酸柱（Hewlett-Packard
1050 series，Hewlett-Packard，Waldbrom，Germany ；
ion-exclusion column HPX-87H，300×7.8 nm，
Biorad，Munich，Germany），流动相 5 mmol/L 的硫酸，
流速为 0.2 mL/min[11]。富马酸出峰时间为 14 min，苹
果酸出峰时间 5 min，草酰乙酸出峰时间 3 min，乙
醇出峰时间 2.5 min。
2 结果
2.1 丙酮酸羧化酶胞质同工酶（PC）基因的扩增
毕 赤 酵 母 GS115 丙 酮 酸 羧 化 酶 胞 质 同 工
酶（PC） 基 因 大 小 为 3 524 bp（GenBank 登 录 号
XM_002492148）。如图 1 所示，箭头所指条带大小
为 3 500 bp 左右的目的片段，经测序验证与模板序
列一致，无碱基突变和移码突变。
2.2 表达载体pPIC3.5K-PC的构建和鉴定
构建的表达载体 pPIC3.5K-PC 图谱如图 2 所示，
在原始载体 pPIC3.5K 克隆位点上插入丙酮酸羧化酶
基因（PC），使用 AOX1 启动子强化表达 PC 蛋白。
通过菌落 PCR 初筛得到阳性克隆，提取质粒进行酶
切鉴定，并通过测序比对，目的片段 PC 正确插入
到载体的 BamH 和 Not 之间，从而成功构建了表
达载体 pPIC3.5K-PC。
2.3 His+Mut+表型重组子的筛选和PCR分析鉴定
质 粒 pPIC3.5K-PC 和 pPIC3.5K 经 Sal Ⅰ 内 切
酶线性化之后分别转化毕赤酵母 GS115 感受态细
胞。pPIC3.5K-PC 转 化 子 经 固 体 MD、MM 平 板 筛
选得到 30 株具有 His + Mut +表型菌株，再通过不同
浓度的抗生素 G418 筛选，在含有 3.0 g/L 遗传霉素
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期178
G418 的 YPD 平板上得到了 2 个克隆。高抗性的 Mut +
表型通常含有外源基因的拷贝数 7-12 个，而且毕
赤酵母表达系统中多拷贝外源基因的存在也被证实
能提高外源蛋白的表达量 [12]。以其中一个高抗性转
化子（命名为 pas-01）的基因组 DNA 为模板，用
5′AOX 和 3AOX 引物对进行 PCR 扩增。结果（图
3）显示，以质粒 pPIC3.5K 为模板得到 220 bp 片段，
pPIC3.5K-PC 得到 3 744 bp（包含 PC 和 220 bp 的片
段）；阳性重组子得到 2 200 bp 和 3 744 bp 两个片段，
对照菌（pPIC3.5K 转化子）得到 2 200 bp 及 220 bp
的片段，GS115 得到一条 2 200 bp 的片段，表明丙
酮酸羧化酶胞质同工酶基因（PC）已经整合到毕赤
酵母的染色体上。
M.1 kb plus DNA Marker ；1.PCR 扩增产物
图 1 PCR 扩增丙酮酸羧化酶胞质同工酶（PC）基因
5AOX1: 启动子片段；3AOX1（TT）：转录终止片段；His4 ORF：筛选标记；
PC 插入 5AOX1 与 3AOX1（TT）之间 ；Kanamycin ：多拷贝筛选标记
图 2 pPIC3.5K-PC 表达质粒的构建
上样量 5μL，M.Hind III DNA Marker；1, 7. 质粒 pPIC3.5K 为模板扩增产物；
2-6. 分别以对照菌、GS115、阳性重组子、ddH2O、pPIC3.5K-PC 为模
板的 PCR 扩增产物
图 3 毕赤酵母重组子的 PCR 分析
2.4 重组毕赤酵母（pas-01）丙酮酸羧化酶胞质同
工酶（PC）的诱导表达及SDS-PAGE分析
挑取阳性重组菌（pas-01）及对照菌（pPIC3.5K
转 化 菌 ）， 用 0.5% 甲 醇 连 续 诱 导 表 达 120 h， 经
SDS-PAGE 分析确定丙酮酸羧化酶胞质同工酶（PC）
的最佳表达时间为 36 h（结果未标出），取甲醇诱
导 36 h 时的重组菌和对照菌的重组蛋白进行 SDS-
PAGE。结果（图 4）显示，PC 的大小为 120 kD（箭
头所指）重组菌与对照菌相比蛋白条带更浓，而且
非常明显，说明重组菌表达 PC 的能力比对照菌强，
PC 在重组菌中成功表达。
每个泳道上样量 2.9 μg，M. 蛋白 Marker ；1，2. 对照菌的胞
内蛋白 ；3，4. 阳性重组菌的胞内蛋白
图 4 重组毕赤酵母的 SDS-PAGE 分析
2.5 PC的活性检测
重 组 菌 甲 醇 诱 导 培 养 36 h 之 后， 收 集 菌 体
测 定 胞 内 PC 的 酶 活， 结 果 见 表 1，PC 比 酶 活 从
2011年第12期 179
0.32 μmol/min/mg protein 提 高 到 了 0.92 μmol/min/mg
protein，提高了 3 倍，说明 PC 在重组菌细胞中获得
了正确表达。表 1 列举了目前报道的一些微生物细
胞中 PC 的酶活，比较发现这些 PC 的酶活普遍较低，
而米根霉中此酶的活性具有相对较高的水平，达到
了 12 μmol/min/mg protein，但相比之下重组菌 pas-01
的 PC 酶活也达到了较高的水平，在原始菌基础上
提高了 3 倍。
2.6 重组菌（pas-01）发酵生产草酰乙酸及L-苹
