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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
BTB/POZ（BR-C，ttk and bab or pox virus and
zinc finger）家族蛋白是类 Kuppel 锌指蛋白家族中的
一种，广泛地存在于从酵母到人类的各个物种中。
它的发现要追溯到 1994 年，因最早在果蝇 broad-
complex、tralntrack、bric-a-brac 三个蛋白中发现而得
名［1-3］。BTB 蛋白并不是一类传统意义上的转录调
控因子，而是一种既有转录激活作用又有转录抑制
作用的蛋白［4-7］。它的主要特征是在 N 端含有 BTB
结构域，绝大多数含有该结构域的蛋白通常包括其
收稿日期 ：2013-09-23
基金项目 ： 中央级公益性科研院所基本科研业务专项（ITBB110216），海南省重大科技项目子课题（ZDZX2013023-1）
作者简介 ：柴文龙，男，硕士研究生，研究方向 ：作物遗传育种 ；E-mail ：chaiwl2012@163.com
通讯作者 ：徐碧玉，女，研究员，博士生导师，研究方向 ：香蕉生物技术 ；E-mail ：biyuxu@126.com
香蕉 MaBTB 基因的表达分析及亚细胞定位
柴文龙1  金志强3  贾彩红2  刘菊华2  苗红霞2  张建斌2  徐碧玉2
（1. 海南大学农学院，海口 570228 ；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口
571101 ；3. 中国热带农业科学院海口实验站 海南省香蕉遗传改良重点实验室，海口 570102）
摘 要 ： 利用荧光定量 PCR 分析在不同处理下的香蕉采后果实中 MaBTB 基因的表达，在正常成熟的果实中，MaBTB 基因
的表达与乙烯的释放量呈正相关 ；相反，在 1-MCP 处理的香蕉果实中，该基因的表达相对变化不明显 ；用乙烯处理的香蕉果实，
其表达量在第 3 天达到高峰，比正常成熟的早 11 d。这些结果表明 MaBTB 基因在香蕉采后果实中是受乙烯诱导表达的。最后，亚
细胞定位分析表明 MaBTB 基因定位在细胞核上。
关键词 ： 香蕉 MaBTB 基因 表达分析 亚细胞定位
Expression Analysis and Subcellular Localization of the MaBTB
Gene in Banana
Chai Wenlong1 Jin Zhiqiang3 Jia Caihong2 Liu Juhua2 Miao Hongxia2 Zhang Jianbin2 Xu Biyu2
（1. Department of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228 ；2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，
Ministry of Agriculture，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101；
3. Haikou Experimental Station，Institute of Banana，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570102）
Abstract:  Real-time quantitative PCR of postharvest banana revealed that MaBTB exhibited differential expression patterns that are
associated with ethylene biosynthesis. In naturally ripened bananas, expression of MaBTB was in accordance with ethylene biosynthesis. In
contrast, for 1-methylcyclopropene-treated bananas, MaBTB expression levels remained constant. Following treatment with ethylene, MaBTB
expression in banana fruit significantly increased with ethylene biosynthesis and peaked 3 d after harvest, which was 11 d earlier than that for
naturally ripened banana fruits. These results suggested that MaBTB expression was induced by ethylene for regulation of postharvest banana
ripening. Finally, subcellular localization assays showed that the MaBTB protein localizes to the nucleus.
