全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-08-19
基金项目 ：安徽省科技计划项目（11010402143），安徽省质监局科研项目（皖质函【2010】171 号）
作者简介 ：汪永信，男，硕士，工程师，研究方向 ：分子生物学与食品安全检测 ；E-mail ：yxw118952@163.com
双重实时荧光 PCR 法检测食品和饲料中的鸡源性成分
汪永信 安虹 程坚 程潇 刘娟娟 张波
（国家农副加工食品质量监督检验中心 安徽国家农业标准化与监测中心，合肥 230051）
摘 要： 根据鸡线粒体 DNA 细胞色素 b 基因序列和内参照基因 PUC18 质粒基因序列设计特异性引物和以不同荧光素标记的
TaqMan 探针。通过对反应条件的优化筛选，建立能同时扩增鸡源性成分和内参照基因成分的双重实时荧光 PCR 检测方法。设置
内参照反应是为了监控反应体系中是否含有 PCR 反应的抑制物，避免出现假阴性结果。分别以鸡、鸭、鹅、火鸡、牛、羊、猪、鱼、兔、驴、
鹿、狗、马、鸽子、大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯及番茄的线粒体 DNA 作为模板进行特异性试验，结果表明该方法仅能特异
性扩增鸡源性成分，而对其它物种未见有效扩增。通过灵敏度测试，该方法检出限达 0.01%。所制定的方法特异性高，灵敏度好，
可以作为食品和饲料中鸡源性成分的高效检测方法。
关键词： 双重实时荧光 PCR 细胞色素 b 基因 鸡源性成分 内参照 检测方法
Duplex Fluorescent Real-time PCR Detection of Chicken Derived
Materials in Food and Feed
Wang Yongxin An Hong Cheng Jian Cheng Xiao Liu Juanjuan Zhang Bo
（National Agriculture Vice-processing Food Quality Surveillance Test Center, Anhui Country Agriculture
Standardization and Monitor Center, Hefei 230051）
Abstract: We designed the specific primers and TaqMan probes targeting cytochrome b genes of chicken mitochondrial DNA and PUC
18 plasmid genes for the internal positive control （IPC）. We used different fluorescents to label the probes. After optimization of reaction
conditions, we set up a duplex fluorescent real-time PCR method to detect chicken derived materials and IPC, simultaneously. In order to
detect inhibition , IPC were used in all PCR reactions, which prevented false negative results. The specificity of the method was evaluated
using template DNAs from chicken and other 19 species such as turkey, duck, goose, bovine, ovine, pork, fish, rabbit, donkey, venison, dog,
horse, pigeon, soybean, maize, wheat, rice, potato, tomato,only the specific amplification of chicken derived materials was observed,where
as no amplification products were obtained from other species. The limit of quantification was found to be 0.01% through sensitivity tests. In
conclusion，the study showed that the developed real-time PCR method is a specific, sensitive and efficacious assay for the detection of chicken
derived materials in food and feed．
Key words: Duplex fluorescent real-time PCR Cytochrome b gene Chicken derived materials IPC Detection method
