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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
由于耐药菌感染问题日益严重，开发新型抗菌
药物迫在眉睫。抗菌肽 SMAP-29 是来源于绵羊骨髓
的含 29 个氨基酸残基的 Cathelicidin 类抗菌肽［1］，
具有高效、广谱的抗细菌［2-5］、抗真菌活性［6］，尤
其对于一些耐药菌具有很强的杀灭活性［7］，是一种
较具开发应用潜力的抗感染肽。
直接从绵羊骨髓组织中提取并纯化天然抗菌肽
产量有限，而化学合成抗菌肽成本高，因此通过基
收稿日期 ：2012-09-28
基金项目 ：北京联合大学“启明星”大学生科技创新项目（理 68），北京联合大学校级科研项目（zk201008x）
作者简介 ：郑秋实，女，学士，研究方向 ：生物工程 ；E-mail ：826055785@qq.com
通讯作者 ：陶凤云，女，博士，副教授，研究方向 ：抗菌肽 ；E-mail ：taofengyun @126.com
SMAP-29 抗菌肽的原核表达、纯化及活性检测
郑秋实  段晨曦  陶凤云
（北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）
摘 要 ： 旨在利用基因工程技术表达出有活性的重组 SMAP-29 抗菌肽。根据大肠杆菌偏好的密码子优化 smap-29 基因序
列，在目标肽序列 N 端添加肠激酶识别位点，C 端添加终止密码子，化学合成基因序列，通过 EcoR I 和 Hind III 双酶切位点连接
到 pET-28a（+）上构建重组表达载体，在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达重组蛋白，Ni-NTA 亲和层析纯化，肠激酶切割后释放出
SMAP-29 抗菌肽，检测其抗菌活性。结果显示，带有 6×His 标签及肠激酶识别位点的 SMAP-29 重组融合蛋白在大肠杆菌中以包
涵体形式表达，利用 Ni-NTA 亲和层析可获得纯化的融合蛋白，肠激酶切割后释放出的 SMAP-29 重组抗菌肽对大肠杆菌、金黄色
葡萄球菌和白念珠菌的最小抑菌浓度依次为 10、20 和 40 μmol/L。
关键词 ： 抗菌肽 SMAP-29 原核表达 抗菌活性
Recombinant Expression，Purification and Antimicrobial Activity of
SMAP-29
Zheng Qiushi Duan Chenxi Tao Fengyun
（Biochemical Engineering College of Beijing Union University，Beijing 100023）
Abstract:  It was to express active recombination SMAP-29 antibacterial peptides by genetic engineering technology. Optimization smap-
29 gene sequences according to Escherichia coli preference codon usage and adding enterokinase recognition sites at N-terminus and stop
codon at C-terminus of the target peptide sequence. The DNA sequence was synthesized by chemical technology and inserted into the pET-28a
（+）expression vector through the EcoR I and Hind III sites. Recombinant protein was expressed in Escherichia coli BL21（DE3）harboring
pET28a-smap29 recombinant vector by IPTG induced, and purified by Ni-NTA affinity chromatography. SMAP-29 peptide was released by
enterokinase cleavage of the fusion protein and its antibacterial activity was detected. Results showed SMAP-29 recombinant fusion protein with
6×His tag and enterokinase recognition sites was expressed in inclusion body form, and the fusion protein can by purified by Ni-NTA affinity
chromatography. SMAP-29 peptide was released from fusion protein by enterokinase cleavaging. The minimum inhibition concentration（MIC）
of SMAP-29 against E. coli, S. aureus and C. albicans was 10, 20 and 40 μmol/L, respectively.