Key words:  Banana（Musa acuminata L. AAA group） MaBTB gene Expression analysis Subcelluar localization
他的结构域，如锌指结构域（Zinc finger domain），b-ZIP
结 构 域（Basic region-leucine zipper domain），MATH
结构域和锚蛋白重复（Ankyrin repeats）［8］。这些结
构域通过协同作用行使转录调节、细胞骨架组织和
染色质的改变等生物学功能。植物中目前发现的含
该结构域的已知功能蛋白较少，但多具重要生物学
功能。如拟南芥中的 BPM 蛋白参与调控脂肪酸代
谢［9］，拟南芥中 NPR1 是植物抗性激素水杨酸的受
体［10］，玉米中的 MAB1 调控纺锤体的长度和胞核特
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期72
性［11］，拟南芥中 MATH-BTB 参与调控 ABA 信号［12］，
拟南芥中的 LRB1 和 LRB2 编码的 BTB1 和 BTB2 蛋
白对其光形态发生有强烈的影响［13］等。
香蕉是一种典型的跃变型果实，广泛地分布于
热带和亚热带地区。香蕉果实的乙烯释放模式与其
他跃变型果实不同，它在呼吸跃变前有一个突然上
升和下降峰值。因此，香蕉中的乙烯释放机制与其
他跃变型果实的乙烯释放机制不同［14］。为了研究香
蕉果实成熟分子机制，我们利用抑制差减文库分离
克隆了采后成熟前差异表达基因［15］，获得一个与香
蕉果实成熟相关的 BTB 基因的 cDNA 片段。为了研
究该基因是否与香蕉果实成熟和乙烯生物合成相关，
克隆该基因的全长，利用荧光定量 PCR 分析该基因
在乙烯生物合成不同时期的表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料
香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）
果实（开花后 100-120 d）从中国热带农业科学院热
带生物技术研究所澄迈香蕉种植园获得。选取成熟
度一致的香蕉果实分为 3 组进行以下处理。正常成
熟处理，将香蕉置于温度 25℃，相对湿度 85% 的三
洋培养箱（SANYO MRL-350）中 ；外源乙烯处理，
将香蕉果实放入密闭的保鲜盒中，并注射入 100 μL /L
的乙烯［14］，25℃放置 18 h 后开盖，然后再将处理
好的香蕉置于温度 25℃，相对湿度 85% 的三洋培养
箱（SANYO MRL-350）中成熟 ；1-MCP 处理 ：香蕉
果实放入密封的保鲜盒中按 1 μL /L 的量秤取 1-MCP
粉末加水，25℃放置 18 h 后开盖，然后再将处理好
的香蕉置于温度 25℃，相对湿度 85% 的三洋培养箱
（SANYO MRL-350）中成熟。处理的香蕉果实取样
用液氮速冻，于 -75℃超低温冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 乙烯释放量的测定 果实乙烯释放速率测定
的方法如下 ：将 3 个果指放入体积为 0.5 L 的密封
罐中，封罐 3 h。用 1 mL 注射器抽出气体，用日本
岛津 GC2010 型气相色谱仪测定果实乙烯释放速率，
每个样品测定 3 次。气相色谱的工作条件为 ：火焰
离子化检测器（FID），载体为 60-80 目 AI2O2，柱
温 90℃，进样气温度 100℃，载气为 N2，流速为 25
mL/min［16］。测定完成后，量取果实的体积和质量，
计算香蕉果实单位体积质量下的乙烯的释放速率。
1.2.2 RNA 的提取和 cDNA 的合成 香蕉果实的总
RNA 提取采用改良的 CTAB 法［17］，第一链 cDNA 合
成根据 SMARTTM PCR cDNA 试剂盒说明书进行。
1.2.3 荧光定量 PCR 分析 MaBTB 基因的表达 分
别提取不同处理的香蕉果实总 RNA。自然成熟 ：发
育不同阶段的果实分别采取同一植株雌花花序的第
1 轮、第 4 轮和第 8 轮子房（ov1、ov4 和 ov8）、采
后 0、2、6、10、12、14 和 16 d 的果实；乙烯处理：0、
1、2、3、4、5、6 和 7 d 的果实；1-MCP 处理：0、2、6、
10、12、14 和 16 d 的果实。利用 SMART PCR cDNA
试剂盒将 200 ng 的总 RNA 反转录成 cDNA 后，用于
荧光定量 PCR 的模板。
利用荧光定量 PCR 对 MaBTB 基因在香蕉不同
处理下的表达进行分析。反应体系为 ：12.5 μL 的
2 ⅹ SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL 的 ROX，
100 μg 的 反 转 录 RNA。 所 用 引 物 为 ：MaBTB5 ：
5-AAACGGCTAATGGTTACAAG-3（10 pmol）；
MaBTB3 ：5-GTGACGCACATCCACAACTC-3（10