肉及肉制品已经成为人们膳食结构的重要组成
部分，因来源、营养成分等方面的差别，不同种类
的肉制品价格差异很大。一些不法分子为牟取暴利，
在肉制品中搀杂使假、以假乱真的欺骗行为屡见不
鲜。鸡肉的价格相对便宜，其被掺杂在牛羊肉等制
品中以获取高额利润的事件更是时有发生。另外，
鸡源性饲料也是禽流感等动物疫病传播的重要媒介，
当鸡源性动物疫病在某一地区暴发时，检测来源于
疫区饲料中鸡源性成分，切断疫病传播也显得非常
必要。因此世界上很多国家都将饲料中含有禽源性
成分列为主要检疫范围［1］。近年来很多研究都表明，
以线粒体 DNA 为靶序列的 PCR 技术已经成为检测
食品和饲料中动物源性成分最有效的方法［2-8］。在
这些研究中也有关于鸡源性成分检测的报道，不过，
多是采用普通 PCR 方法［4-6］，少数采用实时荧光
PCR 方法的报道也仅对特异性目的基因进行检测［8］，
2012年第1期 135汪永信等 ：双重实时荧光 PCR 法检测食品和饲料中的鸡源性成分
未考虑到样品中可能存在 PCR 反应的抑制物，会对
反应结果带来负面影响。
而基于时效性与准确性方面的优势，实时荧光
PCR 技术已经逐步取代了普通 PCR 技术，成为检
测动物源性成分最常用的分子生物学方法［9］。而食
品和饲料在生产加工环节，必然要带入多种添加成
分，其中不乏含有 PCR 反应的抑制物质。因此本
研究特采用双重实时荧光 PCR 技术，在反应体系
中引入 PUC18 质粒作为内参照基因，用来监控反
应体系中是否含有 PCR 反应的抑制物，避免出现
假阴性结果。通过对反应条件的优化筛选，特异性
和灵敏度试验，建立了能同时扩增鸡源性成分和内
参照基因成分的双重实时荧光 PCR 检测方法，以
满足实际需求。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验样本 鸡肉及各种动、植物肉类及饲料
样本购自合肥市农贸市场，1% 鸡标准品购自辽宁检
验检疫技术中心。
1.1.2 主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、dNTP、
10×PCR 缓冲液购自 TaKaRa 生物工程公司，DNA
提取试剂盒购自基因科技（上海）有限公司。实时
荧光 PCR 仪为 ABI 公司 7500 系列产品。
1.1.3 引物与探针序列 根据 GenBank 中公布的鸡
线粒体 DNA 细胞色素 b 基因序列及 PUC18 质粒基
因序列，运用 ABI Primer Express 软件，设计引物和
探针序列，见表 1，引物和探针由上海生工生物工
程公司合成。
名称 序列
鸡 5 引物 TCTGGGCTTAACTCTCATACTCACC
鸡 3 引物 GGTTACTAGTGGGTTTGCTGGG
鸡探针 FAM-CATTCCTAACACTAGCCCTATTCTCCCCCA-TAMARA
内参照 5 引物 CGGATGGCATGACAGTAAGAGA
内参照 3 引物 CCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG
内参照探针 HEX-TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAA- TAMARA
表 1 引物和探针序列
1.2 方法
1.2.1 样品 DNA 的提取 采用 DNA 提取试剂盒（离
心柱型）进行，提取方法详见试剂盒使用说明书。
1.2.2 单重实时荧光 PCR 反应条件的建立 通过普
通 PCR 方法，优化两个单重 PCR 反应的退火温度。
在此基础上建立单重实时荧光 PCR 方法，反应体系：
10×Taq Buffer（ 含 Mg2+ ）5 μL，dNTP Mixture（2.5
mmol/L）4 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，
探针（5 μmol/L）1 μL，Taq 酶（5 U/μL）1.25 U，模
板 DNA（100 ng/μL）2.5 μL，补水至 50 μL。反应程
序 ：37℃ 5 min ；95℃预变性 5 min、95℃变性 15 s、
适宜的退火温度退火延伸 50 s，同时收集荧光，进
行 40 个循环。
1.2.3 双重实时荧光 PCR 反应条件的优化 在 1.2.2
基础上以 Ct 值、荧光增量为考察依据，优化引物、
探 针、dNTP、Taq 酶、 模 板 在 双 重 体 系 中 的 最 适
浓度。其中鸡和内参照基因引物和探针的用量采用
1 μL 0.5 μL、1 μL 0.8 μL 和 1 μL 1 μL 比例进行试
验，模板 DNA 的用量采用 2.5 μL 2.5 μL、2.5 μL
1 μL 和 2.5 μL 0.5 μL 比例进行试验，dNTP 的用量
采用 4 μL、5 μL 和 6 μL 进行试验，Taq 酶的用量采
用 1.25 U、2.5 U 和 5 U 进行试验，每次只改变一个
变量，反应条件参照 1.2.2，进行双重实时荧光 PCR
扩增。
1.2.4 方法特异性研究 分别选取火鸡肉、鸭肉、