Key words:  Antimicrobial peptide SMAP-29 Prokaryotic expression Antimicrobial activity
因工程表达重组抗菌肽成为主要的手段。Morassuttia
等［8］以内含子介导的方式在大肠杆菌中融合表达
了 SMAP-29，结果显示重组肽较化学合成分子的抗
菌活性弱。任耀军等［9］采用毕赤酵母偏好密码子，
设计合成了 SMAP-29 基因序列，构建了真核表达载
体，诱导表达后在酵母裂解液中检测到抗菌肽表达。
肇晓光等［10］利用 pTYB11 表达载体，在大肠杆菌
BL21（DE3）中表达了融合蛋白，几丁质亲和层析
2013年第3期 145郑秋实等 ：SMAP-29 抗菌肽的原核表达、纯化及活性检测
后获得可溶性 SMAP-29 衍生物。但是由于抗菌肽分
子小、易被蛋白酶降解、表达产物对宿主有害，从
而影响了基因的高水平表达。如何高效低成本地利
用基因工程技术制备抗菌肽，成为其进一步开发和
临床应用急需解决的问题。
pET 表达系统表达效率高，应用广泛，目前尚
无利用该系统表达 SMAP-29 的详细研究报道，本研
究以 pET-28a（+）质粒为基础，在大肠杆菌 BL21
（DE3）中以融合蛋白形式表达重组抗菌肽 SMAP-
29，旨在获得具有天然末端的有生物活性的重组抗
菌肽，为其开发应用奠定物质基础。
1 材料与方法
1.1 材料
表达载体 pET-28a（+）、大肠杆菌 DH5α、BL21
（DE3）、药敏测试大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白
色念珠菌均由北京联合大学生物化学工程学院生物
工程实验室保藏 ；Pfu DNA 聚合酶、DNA 片段纯
化试剂盒均购自北京赛百盛基因技术有限公司 ；T4
DNA 连接酶、限制性内切酶等购自宝生物工程（大
连）有限公司 ；质粒提取试剂盒、琼脂糖胶回收试
剂盒、异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷（IPTG）购自天
根生化科技（北京）有限公司 ；LB 培养基购自美国
BD 公司 ；Ni-NTA Agarose 购自 Qiagen 公司 ；重组肠
激酶购自 Novagen 公司。
1.2 方法
1.2.1 基因优化与合成 为获得具有天然氨基端的
抗菌肽，对 N 端添加了肠激酶切割位点（DDDK）
的 SMAP29 的氨基酸序列肠激酶可在此识别序列 K
的羧基端裂解蛋白，用于完全去除 SMAP-29 天然氨
基端之前的额外序列。反推其 DNA 序列，并根据大
肠杆菌偏好的密码子进行基因序列优化，由生工生
物工程（上海）有限公司人工合成基因序列并克隆
在 pUC57 质粒的 EcoR I 和 Hind III 位点之间，命名
为 pUC57-smap29。
1.2.2 构建重组表达载体 以 pUC57-smap29 为模
板，设计正向引物 5-CCCGAATTCGATGACGATGA-
CAAACGC-3，反向引物 5-GGGCAAGCTTGTCATT-
AACCGGCAATACG-3，下划线依次为 EcoR I 和 Hind
III 限制性内切酶位点，引物由北京赛百盛基因技
术有限公司合成。利用 Pfu DNA 聚合酶高保真扩增
smap-29 基因片段，PCR 反应条件为 ：94℃ 5 min ；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s， 共 30 个 循 环 ；
72℃ 7 min，于 4℃保存备用。获得的 PCR 产物回收
后，将目标基因片段和表达载体 pET-28a（+）同时
分别用 EcoR I 和 Hind III 双酶切，胶回收目标基因
片段和载体线性片段，将二者按摩尔比（5∶1）用
T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜，连接产物转化 E. coli