pmol），actin5 ：5-CGAGGCTCAATCAAAGA-3（10
pmol），actin3 ：5-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3（10
pmol）。反应程序为：94℃预变性 3 min，94℃变性 7 s，
55℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 20 s，40 个循环。Actin
作为内对照。
1.2.4 MaBTB 基因植物表达载体的构建与亚细胞
定 位 为 了 分 析 MaBTB 基 因 在 细 胞 内 的 定 位 情
况， 构 建 了 带 有 报 告 基 因 GFP 的 荧 光 植 物 表 达
载体。用 Nco I 和 Spe I 分别双酶切植物表达载体
pCAMBIA1302 和 MaBTB 目的片段。然后将目的片
段和表达载体进行连接，获得的即是 pCAMBIA1302-
MaBTB 融合植物表达载体。亚细胞定位试验中用只
携带 GFP 的空载体作为阳性对照，水作为阴性对照。
最后利用基因枪将该基因导入洋葱表皮，26℃暗处
培养 18 h 后在荧光显微镜下进行观察。
2 结果
2.1 香蕉采后果实乙烯释放量的测定
对香蕉果实采后不同处理下的乙烯释放量进行
了测定。研究发现（图 1），在自然成熟的香蕉果实中，
2014年第4期 73柴文龙等 ：香蕉 MaBTB 基因的表达分析及亚细胞定位
乙烯释放量在采后 8 d 开始上升，到 14 d 时达到高峰，
而后快速下降（图 1-A）。在乙烯处理的香蕉果实中，
内源乙烯在采后第 1 天开始产生，比自然成熟果实
乙烯释放量提早了 7 d，并且在采后第 3 天达到高
峰（图 1-B），比自然成熟果实的乙烯峰值提早了 11
d，而且，乙烯处理的香蕉果实的乙烯释放量最大值
比自然成熟的香蕉果实的乙烯释放量最大值高很多。
1-MCP 处理的香蕉果实的乙烯释放量在采后 14 d 时
开始释放，并且没有峰值出现（图 1-C）。
最高峰时间不同，自然成熟的在采后第 14 天（图 3），
乙烯处理的在采后第 3 天（图 2）。在 1-MCP 处理的
香蕉果实中，在 0-12 d 内表达量逐渐上升，没有明
显的峰值，这种情况持续到采后第 14 天（图 4）。
0
0
10
20
30
2 4 6 8
䟷ਾཙᮠd
10 12 14 16 18
㠚❦ᡀ⟏
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҉✟
䟺᭮
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A
0
5
15
25
35
0 1 2 3
䟷ਾཙᮠd
4 5 6 7
҉✟༴⨶




B
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 2 4 6 8
䟷ਾཙᮠd
10 12 14 16 18
1-MCP༴⨶





C
** ：P ≤ 0.01 ；* ：P ≤ 0.05
图 1 乙烯释放量的测定
2.2 MaBTB基因在香蕉采后果实不同处理下的表
达分析
利用实时荧光定量 PCR 方法对 MaBTB 基因在
香蕉果实采后不同处理下的表达进行分析。结果（图
2）发现，在乙烯处理的香蕉果实中，MaBTB 基因
在采后 0 到 3 d 表达量急剧上升。在自然成熟的香
蕉果实中，该基因的表达最高峰与乙烯处理的表达
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Ov8 䟷ਾཙᮠd
⴨ሩ
㺘䗮
䟿%

**
**
**
Ov4 Ov1 2 10 12 14 160 6
Ov：子房；ov8、ov4、 ov1 分别代表雌花花序发育的第 8 轮、第 4 轮和第 1 轮子房；
** ：P ≤ 0.01
图 3 MaBTB 基因在香蕉果实自然成熟中的表达
0
20
40
60
80
100
0
䟷ਾཙᮠd
⴨ሩ
㺘䗮
䟿%

** **
**
**
** **
1 2 3 4 5 6 7
** ：P ≤ 0.01
图 2 MaBTB 基因在香蕉果实乙烯处理下的表达
0
2
4
6
8
10
12
14
0
䟷ਾཙᮠd
⴨ሩ
㺘䗮
䟿%

**
** **
2 6 10 12 14 16
** ：P ≤ 0.01
图 4 MaBTB 基因在香蕉果实 1-MCP 处理下的表达
2.3 MaBTB基因植物表达载体的构建与亚细胞定位
以含有 MaBTB 基因全长的质粒为模板进行 PCR
扩增获得的即是目的基因片段 MaBTB（图 5）。再利
用 Nco I 和 Spe I 双酶切重组质粒进行鉴定（图 6），
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期74
结果表明目的片段已插入表达载体中，测序表明该
序列与目的基因一致，且与 GFP 的阅读框都未发生
变化，这些都表明载体构建成功。
14-16 d 有一个快速下降的过程。在乙烯处理的香蕉
采后果实中，乙烯的生物合成立即被启动，在整个