果酸
重组菌（pas-01）摇瓶发酵过程中的生长情况
如图 5 所示，当重组菌生长达到稳定期以后，生物
量相比对照菌提高了 15.76%，特别在诱导培养 48 h
时，残糖消耗殆尽，重组菌生物量达到最大值，此
后生长趋于平稳，而对照菌生长 96 h 时达到稳定，
诱导培养 84 h 之后对照菌开始出现下降趋势，重组
菌的生长情况仍然相对稳定，说明 PC 的过表达在
一定程度上促进了菌体的生长。
菌株 PC 酶活(mmol/min/mg protein)
S.cerevisiae RWB525[6] 0.24±0.02
S.cerevisiae wild-type[13] 0.02±0.00
Rhizopus arrhizus[14] 12.00-15.00
Rhodopseudomonas spheroides[15] 0.54±0.01
P.pastoris recombinants（this study，pPIC3.5K-PC） 0.92±0.06
P.pastoris recombinants（this study，pPIC3.5K） 0.32±0.05
表 1 丙酮酸羧化酶胞质同工酶（PC）酶活的测定
重组菌（pas-01）草酰乙酸及 L- 苹果酸的代谢
情况见图 6，重组菌在 48 h 左右草酰乙酸产量达到
最大值 177.4 mg/L，对照菌最大值出现在 70 h 左右
的时间点，达到 82.24 mg/L，产量提高了 2 倍多，出
现这一差别的原因可能是重组菌（pas-01）PC 基因
在 48 h 左右表达量最高，所以草酰乙酸此时产量最
高。乙醇、乳酸等副产物的代谢如图 7 所示，乳酸
发酵 48 h 时产量最高，对照菌达到 582.5 mg/L，重
组菌乳酸的产量相对较低，减少了 19.88% ；重组菌
及对照菌的乙醇随发酵时间呈不断增长的趋势，发
酵 120 h 之后对照菌乙醇产量达到 5 315.7 mg/L，相
对而言重组菌只有 4 248.63 mg/L，减少了 20.07% ；
重组菌在发酵 90 h 左右，L-苹果酸产量达到最高
127.45 mg/L，与对照相比提高了 31.75 mg/L。通过
图 6 重组菌发酵过程草酰乙酸（OAA）、L- 苹果
酸（L-MA）、富马酸（FA）代谢曲线
吴世根等 ：丙酮酸羧化酶基因的过量表达对富马酸代谢的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期180
这些数据的对比（表 2），可以看出，PC 基因的过
量表达不仅有助于菌体的生长，而且也有助于提高
草酰乙酸及 L- 苹果酸产量。
表 2 丙酮酸主要代谢物的产量对比
累具有非常重要的作用，不仅可以提高 PC 在丙酮
酸竞争中的竞争力，而且在一定程度上也可以促进
菌体的生长。强化表达 PC 基因是提高草酰乙酸和 L-
苹果酸产量的有效策略，它对 L-苹果酸基因工程菌
的构建具有重要的指导作用和帮助。
参 考 文 献
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3 讨论
丙酮酸羧化酶（PC）在毕赤酵母中强化表达之
后，菌体的生物量提高了 15.7%，可能是因为 PC 不
仅参与了 TCA 还原途径，而且 PC 对糖异生途径也
具有非常重要的作用，尤其在发酵中后期，PC 催化
生成的草酰乙酸一方面流向 TCA 还原途径，另一方
面草酰乙酸及 L- 苹果酸通过其自身的转运机制可以
进入线粒体参与 TCA 循环 [16]，为菌体的生长提供
ATP 及一些生长所需要的中间代谢物，从而促进菌
体的生长。丙酮酸的代谢通路主要去向包括 TCA 循
环、TCA 还原途径、乙酸、乳酸、乙醇等途径，试
验中重组菌和对照菌的发酵液中都几乎检测不到乙
酸的产量，副产物乳酸和乙醇的产量明显减少，减
少量分别达到 19.88% 和 20.07%，充分说明碳流的
分配已发生了改变，而生物量出现的明显变化则合
理解释碳源的主要去向。草酰乙酸、苹果酸及富马
酸为代表的 TCA 还原途径相应有一些增加，说明
PC 的过量表达把一部分的碳流引向了 TCA 还原途
径，但是草酰乙酸、苹果酸及富马酸都有相应的转
运机制，可以进入线粒体参与 TCA 循环，所以导致
TCA 循环的加强，从而使生物量得到较为明显的提
高。因此，PC 过量表达之后草酰乙酸和 L-苹果酸产
酸量及生物量获得了较大地提高。
草酰乙酸和 L-苹果酸作为重要的中间代谢物，
需要参与诸多代谢反应，要实现积累需要大量的研
究工作，如阻断副产物乙醇、乳酸等代谢通路，使
得碳源更集中地流向 TCA 循环及其还原途径，从而
提高草酰乙酸和 L-苹果酸产酸量。
4 结论
丙酮酸羧化酶（PC）的过量表达对有机酸的积 （下转第 198 页）
有机酸 pas-01(mg/L) Control(mg/L) Variation(%)
OAA 177.4 82.24 109.6
L-MA 127.45 95.7 33.7
FA 40.05 38.71 0
LA 466.67 582.5 -19.88
Ethanol 4 248.63 5 315.72 -20.07
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期198
参 考 文 献
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