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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):243-250
采用动物细胞培养技术生产流感疫苗，是将病
毒适应到传代细胞，并在生物反应器中大规模进行
病毒繁殖以实现流感疫苗的规模化生产。目前，这
种工艺已经逐步取代传统鸡胚培养技术，成为流感
疫苗生产的主流工艺。然而，相对于日益增长的全
球流感疫苗需求，这种生产工艺产能相对低下，因
此提高工艺效率的研究工作势在必行。近年来，应
用于提高产率的手段多种多样，主要涉及营养调节
（维持培养基优化、流加、灌注等）［1-4］、基因改造［5-7］
和感染参数调整［感染复数（Multiplicity of infection，
MOI）、感染时间（Time of infection，TOI）等］［8］等
几个方面。
收稿日期 ：2015-07-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21206040，21406066），国家“863”计划（2012AA02A303），国家重大专项（2013ZX10004003-003-
003），中央高校基本科研业务费（WF1214035）
作者简介 ：黄锭，男，博士，研究方向 ：动物细胞与组织工程 ；E-mail ：huang-ding@139.com
通讯作者 ：刘旭平，E-mail ：xupingliu@ecust.edu.cn ；谭文松，E-mail ：wstan@ecust.edu.cn
感染时间对 MDCK 细胞中 H1N1 甲型流感病毒
扩增过程的影响
黄锭1  刘旭平1  范里1  赵亮1  谭文松1  陈则2
（1. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237 ；2. 上海生物制品研究所有限责任公司分子病毒研究室，上海 200052）
摘 要 ： 为了研究感染时间 TOI 对 MDCK 细胞中 H1N1 甲型流感病毒扩增过程的影响，以期合理优化以 MDCK 细胞培养技
术为基础的 H1N1 流感病毒生产工艺，从而提高其生产效率。在不同 TOI 条件下以 H1N1 流感病毒感染 MDCK 细胞，考察 TOI 对
MDCK 细胞生长与代谢动力学以及 H1N1 流感病毒扩增过程的影响。结果表明，当 TOI 为 72 h 时，H1N1 流感病毒产量最高。然
而单位细胞病毒产率却随 TOI 增大而呈现下降趋势，进一步剖析 TOI 与感染时细胞密度 CCI 对单位细胞病毒产率的影响可知，该
现象是由细胞状态而非高细胞密度所致。上述研究揭示了由 TOI 不同导致的细胞状态差异对 MDCK 细胞中 H1N1 流感病毒生产效
率的重要性。
关键词 ： 感染时间 ；流感病毒 ；MDCK 细胞
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.032
Effects of TOI on H1N1 Virus Propagation in MDCK Cell Culture
Huang Ding1 Liu Xuping1 Fan Li1 Zhao Liang1 Tan Wensong1 Chen Ze2
（1. State Key Lab of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237 ；2. Laboratory of Molecular
Virology，Shanghai Institute of Biological Products Co.，Ltd.，Shanghai 200052）
Abstract: In order to improve the production efficiency of influenza vaccine in processes based on MDCK cell culture, the effects of TOI
on influenza A（H1N1）virus propagation in MDCK cells were investigated. By infecting MDCK cells with H1N1 influenza virus at different
TOI, the characteristics of MDCK growth and metabolism and influenza A（H1N1）virus were studied. The results showed that maximum
influenza A（H1N1）virus yield reached when TOI was 72 h. However, the cell specific virus yield was reduced as TOI increased. To find out
the reason behind this phenomenon, further analysis of TOI and CCI effects on cell specific virus yield were studied. Results showed that, the
phenomenon was caused by cell status rather than high cell density. The study reveals the importance of cell status difference due to TOI, showed
that influenza A（H1N1）virus production efficiency in MDCK cells could be improved by cell state adjusting.