成熟过程中均有乙烯的产生，且乙烯产生的高峰的
出现比自然成熟的早了 11 d。这表明外源乙烯加速
了香蕉采后的成熟过程［14］。在 1-MCP 处理的香蕉
采后果实中，乙烯的释放几乎完全被抑制。
用 1-MCP 处理的香蕉采后果实中，在呼吸跃变
前 MaBTB 基因的表达量比在自然成熟中的表达量
高，但其相对变化不明显，这表明 1-MCP 没有直接
影响 MaBTB 基因的表达，可能在香蕉成熟过程中影
响了其它的路径。Inaba 等［18］研究发现，在香蕉的
绿熟期，1-MCP 能抑制香蕉的成熟和推迟呼吸的到
来。然而，当香蕉由绿转黄的过程中，用 1-MCP 处
理香蕉对其成熟则没有影响。
MaBTB 基因在 3 种处理下的表达分析表明该基
因是受乙烯诱导表达的。在自然成熟的香蕉果实中
MaBTB 基因的最大表达量与乙烯高峰出现一致，同
时该基因的表达量变化与乙烯释放量的变化趋势也
是一致的。在乙烯处理的香蕉采后果实中，MaBTB
基因的表达量迅速上升与乙烯的释放趋势一致。而
在 1-MCP 处理的香蕉采后果实中，虽然乙烯的产生
量几乎被抑制，但 MaBTB 基因的表达量缓慢上升与
乙烯的释放趋势相一致。这些结果都表明在香蕉果
实采后成熟的过程中，MaBTB 基因的表达是受乙烯
调控的。MaBTB 基因在乙烯处理、自然成熟和 1-MCP
处理的香蕉采后果实中的最大表达量分别为 84.2%、
17.1% 和 11.5%。外源乙烯处理下香蕉采后果实中
MaBTB 基因的最大表达量分别是自然成熟和 1-MCP
处理下的 MaBTB 基因的最大表达量的 4.9 和 8.2 倍。
2500
bp
M 1
2000
1500
1250
1000
750
500
250
M ：DNA marker ；1 ：MaBTB 基因 PCR 扩增
图 5 MaBTB 基因 PCR 扩增
2500
bp
M 1
2000
1500
1250
1000
750
500
250
M ：DNA Marker ；1 ：Nco I 和 Spe I 双酶切结果
图 6 pCAMBIA1302-MaBTB 双酶切鉴定
为了分析 MaBTB 基因的定位情况，将带有荧光
标记的表达载体转入洋葱表皮。观察发现，阳性对
照在洋葱整个细胞中均有表达（细胞核和细胞质中）
（图 7-a，7-b），带有 MaBTB 基因的 GFP 只在细胞核
中表达（图 7-c，7-d）。而阴性对照则在细胞中没有
荧光出现（图 7-e，7-f）。
3 讨论
在多数跃变型果实中，乙烯的释放是在跃变时
发生并且不断增加，一直持续到果实成熟。香蕉作
为典型的呼吸跃变型果实，其乙烯生物合成与其它
跃变型果实的乙烯生物合成不同，在整个呼吸过程
中，乙烯的释放量有一个快速上升和快速下降的过
程［14］。本研究中，在自然成熟条件下香蕉果实的跃
变早期，乙烯没有明显的变化，在采后的 10-14 d
有一个快速升高的过程，在采后 14 d 达到高峰，在
a b
c d
e f
a，b ：空载体瞬时表达 ; c，d ：MaBTB-GFP 瞬时表达 ；e，f ：阴性对照瞬时
表达 ；a，c，e ：为明场图像 ；b，d，f ：为紫外激发光图像
图 7 洋葱表皮细胞 GFP 荧光的观察
2014年第4期 75柴文龙等 ：香蕉 MaBTB 基因的表达分析及亚细胞定位
这些结果有力地证明了外源乙烯促进了 MaBTB 基因
的表达。虽然内源乙烯的释放量在第 3 天达到高峰，
与 MaBTB 基因的表达量趋势一致，但是在乙烯处理
下的香蕉采后果实中 MaBTB 基因的表达量的变化趋
势比在自然成熟条件下的要迅速。前人研究表明［14］，
在自然成熟和乙烯处理的香蕉果实中，乙烯释放量
不同，可能是在乙烯合成中有不同的机制参与引起
的。Weber 和 Hellma［19］ 研究表明 BPM（BTB/POZ-
MATH）蛋白可以与乙烯的反应因子家族作用，这或
许代表着另外一种转录机制。香蕉 MaBTB 基因在不
同处理中的不同表达结果可能与不同的调控机制有
关，这需要进一步的研究证明。
利用洋葱表皮进行亚细胞定位观察基因的定位
情况是一种公认的试验方法［20，21］。绿色荧光蛋白
GFP 在原核或真核细胞中表达后，可在蓝光或紫光
的激发下产生明亮的绿色荧光。本研究以基因枪轰
击的方式将构建好的重组表达载体导入洋葱表皮细
胞，结果发现 MaBTB-GFP 融合蛋白在洋葱细胞核内
表达。这表明 MaBTB 基因编码的蛋白作为一种转录
因子在细胞内直接或间接参与一些功能基因的启动
表达。
本研究通过初步探究 MaBTB 基因的表达与乙烯
的生物合成的关系，可以为进一步研究该基因功能
提供线索和思路。然而对于该基因的具体功能的阐
述则需要进行更深入的研究。
4 结论
本研究利用荧光定量 PCR 方法对在自然成熟，
乙烯处理和 1-MCP 处理等条件下的香蕉采后果实中
的 MaBTB 基因进行表达分析，结果表明 MaBTB 基
因在香蕉采后果实中是受乙烯诱导表达的。亚细胞
定位分析，表明 MaBTB 基因是定位在细胞核上。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）