鹅肉、牛肉、羊肉、猪肉、鱼肉、兔肉、驴肉、鹿
肉、狗肉、马肉、鸽子肉和大豆、玉米、小麦、大米、
马铃薯、番茄的 DNA 作为 PCR 反应的模板，以已
知的鸡肉样本 DNA 作为阳性对照模板，去离子水作
为阴性对照模板，并在每个反应体系中加入 PUC18
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期136
质粒作为内参照模板，按 1.2.3 反应条件进行双重实
时荧光 PCR 扩增。
1.2.5 方法灵敏度研究 提取含 1% 的鸡源性成分
标准品 DNA 后，将浓度调整为 100 ng/μL，用 TE 将 1%
的鸡源性成分 DNA 样本进行系列稀释，获得在相同
体积的情况下鸡源性成分的绝对含量与鸡源性成分
实际含量为 0.1%、0.01% 和 0.001% 的样本完全一
致的 DNA 样本，作为 PCR 反应的模板，同时以去
离子水作为阴性对照模板，并在每个反应体系加入
PUC18 质粒作为内参照模板，按 1.2.3 反应条件进行
双重实时荧光 PCR 扩增。
1.2.6 实际样品进行检测 由于鸡源性成分鉴别尚
未出台相关的国家和行业标准，本研究特采取摸拟
实际样本，以盲样的方式进行试验。按照不同肉制
品的加工工艺，摸拟加工不同的肉类制品 16 组（其
中 8 组含鸡源性成分，鸡源性成分添加量为 50%、
30%、20%、1% 的样本各 2 组）。同时还选取 3 组
样本通过 200℃，2 h 加工处理（分别为鸡源性成分
添加量 20% 的 2 组肉制品及 1 组未添加鸡源性成分
的肉制品样本）。饲料制品 4 组（其中 2 组为植物性
饲料添加 5% 鸡源性成分样本）。应用本方法对样本
中的鸡源性成分进行检测。
2 结果
2.1 单重实时荧光PCR反应条件的建立
通过优化 PCR 反应的退火温度，结果表明 60℃
时为两个单重反应适宜的退火温度。在此基础上，
按 1.2.2 的反应体系和反应条件进行实时荧光 PCR
扩增，分别收集 FAM 荧光和 HEX 荧光，两个单重
反应都能出现稳定的扩增曲线（图略）。
2.2 双重实时荧光PCR反应条件的优化
经优化筛选，鸡和内参照基因引物和探针的用量
为 1 μL 0.8 μL，dNTP 的用量为 4 μL、 Taq 酶的用量为
2.5 U、鸡和内参照基因模板的用量为 2.5 μL 1 μL
时，双重体系中的每个基因均能稳定扩增，且 FAM
荧光增量和 HEX 荧光增量相接近。其中鸡肉样本以
鸡 DNA 和 PUC18 质粒作为模板，阴性对照以去离
子水和 PUC18 质粒作为模板，优化结果如图 1。而
图 2 表示任选非优化条件下（鸡和内参照基因引物
和探针的用量采用 1 μL 0.5 μL，其余为最适体系）
双重实时荧光 PCR 扩增结果，可以看出，在两个样
本中内参照基因均有扩增，但 HEX 荧光增幅明显低
于 FAM 荧光增幅，且与阴性对照中水为模板无任何
扩增的 FAM 荧光都很接近，这样会给结果判定带来
很大困扰。
1. 鸡肉样本体系（鸡肉，FAM）； 2. 鸡肉样本体系（内参照 PUC18，HEX）;
3. 阴性对照体系（内参照 PUC18，HEX）；4. 阴性对照体系（水，FAM）
图 1 鸡源性成分和内参照基因双重实时荧光
PCR 扩增曲线（优化）
1. 鸡肉样本体系（鸡肉，FAM）；2. 鸡肉样本体系（内参照 PUC18，HEX）;
3. 阴性对照体系（内参照 PUC18，HEX）；4. 阴性对照体系（水，FAM）
图 2 鸡源性成分和内参照基因双重实时荧光 PCR
扩增曲线（非优化）
2.3 方法特异性检验
结果表明，仅鸡肉 DNA 作为模板的阳性对照
品能收集到明显的 FAM 荧光扩增曲线，而其余
19 种常见动植物种类样本的 DNA 及去离子水作
为模板时，FAM 荧光扩增为阴性（Ct>40）。而
每 个 样 本 的 内 参 照 基 因 均 能 有 效 扩 增， 表 明 未
检出鸡源性成分的样本中无 PCR 反应的抑制物
存 在。 扩增结果如图 3。因此本研究选择的引物和
探针序列特异性符合要求。
2012年第1期 137汪永信等 ：双重实时荧光 PCR 法检测食品和饲料中的鸡源性成分
2.4 方法灵敏度检验
结果表明，以含 1%、绝对含量相当于 0.1% 和
0.01% 的鸡源性成分的 DNA 样本作为模板时，能收
集到明显的 FAM 荧光扩增曲线，而以绝对含量相
当于 0.001% 的鸡源性成分的 DNA 样本和去离子水
作为模板时，FAM 荧光扩增为阴性，内参照基因均
能有效扩增 , 如图 4。因此本方法的最低检出限达
0.01%。
仍然检出了鸡源性成分。检测结果与实际情况完全
吻合。
1. 鸡肉（FAM）； 2-21. 火鸡肉、鸭肉、鹅肉、牛肉、羊肉、猪肉、鱼肉、
兔肉、驴肉、鹿肉、狗肉、马肉、鸽子肉、大豆、玉米、小麦、大米、
马铃薯、番茄和阴性对照（FAM 荧光）；22-42. 内参照（鸡肉、火鸡肉、
鸭肉、鹅肉、牛肉、羊肉、猪肉、鱼肉、兔肉、驴肉、鹿肉、狗肉、马肉、
鸽子肉、大豆、玉米、小麦、大米、马铃薯、番茄和阴性对照，HEX）
图 3 方法特异性研究扩增曲线
1. 1% 鸡肉（FAM）；2. 0.1% 鸡肉（FAM）；3. 0.01% 鸡肉（FAM）；4.