DH5α 感受态细胞，挑取阳性菌落，筛选重组质粒
pET28a-smap29，送北京三博远志生物技术有限责任
公司测序。
1.2.3 表达与纯化重组蛋白 将测序正确的重组质
粒 pET28a-smap29 转 化 大 肠 杆 菌 BL21（DE3）， 挑
取单菌落于含有卡那霉素（终浓度 50 μg/mL）的 LB
培养基中，37℃、200 r/min 摇床培养至对数生长期
时（OD600=0.6），加入 0.4 mmol/L IPTG 诱导表达 6 h。
通过 15% SDS-PAGE 分析蛋白的表达情况。
对于成功表达出重组蛋白的 BL21（DE3）按 1%
比例接种后扩大培养，IPTG 诱导重组蛋白表达，4℃
离心收集细胞并洗涤后，冰浴超声裂解细胞，高速
离心后分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE，检测重
组蛋白表达形式。收集包涵体并用 1% Triton X-100
洗涤后，用 8 mol/L 尿素溶解，离心收集上清液，透
析过夜后，进行 Ni-NTA 亲和层析，用 60 mmol/L 咪
唑充分洗去杂蛋白后，用 300 mmol/L 咪唑洗脱目
标融合蛋白。将融合蛋白透析后调整浓度至约 100
μg/mL 蛋白浓度，利用肠激酶 37℃水浴 12 h 切除担
体序列，将酶切产物上样进行 Ni-NTA 亲和层析，担
体序列吸附到层析介质上，而目标肽不被吸附。收
集穿柱液，用 RP-HPLC 进一步纯化制备目标肽。肽
浓度和纯度经 Tricine-SDS-PAGE 电泳进行分析。
1.2.4 重组肽的抗菌活性检测 将测试菌平板划线
活化后，接种单菌落于 LB 液体培养基中，37℃摇
床培养过夜 ；次日按照 10% 比例接种于新鲜的液体
培养基中，37℃摇床培养至对数生长中期。离心收
集测试菌，用 pH7.4 的 10 mmol/L PBS 洗菌 3 次，稀
释细菌至 2×106 CFU/mL，分别吸取每株细菌培养物
10 μL 至无菌 EP 管中，将重组肽梯度稀释后，各取
250 μL 分别加入对应的已加入 250 μL PBS 无菌 EP
管中，再从各自管中取出 250 μL 加入到对应的已加
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期146
入菌的 EP 管中，每组重复 3 个管。37℃条件下振
荡培育 8 h，将各管样品分别作不同倍数的稀释，每
个稀释度分别取 100 μL 滴种在 3 个营养琼脂平板上，
37℃温箱培育 18 h，观察并记录每个营养琼脂平板
上的菌落数量，取相同稀释度的 3 个营养琼脂平板
菌落的平均值作为该稀释度样品的菌落数量。计算
抗菌肽浓度与细菌存活率关系的曲线。细菌的存活
率（%）= 存活细菌数 / 阴性对照细菌数 ×100%。
2 结果
2.1 SMAP-29抗菌肽的序列分析
SMAP-29 的氨基酸序列为 ：RGLRRLGRKIAHG-
VKKYGPTVLRIIRIAG，是由29个氨基酸组成的碱性α-
螺旋抗菌肽（抗菌肽数据库 http ：//aps.unmc.edu/ 登
记号 ：AP00155），疏水残基占 37%。ProtParam 软件
的分析结果表明，其分子量为 3 256.0，理论 pI 值为
12.31，含 9 个正电荷氨基酸（Lys+Arg），不含负电
荷氨基酸，总平均亲水值（GRAVY）为 -0.210，脂
肪系数为 121.03，不稳定系数为 26.41，属于稳定型
肽，其空间结构如图 1 所示。
图 1 SMAP-29 结构图
㓸→ᇶ⸱ᆀ Hind III
pET28a-smap29
(5465 bp)
Kan
T7 pro His·Tag EcoRI 㛐◰䞦䇶࡛ᒿࡇ SMAP-29 T7 ter
smap29 经 EcoR I 和 Hind III 双酶切后产生两条带，