Key words: TOI ；influenza virus ；MDCK cells
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11244
在基于 MDCK 细胞（Mardin-Darby kidney cells，
MDCK）培养技术的流感疫苗生产工艺中，MDCK
细胞是流感病毒的宿主细胞，流感病毒在细胞内的
扩增必然会受到感染时的细胞生理状态的影响。生
理状态良好的细胞有利于病毒的感染复制，可提高
流感病毒在细胞内的扩增效率，而 TOI 是决定感染
病毒时细胞生理状态的关键因素。因此，TOI 是流
感疫苗生产工艺中一个重要的优化参数。细胞在生
长过程中其生理状态是随时间不断变化的，其生产
病毒的能力也会随之发生相应改变。因此，考察细
胞在何时处于感染复制病毒的最佳生理状态成为一
个关键研究点。当 TOI 较小时，细胞处于对数生长
期时，细胞对应的生理状态较好，此时可能有利于
病毒感染复制。当 TOI 较大，细胞处于衰亡期时，
细胞逐渐死亡，这对于病毒扩增过程可能造成不利
影响［1，9-12］。然而，目前的研究工作大多仅涉及最
适合 TOI 的选择，而鲜见 TOI 对细胞生长、代谢与
流感病毒扩增过程影响的研究［8，13］。因此，深入研
究 TOI 对 MDCK 细胞生产流感病毒过程的影响机制，
对于流感疫苗工艺的开发与优化具有重要的意义。
本研究通过以 H1N1 流感病毒于不同 TOI 条件
下感染 MDCK 细胞的方法，研究 TOI 对 MDCK 细胞
生长、代谢以及流感病毒扩增过程的影响，以期能
够揭示 TOI 对 MDCK 细胞培养中流感病毒生产过程
的作用机制，为基于动物细胞培养技术的流感疫苗
生产工艺的开发与优化工作提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株与培养基 本实验所用的细胞株为犬
肾上皮连续细胞系 MDCK 细胞，购自 ATCC。细胞
培养所用培养基补加 10%（V/V）胎牛血清（购自
美国 Gibco 公司）和 3 700 mg/L 碳酸氢钠（购自美
国 Sigma-Aldrich 公司）的 DMEM 培养基（购自美
国 Gibco 公司）。流感病毒生产阶段所用维持培养基
为添加 5 mg/L 经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）
处理的胰蛋白酶（购自美国 Sigma-Aldrich 公司）的
DMEM 培养基。
1.1.2 病 毒 株 WHO 推 荐 的 甲 型 流 感 病 毒 株
A/California/7/2009（H1N1）X-179A， 购 于 英 国 国
家生物标准与检定所（National Institute for Biological
Standards and Control，NIBSC）。该病毒为以模式甲
型流感 A/PR8/34 病毒株为骨架，含 2009 年流行的
猪流感病毒抗原蛋白基因的重组病毒株。病毒原液
为在 SPF 鸡胚中收获的尿囊液，其半组织感染滴度
TCID50 值为 5.62×10
8 TCID50/mL。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 种子细胞用方瓶贴壁培养，待种
子细胞足够时于搅拌瓶中以微载体悬浮培养进行接
毒实验。方瓶培养 ：从细胞库中复苏 MDCK 细胞，
以 4×104-5×104 cells/cm2 细胞密度接种于方瓶（购
自美国 Corning 公司）中，置于 37℃、5% CO2 的培
养箱中培养，作为实验用的种子细胞。待 MDCK 细
胞生长至铺满方瓶底部约 80%-90% 后，去掉培养液，
用不含钙镁的无菌磷酸缓冲液（Phosphate buffered
saline，PBS）（0.2 mL/cm2）漂洗细胞 ；然后于室温
下用含 0.25%（W/V）胰蛋白酶（购自 Gibco 公司）
和 0.05%（W/V）EDTA（Ethylene diamine tetraacetic