0.001% 鸡肉（FAM）；5. 阴性对照（FAM）；6-10. 内参照（1% 鸡肉、
0.1% 鸡肉、0.01% 鸡肉、0.001% 鸡肉，阴性对照，HEX）
图 4 方法灵敏度研究扩增曲线
2.5 实际样品进行检测
通过对摸拟样本进行检测，结果表明 16 组肉
制品中有 8 组检出了鸡源性成分，4 组饲料样本中
有 2 组检出了鸡源性成分，扩增结果如图 5（未检
出鸡源性成分样本图略），其中添加 20% 鸡源性成
分的 2 组肉制品样本通过 200℃，2 h 加工处理后
1, 2. 50% 添加量（FAM）；3, 4. 30% 添加量（FAM）； 5,6. 20% 添
加量（FAM）；7,8. 1% 添加量（FAM）；9, 10.5% 添加量（FAM）；
11. 阴性对照（水，FAM）；12, 22. 内参照（50% 添加量、30% 添加量、
20% 添加量、5% 添加量、1% 添加量，阴性对照，HEX）
图 5 实际样本检测结果
3 讨论
物种基因的正确选择及基因片段长度的大小是
动物源性成分检测的关键。线粒体 DNA 是高等动
物唯一的核外遗传物质，基因组中无间隔系列、无
组织特异性、种内遗传稳定、种间高度变异、个体
不同组织中均含有大量的线粒体、可以获得较高的
拷贝数，已广泛用作食品及饲料中动物源性成分检
测的靶基因［10-12］。同时有研究表明待测样本 DNA
的破坏程度与加工温度密切相关，如加热到 100℃，
DNA 片段长度会锐减到 1 100 bp，至 120℃则锐减
到 600 bp 以下［13］，如果待测基因片段过长，可能
在实际检测中无法发现目的片段。因此本研究特选
择鸡线粒 DNA 细胞色素 b 基因作为靶基因 ；同时采
用 Taqman 实时荧光 PCR 技术，检测片段长度仅为
106 bp。研究表明靶基因及片段长度能满足实际需
求，在对 200℃，2 h 高温处理过的食品样本中仍能
有效检出鸡源性成分。
食品和饲料在生产加工过程中会带入多种添加
物质，其中有些可能是 PCR 反应的抑制剂。为了监
控反应体系中是否有抑制物存在，避免假阴性结果
出现，特在体系中引入内参照反应。内参照基因的
选择必须遵循与待测靶基因亲缘性低的物种，这样
才能有效避免非特异性扩增。本研究特选择来源于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期138
原核生物的 PUC18 质粒作为内参照基因，通过试验
表明该基因全序列对本研究所设计的鸡源性成分引
物和探针具有高度的特异性，无非特异性扩增现象
出现。另外，本研究对前处理过程中如何有效去除
抑制剂也作了一些有意义的探索，如通过双蒸水或
三氯甲烷等有机溶剂清洗样品。能有效去除加工食
品中可能含有的盐、糖及植物色素等抑制物质。
双重体系的优化是本研究的难点之一。两个单
重 PCR 反应必须有一个相同的退火温度是进行双
重 PCR 反应的前提。本研究在引物设计过程中已
经充分考虑这一需求，设计的两对引物具有相近的
Tm 值和熔解温度，并通过条件优化确定退火温度为
60℃时，两个单重反应都能有效扩增。同时双重体
系中两个反应一主一次，既要确保内参基因能有效
扩增，还要尽量减少与靶基因扩增争夺 PCR 合成所
需原料。因此本研究特对双重体系中两对引物、两
条探针、dNTP、Taq 酶、两个模板的浓度进行了优化，
最终确定鸡和内参照基因引物和探针的用量为 1 μL
0.8 μL，dNTP 的用量为 4 μL、Taq 酶的用量为 2.5 U、
鸡和内参照基因模板的用量为 2.5 μL 1 μL 时，在双
重体系中两个反应都能达到满意的效果。
最后应用本方法对实际样本进行检测，20 份摸
拟样本的检测结果与实际情况完全吻合。表明本研
究所制定的方法完全能够满足食品和饲料中鸡源性
成分日常检测需求，必将在有效打击制假售假行为，
防御疫病传播等方面发挥重要作用。
4 结论
本研究建立了能同时扩增食品和饲料中鸡源性
成分和内参照基因成分的双重实时荧光 PCR 检测方
法，该方法特异性高，灵敏度好，检出限能达 0.01%，
可以作为食品和饲料中鸡源性成分的高效检测方法。
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（责任编辑 李楠）