图 4 中箭头所指处分别为酶切后的表达载体和目标
基因片段。理论计算可知重组表达载体大小应为 5
465 bp，双酶切大片段应为 5 350 bp，目标基因片段
应为 115 bp，实际条带大小均与计算值相符，初步
表明表达载体构建成功。进一步的 DNA 测序结果证
明 smap-29 基因序列与设计序列一致，与 pET-28a（+）
表达载体连接后读码框正确。
图 2 smap-29 基因表达构建策略
500
bp
M 1
400
300
200
120
bp
150
50
M ：DNA Marker ；1 ：smap-29 基因片段
图 3 smap-29 基因的 PCR 扩增
6000
bp
M 1 2
5000
1000
250
M ：1 kb DNA Marker ；1 ：重组表达质粒 ；2 ：双酶切产物
图 4 重组表达质粒 pET28a-smap29 双酶切
2.2 构建重组表达载体
选择 pET-28a（+）和大肠杆菌 BL21（DE3）系
统融合表达重组蛋白，基因表达策略如图 2 所示。
以 重 组 克 隆 载 体 pUC57-smap29 为 模 板，PCR
扩增出两端分别带有 EcoR I 和 Hind III 限制酶识别
位点的目标基因片段（图 3），大小约为 120 bp，与
预期值相符，表明目标基因片段扩增成功。
对因片段 smap29 与 pET-28a（+）连接，构成
重 组 表 达 载 体 pET28a-smap29。 重 组 质 粒 pET28a-
2013年第3期 147郑秋实等 ：SMAP-29 抗菌肽的原核表达、纯化及活性检测
2.3 融合蛋白的诱导表达
分别将 pET28a-smap29 和空白表达载体转化到
大肠杆菌 BL21（DE3）中，在含有 50 μg/mL 卡那霉
素的 LB 培养基中 37℃振荡培养到 OD600=0.6，加入
终浓度 0.4 mmol/L 的 IPTG 后降低培养温度至 30℃
诱导表达，分别取空载体和重组载体诱导 6 h 后的
细胞，SDS-PAGE 检测融合蛋白表达情况。如图 5
中箭头所指，诱导后的细胞总蛋白中新增一蛋白条
带，其分子量低于 8 kD，与预期融合蛋白的分子量
相符，表明融合蛋白得到表达。
2.4 融合蛋白的纯化、肠激酶切割与纯化重组肽
SMAP-29
按照 2.3 条件扩大培养含 pET28a-smap29 重组
质粒的大肠杆菌 BL21（DE3），诱导表达后，冰浴
超声裂解细胞，高速离心后分别取上清和沉淀进行
SDS-PAGE 检测，发现重组蛋白主要以包涵体形式
存在于破碎沉淀中。提取的包涵体经过复性并透析
后，进行 Ni-NTA 亲和层析，由于融合蛋白带有 His-
Tag 标签，可吸附到层析介质上。经咪唑洗脱融合
蛋白，结果（图 6）显示，得到分子量约为 8 kD 的
融合蛋白，经肠激酶裂解后，释放出分子量约 4.4
kD 和 3 kD 的两个肽段，与理论计算的担体蛋白和
目标肽大小相符。在切除担体序列后，进一步进行
RP-HPLC 获得了 SMAP-29 重组肽。
2.5 SMAP-29重组肽抗菌性
SMAP-29 重组肽对测试菌均具有显著抗菌活
性（图 7），在肽浓度 5 μmol/L 时，3 种菌的存活率
均下降到 50% 以下。其中对大肠杆菌（E. coli）抑
71
kD M 1 2
50
35
25
16
8
M ：蛋白分子量标准 ；1 ：空载体诱导后总蛋白 ；
2 ：pET28a-smap29 诱导后总蛋白
图 5 SDS-PAGE 检测重组肽诱导表达
制作用最强，最小抑菌浓度 MIC 为 10 μmol/L，对金
黄色葡萄球菌（S. aureus）抑制作用其次，MIC 为
20 μmol/L，对白念珠菌（C. albicans）的 MIC 为 40
μmol/L。
16.949
kD M 1 2 3
14.404
10.700
8.159
6.214
2.512