acid，EDTA）（购自 Sigma-Aldrich 公司）的无菌消
化液（0.2 mL/cm2）消化细胞 30-60 s ；弃消化液后，
置于 5% CO2、饱和湿度的培养箱 37℃孵育至细胞
收缩变圆，轻摇方瓶细胞即可脱落 ；加入新鲜培养
基轻柔吹打均匀后传代，接种密度为 4×104-5×104
cells/cm2。
微载体搅拌瓶培养 ：微载体 CytodexTM 1（购自
美国 GE-Healthcare 公司）用 PBS 浸泡 3 次，每次浸
泡 30 min，灭菌后待用。接种 MDCK 细胞至装有微
载体的无菌 500 mL 搅拌瓶（购自美国 Corning 公司）
中，接种细胞密度为 2×105-3×105 cells/mL，微载
体用量为 2 g/L，培养液体积为 200 mL。置于 37℃、5%
CO2 的培养箱中，搅拌瓶转速设为 50 r/mim。
1.2.2 病毒感染 细胞培养至实验既定时间（TOI，
视具体实验设计而定），去除上清，以等培养体积的
PBS 洗涤细胞两次以除去残留血清蛋白及抑制性代
谢物，加入等体积含病毒原液（MOI=0.01，以病毒
原液 TCID50 值为依据
［14］）和维持培养基继续孵育。
1.2.3 MOI 确定方法 根据刘鹏等［15-17］的方法，以
不同 MOI（1、0.01、0.001、0.000 1 和 0.000 01）接
种病毒原液感染以微载体培养生长良好的 MDCK 细
2015,31(11) 245黄锭等 ：感染时间对 MDCK 细胞中 H1N1 甲型流感病毒扩增过程的影响
胞，血凝滴度实验（Hemagglutination assay，HA）结
果显示 MOI 为 0.01 时病毒 HA 滴度最高，表明接种
剂量选择 MOI=0.01 为最佳，故本实验 MOI 采用 0.01。
1.2.4 取样及样品处理 培养过程中每 12 h 取样，
计数细胞。培养悬液经 300×g 离心 10 min 后取上
清于 -20℃保存，用于检测营养物和代谢副产物浓度。
上清存 -80℃用于测定流感病毒血凝滴度。
1.2.5 细胞计数 传代时细胞经消化后以台盼蓝拒
染法计数。具体来说，培养好的贴壁细胞消化后，
用新鲜的培养基将细胞按一定比例制成细胞悬液。
以 0.5 mL 加入 24 孔板一孔中，加入 0.5 mL 0.4% 台
盼蓝染液，染色 2-3 min 后吸取少许悬液涂于血球
计数板上，加上盖玻片，镜下对每个视野分别计死
细胞和活细胞数。微载体培养的细胞以结晶紫染核
法计数。其方法为，取 1 mL 含铺有细胞的微载体
的培养液，沉降弃上清，以不含钙镁的磷酸缓冲液
（Phosphate buffered saline，PBS） 洗 涤 一 遍， 去 除
上清，加入与上清等体积的结晶紫裂解染色液，摇
床上 37℃孵育 4 h。经处理，微载体上细胞被裂解，
细胞核释放到上清中并被结晶紫染色。将此悬液吹
打均匀后用 PBS 缓冲液以适当倍数稀释，用血球计
数板计数细胞核即为活细胞数。计数所需试剂均购
自 Sigma-Aldrich 公司。
1.2.6 营养物及代谢副产物浓度测定 培养液中营
养物葡萄糖、谷氨酰胺和代谢副产物乳酸、氨的浓
度使用生化分析仪 Bioprofile 400 analyzer（购自美国
Nova biomedical 公司）测定。
1.2.7 流感病毒血凝滴度测定 采用血凝滴度实验
HA 试验方法测定。配置鸡红细胞悬液，使悬液中的
红细胞密度控制在 2.0×107 cells/mL 左右。在每个孔
中加入 50 μL 配置好的鸡红细胞悬液，振荡器上振
荡混匀，室温下静置 20-30 min 后，观察其结果［18］。
每个样品同时平行测试 2 遍，结果取平均值。所需
96 孔微量反应板购自 Corning 公司，鸡红细胞由上
海生物制品研究室有限责任公司提供。
1.2.8 计算方法 细胞比生长速率计算 ：
μ= Ln∆tVCD2
VCD1
（1）
其 中，μ ：比 生 长 速 率（h-1），VCD ：活 细 胞 密 度
（cells/mL），t 为时间（h）。
细胞比死亡速率（sdr）（h-1）：Sdr=-μ （2）
代谢速率计算 ：Qi= ∆i/IVCC （3）
其 中，IVCC ：活 细 胞 密 度 对 时 间 的 积 分（109
cells·d/L）；i ：葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸或氨 ；Qi ：
0 到 t 期间物质的比消耗速率或比生产速率 mmol/
（109cells·d）；△ i ：0 到 t 期间 i 物质单位体积的消
耗或生成量（mmol/L）。
计算乳酸对葡萄糖的转化率 Ylac/gluc（mmol/mmol）
及氨对谷氨酰胺的转化率 Yamm/gln（mmol/mmol）：
Ylac/gluc=Qlac/（-Qgluc） （4）
Yamm/gln=Qamm/（-Qgln） （5）
单位细胞病毒产率（svy）的计算［19］：
svy=
∑Ni=1Vi·RBC×10×αHAi
WV×Xv
（6）
式 中 ：Vi ：收 获 病 毒 时 的 体 积（mL），RBC（Red
blood cell）：红细胞密度（cells/mL），WV（Working
volume）：工作体积（mL），Xv ：受感染的活细胞密
度（cells/mL），αHAi：血凝值检测最高的 HA 效价（HA
units/50 μL）。
2 结果
2.1 TOI对感染H1N1流感病毒后MDCK细胞生长
的影响
将 MDCK 细 胞 培 养 至 24、48、60、72、84 和
96 h 后感染 H1N1 流感病毒（即 TOI 分别为 24、48、
60、72、84 和 96 h），考察 TOI 对感染 H1N1 流感病
毒后 MDCK 细胞生长的影响，结果如图 1 所示。
各 TOI 条件下，感染时活细胞密度 CCI（Cell
concentration at infection，CCI）为（1.49±0.04）×106
c e l l s / m L 、（ 3 . 0 1 ± 0 . 2 0 ） × 1 0 6 c e l l s / m L 、
（4.28±0.12）×106 cells/mL、（5.19±0.25）×106
c e l l s / m L 、（ 5 . 5 7 ± 0 . 0 1 ） × 1 0 6 c e l l s / m L 和
（5.52±0.13）×106 cells/mL。TOI=24 h 与 TOI=48
h 组在感染后 12 h（12 hpi）内，细胞密度分别增加
（14.61±7.38）% 和（21.57±2.62）%，该阶段比生
长速率均为正值 ；随后细胞密度快速下跌，比生长
速率变为负值，前者细胞密度 60 hpi 跌至 0，后者细
胞密度 72 hpi 跌至 0。TOI=60 h 组 0-24 hpi 细胞密度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11246
缓慢下跌，该阶段平均比生长速率为 -0.003 h-1 ；随
后下跌速度加剧，72 hpi 跌至 0。TOI=84 h 与 96 h 组，
细胞密度自 0 hpi 起便快速下跌，无增长期或缓慢下
跌期。
计 算 0-48 hpi 平 均 死 亡 速 率（ 图 1-C） 可 知，
TOI 小于 60 h 时，细胞比死亡速率随 TOI 增加而减小；
当 TOI 大于 60 h 时，细胞比死亡速率随 TOI 增加而
增加。
0
12
24
36
48
60
0 24 48 72
Time post infection/h
A
TOI=24 h TOI=48 h
TOI=60 h TOI=72 h
TOI=84 h TOI=96 h
-0.40
-0.25
-0.10
0.05
0 24 48 72
Time post infection/h
B
TOI=24 h TOI=48 h
TOI=60 h TOI=72 h
TOI=84 h TOI=96 h
V
C
D
/105 cells·mL-1  μ/h-1
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
24 36 48 60 72 84 96
TOI/h
C
Av
g.