M ：肽分子量标准 ；1 ：纯化融合蛋白（7.66 kD）；2 ：肠激酶切割产物 ；
3 ：纯化的 SMAP-29
图 6 Tricine-SDS-PAGE 检测融合蛋白及其裂解产物
0
20
40
60
80
100
ce
ll
su
rv
iv
al
% E.coli
S.aureus
C.albicans
0 10 20 30 40
peptide concentrationμmol/L
图 7 重组 SMAP-29 在不同浓度下的抗菌性
3 讨论
SMAP-29 具有广谱、高效的抗菌作用，是一
种较具潜力的抗感染药物候选分子，今后有可能替
代传统抗生素解决部分细菌耐药问题。目前关于
SMAP-29 抗菌功能及作用机制的研究大多采用合成
肽［11，12］，由于化学合成成本昂贵，不利于其进一步
扩大应用，而对基因工程表达研究还很不充分，为此，
我们对 SMAP-29 的基因工程表达制备进行了研究。
为了使外源基因能够在大肠杆菌中高效表达，
避免由于表达序列中存在大肠杆菌稀有密码子而导
致的翻译效率低下，根据大肠杆菌偏好的密码子对
基因序列进行了优化。为了最终获得不带有载体序
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期148
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（责任编辑 马鑫）
列残留的天然 SMAP-29 抗菌肽序列，我们在目标肽
序列 N 端上游添加了肠激酶切割位点，在目标肽序
列 C 端添加了连续两个终止密码子。选取 pET-28a
（+）作为表达载体，通过 EcoR I 和 Hind III 限制酶
位点将目标肽序列连接到载体中，在 Escherichia coli
BL21（DE3）中以包涵体形式表达出重组融合蛋白，
避免了对宿主菌的毒性。由于担体蛋白中含有 His
标签，将包涵体溶解后可以很方便地利用 Ni-NTA 亲
和层析获得纯化的融合蛋白，经过肠激酶切割后释
放出两端均无任何额外氨基酸引入的 SMAP-29 抗菌
肽序列。许多基因工程制备的重组蛋白含有额外的
氨基酸残留，有些情况下可能对于其功能影响不大，
但是 SMAP-29 抗菌肽 N 端或 C 端额外氨基酸的引入，
都会对其功能产生影响，因此本研究制备的 SMAP-
29 重组抗菌肽为研究其功能提供了适宜的原材料。
SMAP-29 重组抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄
球菌和白念珠菌均具有显著的抗菌活性，但是其最
小抑菌浓度值（MIC）均高于文献报道值［13］。这可
能与文献中使用的化学合成肽 C 端进行了酰胺化修
饰有关，酰胺化修饰可增加正电荷，增强杀菌活性。
今后可通过在目标肽 C-末端引入天冬酰胺，表达出
相应的重组抗菌肽，增强其杀菌活性。
4 结论
按照大肠杆菌偏好的密码子合成 smap-29 抗菌
肽基因，并在目的基因的 N 端添加肠激酶切割位点，
同时在 C 端添加终止密码子，通过 EcoR I 和 Hind
III 限制性内切酶位点将目的基因连接到 pET-28a（+）
表达载体中，在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达出带
有 6×His 标签的融合蛋白，利用 Ni-NTA 亲和层析
纯化融合蛋白后，经过肠激酶切割，获得具有抗菌
活性的不带有额外氨基酸序列残留的天然 SMAP-29
抗菌肽序列。
参 考 文 献
［1］ Mahoney MM, Lee AY, Brezinski-Caliguri DJ, et al. Molecular
analysis of the sheep cathelin family reveals a novel antimicrobial
peptide ［J］. FEBS Lett, 1995, 377（3）：519-522.