sd
r d
ur
in
g
048 hpi/h-1
图 1 不同 TOI 条件下 MDCK 细胞的活细胞密度（A）、比生长速率（B）和 0-48 hpi 平均比死亡速率（C）
2.2 TOI对感染H1N1流感病毒后MDCK细胞代谢
的影响
同 时， 本 实 验 也 考 察 了 TOI 对 感 染 H1N1 流
感病毒后 MDCK 细胞代谢的影响，结果如图 2 所
示。TOI 小于 60 h 时，葡萄糖比消耗速率（-Qgluc）
随 TOI 增加而大幅下跌 ；TOI 小于 60 h 时，-Qgluc 随
TOI 变化幅度减小。TOI 小于 48 h 时，谷氨酰胺的
比消耗速率（-Qgln）随 TOI 增加大幅下跌 ；TOI 大于
48 h 时，-Qgln 变化幅度较小。对于乳酸和氨这两种
代谢产物，TOI 小于 72 h 时生成速率（Qlac 和 Qamm）
随 TOI 增加而大幅下跌 ；TOI 大于 72 h，Qlac 和 Qamm
代谢速率很小。
另外，计算乳酸对葡萄糖的转化率（Qlac/（-Qgluc））
与氨对谷氨酰胺的转化率（Qamm/（-Qgln）），结果表
明， 随 着 TOI 增 大，Qlac/（-Qgluc） 逐 渐 增 大， 而
Qamm/（-Qgln）逐渐减小（图 2-B）。
2.3 TOI对MDCK细胞中H1N1流感病毒扩增过程
的影响
TOI 对 H1N1 流感病毒在 MDCK 细胞中扩增过
程的影响如图 3 所示。图 3-A 和 3-B 显示，TOI=24
h 组 HA 滴度至 24 hpi 达到 2.56×10
2 HA units/50 μL，
随 后 至 48 hpi 达 峰 值 6.09×10
2 HA units/50 μL，72
hpi 时略有下降 ；TOI 设为 48 h，至 24 hpi 病毒 HA 滴
度仅为 1.28×102 HA units/50 μL，48 hpi 达到最大值
7.24×102 HA units/50 μL，72 hpi 时下跌；TOI 为 60 h，
24 hpi 时 HA 滴度为（3.84±1.81）×10
2 HA units/50
μL，48 hpi 达最大值（8.74±2.12）×10
2 HA units/50
μL，72 hpi 下 降 ；TOI 为 72 h，24 hpi 时 HA 滴 度 为
5.12×102 HA units/50 μL，48 hpi 达最大值 1.02×10
3
HA units/50 μL，72 hpi 略 降 ；TOI 为 84 h 和 96 h，
HA 滴 度 亦 于 48 hpi 达 最 大 值， 但 最 大 值 均 低 于
TOI=72 h 组。进一步计算（图 3-C）得知，单位细
2015,31(11) 247黄锭等 ：感染时间对 MDCK 细胞中 H1N1 甲型流感病毒扩增过程的影响
胞病毒产率 svy 随 TOI 增大而降低。而且，TOI=72 h
时获得的 HA 滴度最高，svy 却并非最高。随着 TOI
增加，感染前细胞密度 CCI 呈上升趋势，而对应 svy
则呈下降趋势（图 3-C）。
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
3
6
9
12
15
24 36 48 60 72 84 96
TOI/h
A
-Qgluc
-Qgln
Qlac
Qamm
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
24 36 48 60 72 84 96
TOI/h
B
-Q
gl
c&
Q
la
c
/mmol·109 cells-1 ·day-1 
-Q
gl
n&
Q
am
m
/mmol·109 cells-1 ·day-1 
Q
la
c/-Q gluc&Q amm/-Q gln Qlac/-Qgluc
Qamm/-Qgln
图 2 不同 TOI 条件下 MDCK 代谢速率（A）及葡萄糖和谷氨酰胺转化效率（B）
TOI=60 h
TOI=96 h
TOI=48 h
TOI=84 h
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
0 24 48 72
Time post infection/h
A TOI=24 h
TOI=72 h
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
24 48 60 72 84 96
TOI/h
B
0
15
30
45
60
0
4
8
12
16
24 48 60 72 84 96
TOI/h
C
svy
CCI
H
A
ti
te
r/103 HA units·50 μL-1 
M
ax
. H
A
ti
te
r/103 HA·50 μL-1 
C
C
I/105 cells·mL-1 
Sv
y/
103 virions·cells-1 
图 3 不同 TOI 条件下 MDCK 中 H1N1 流感病毒滴度随时间变化（A）、最大滴度（B）和单位细胞病毒产率（C）
2.4 不同TOI条件下CCI对单位细胞病毒产率的
影响
据上述图 3-C 结果，有必要进一步考察 TOI、
CCI 与 svy 的 关 系。 本 实 验 将 取 自 不 同 培 养 时 间
（TOI=24、36、48、60 和 72 h） 的 细 胞 浓 缩 或 稀
释至不同细胞密度梯度，即每个 TOI 条件下设置
1×106-5×106 cells/mL 5 个细胞密度梯度，考察各
实验组 svy 值。图 4 显示，当 TOI 相同时，不同 CCI
条件下 svy 值基本不变 ；而当 CCI 相同时，svy 随
TOI 增加而降低。
3 讨论
近年来，全世界对流感疫苗的需求量在飞速增
长。相较之下，以动物细胞培养方法为基础的流感
病毒疫苗生产工艺的产能则相对低下，成为制约这
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11248
不同 TOI 条件下，感染前细胞维持培养的时间长短
不一，从而导致细胞密度不同、营养物的消耗量和
代谢副产物的累积量不同。另外不容忽视的一点，
不同 TOI 条件下感染流感病毒后 MDCK 细胞对乳酸
对葡萄糖的转化率和氨对谷氨酰胺的转化效率也会
有很大差别。Qlac/（-Qgluc）随 TOI 设定值的增加而增
大，表明随着 TOI 的增大，进入三羧酸循环（Trica-
rboxylic acid cycle，TCA） 的 Gluc 减 少，Gluc 的 产
能效率降低 ；而 Qamm/（-Qgln）逐渐减小，表明随着
TOI 的增大，进入 TCA 的 Gln 增多，Gln 的产能效
率提高［25］。如前所述，培养后期细胞变得脆弱甚至
出现凋亡，并且病毒扩增过程也会导致细胞凋亡。
而凋亡过程会致使线粒体膜通透性增加，出现能量
缺陷［26］，需要更多的 Gluc 进入糖酵解来补充能量［27］，
同时生成乳酸［25］。与此同时，更多的 Gln 进入回补
TCA 途径，待 Gln 耗竭，便会诱导谷氨酰胺合酶活性，
通过谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，从而导致 Qamm/（-
Qgln）逐渐减小
［25］。另外，氨气通过培养基挥发逃逸
可能也是原因之一。综上分析，MDCK 细胞的生长
状态、代谢速率及代谢效率均有很大差别，表明不
同 TOI 条件下 MDCK 细胞的状态也会有很大差别。
另外，通过考察 TOI 对流感病毒扩增过程的
影响发现，TOI 不同，则病毒的产量和单位细胞病
毒产率也会有很大差别。更值得注意的一点，在此
实验条件下 CCI 越高 svy 越低，这与文献中提到的
“细胞密度效应”极为相似［19，28］。但经进一步研究
TOI、CCI、svy 三者之间的关系可知，当保持 TOI
不变时，这种“细胞密度效应”则不复存在。换言
之，svy 高低更大程度上取决于 TOI 值的大小。纵观
全文研究结果，TOI 之所以能对 MDCK 细胞中 H1N1
流感病毒扩增过程产生显著影响，其根源在于不同
TOI 条件下细胞自身状态有很大差别［21］。据此，在
今后的工艺开发工作中，可以不再受限于 TOI，而
通过人为合理调控细胞状态的手段来提高流感病毒
生产效率。但细胞状态变化所包含的因素错综复
杂，而且目前对其界定也尚未十分明确。TOI 不同
可能会导致细胞表面病毒受体、细胞周期分布、细
胞凋亡、信号转导机制、营养组分浓度、代谢毒物
积累程度以及其它未知微环境等众多因素发生变
化［3，13，19，29］，这些都有待进一步详细考察。
0
3
6
9
12
15
18
1 2 3 4 5
TOI=24 h TOI=36 h TOI=48 h
TOI=60 h TOI=72 h
Sv
y/
103 virions·cells-1 
CCI106 cell/mL
图 4 不同 TOI 与 CCI 条件下 MDCK 细胞中单位细胞病
毒产率
种新兴工艺发展的一个瓶颈因素［20］。因此，提高生
产效率一直是该类工艺开发与优化工作的重点。在
众多的考察因素中，感染参数 TOI 是一个重要考察
对象。然而，目前工作大多仅涉及最适合 TOI 值的
选择［13，21］，而少有研究 TOI 值对工艺过程影响机
制。据此，本研究通过设置不同 TOI 条件，研究了
其对细胞生长、代谢与流感病毒扩增过程影响，以
及 TOI、CCI 与 svy 之间的关系。
首先，考察了 TOI 的设定值对被流感病毒感染
后的 MDCK 细胞的生长和代谢的影响。通过上述研
究结果可以发现，TOI 的设定值会影响细胞死亡速
率，TOI 值过小或过大均会使被 H1N1 流感病毒感
染的 MDCK 细胞死亡速率加快。推测其原因可能为：
当 TOI 过小时，细胞密度较小，细胞之间结合比较
疏松，且细胞伸展到微载体表面，导致细胞体积大，
表面积大［22］，因而更容易被病毒感染脱落死亡或被
TPCK- 胰酶影响［23，24］；相反，TOI 过大，细胞衰老，
代谢废物累积等原因造成细胞很脆弱，甚至出现凋
亡，同时病毒感染又会加剧凋亡过程，所以细胞死
亡速率快。同时，TOI 设定值不同，也会导致细胞
代谢速率出现很大差异。结果表明，被感染后的细
胞的对 Gluc、Gln、Lac 和 Amm 等物质的代谢速率
会随着 TOI 值的增大而减缓。在细胞生长过程中，
细胞之间相互作用，胞内各种代谢相关的酶活均会
不断变化［22，25］，最终导致不同 TOI 条件下细胞对各
种营养代谢物的代谢速率不同。综合这两方面结果，
2015,31(11) 249黄锭等 ：感染时间对 MDCK 细胞中 H1N1 甲型流感病毒扩增过程的影响
4 结论
在 不 同 TOI 条 件 下 以 H1N1 流 感 病 毒 感 染
MDCK 细胞，考察 TOI 对 MDCK 细胞生长与代谢动
力学以及 H1N1 流感病毒扩增过程的影响。结果表
明，虽将 TOI 设置为 72 h 时 H1N1 流感病毒产量最
高，但 svy 却随 TOI 增大而呈现下降趋势。继而考
察 TOI、CCI 与 svy 三者之间关系可知，该现象是
由 TOI 不同所引起的细胞状态改变所致，而非仅由
高细胞密度导致。该研究揭示了由 TOI 不同导致的
细胞状态差异对 MDCK 细胞中 H1N1 流感病毒生产
效率的重要性，表明有望通过调整细胞状态的手段
优化动物细胞培养生产流感疫苗的工艺以提高生产
效率。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）