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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）属红豆
杉科，红豆杉目，松杉纲，裸子植物亚门，产于长
江流域以南，常生于海拔 1 000-1 200 m 以下山林中，
呈星散分布，湖南省主要分布于阳明山国家级自然
保护区。红豆杉为世界濒危珍稀植物，是第四纪冰
川后的孑遗物种，素有“植物黄金”之称［1］。红豆
杉中化学成分包括紫杉烷类化合物和少量非紫杉烷
类化合物，其中紫杉醇（paclitaxel，商品名 taxol）
是红豆杉中最主要的有效成分。
紫杉醇是一种具有广谱抗癌活性的三环二萜类
化合物，它能与微管蛋白质结合，形成稳定的微管
束，促进微管聚合，抑制微管降解，从而导致微管
束排列异常，使细胞分裂受阻，将癌细胞停止在 G2
收稿日期 ：2013-06-21
基金项目 ：2010 年湖南省科技厅项目（2010NK3006）
作者简介 ：余响华，男，博士研究生，讲师，研究方向 ：生物工程 ；E-mail ：weall2000@126.com
乙醇提取红豆杉树叶紫杉醇醇提条件的研究
余响华  戴永强  邵金华
（湖南科技学院生化系，永州 425100）
摘 要： 对南方红豆杉树叶中紫杉醇的最佳醇提工艺条件进行了研究。采用乙醇浸提方法，考查了粉碎度、乙醇浓度、料液比、
提取温度和提取时间对紫杉醇提取效率的影响，经过一系列的单因素试验和正交试验，得到了紫杉醇醇提工艺的最佳条件 ：在粉
碎度 120 目、95% 乙醇浸提、料液比为 1∶15、提取温度 40℃、提取 4 h、重复 2 次的条件下，经乙酸乙酯—丙酮（6∶4）洗脱纯化，
HPLC 测定紫杉醇含量，可使紫杉醇含量达到 0.012 5 mg/g。
关键词 ： 南方红豆杉 紫杉醇 醇提 HPLC
Study on Ethanol Extracting Conditions of Taxol from Leaves of
Taxus Chinese var. maria
Yu Xianghua Dai Yongqiang Shao Jinhua
（Department of Life Science & Chemistry Engineering，Hunan Science & Technology College，Yongzhou 425100）
Abstract:  The best ethanol extraction technology of paclitaxel from leaves of Taxus chinensis var. mairei was established. By a serials
of single-factor experiments and L16（4
3）orthographic experiments, the extraction conditions were determined .The main factors contained
Zerkleinerungsgrad、ethanol concentration、solid-liquid ratio and extraction time, the results showed that the best extraction conditions as
follow ：120 mesh, ethanol concentration was 95%, solid-liquid ratio was 1∶15, the extraction time was 4 hour, repeated 2 times, the leaching
temperature was 40℃. Then elutioned with ethyl acetate-acetone（6∶4）through a small chromatographic column, and detected by HPLC.
Under these conditions, the total paclitaxel extraction yield can reach up to 0.012 5 mg/g（dry weight） .
Key words:  Taxus chinensis var. mairei Paclitaxel Ethanol extraction HPLC
晚期或 M 期，最终导致癌细胞死亡［2］。以红豆杉植
株为主要原料提取的紫杉醇可用于治疗各种急慢性
肿瘤，被称为“晚期癌症的最后一道防线”，被认为
是近 20 年来发现的一种最有希望的抗癌药物。
虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用
半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织
细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得
了较大的进展［3-5］，但是要实现这些技术的工艺扩
大和工业放大生产还存在一些问题，而从树皮中提
取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植
物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。
目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固
相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、
2013年第10期 99余响华等 ：乙醇提取红豆杉树叶紫杉醇醇提条件的研究
离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化
学反应法［6-8］。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃
取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已
经成功应用于工业生产，但仍需改进。本研究以乙
醇为提取溶剂，探求从南方红豆杉树叶中浸取紫杉
醇的最佳提取条件，旨在为南方红豆杉这一药用植
物资源的开发与利用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 红豆杉树叶，采自湖南省永州市阳明
山国家自然保护区，50 年以上树龄。
1.1.2 试剂 紫杉醇标准品（纯度 >95%，Sigma）、
甲醇（色谱纯），丙酮、95% 乙醇、无水乙醇、甲醇
均为 AR 级。
1.1.3 主 要 设 备 与 仪 器 粉 碎 机、 日 本 岛 津 LC-
10ATvP 高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、真空干燥箱、
装有 0.5 g 400 目硅胶的小色谱柱（内径 10 mm，高
7 cm）、0.45 μm 微孔过滤器、Kromstar C18 柱（250
mm×4.6 mm）。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程 清洗→干燥、粉碎→乙醇浸提→
减压浓缩→石油醚洗涤除杂→上色谱柱→乙酸乙
酯 -丙酮洗脱→真空浓缩→甲醇定容→ HPLC 检测。
1.2.2 原料及提取液的处理 原料的前处理 ：将采
集到的树枝洗净后去除其他杂物，经 60℃低温干
燥［9］，控制水分在 10% 以下，粉碎过筛。
紫杉醇的乙醇浸提 ：准确称取 2.0 g 红豆杉树
叶粉末，按一定的料液比加入乙醇溶液，浸提 3 次，
在浸提过程中，每隔 15 min 震荡 1 min ；4 500 r/min
离心，收集浸提液。
紫杉醇的纯化 ：合并 3 次浸提液，常温真空减
压浓缩，回收溶剂，所得浸膏加 5 倍体积的石油醚
（60℃）［5］震荡萃取 30 min，除杂，去有机相，浸膏
用 4 mL 丙酮溶解，向其加入 6.00 mL 乙酸乙酯，加
压过小色谱柱洗脱，减压浓缩，甲醇定容至 5.00 mL。
1.2.3 紫杉醇含量的测定 标准曲线的绘制。标品
溶液配制 ：精确称取紫杉醇标准品 1.0 mg，用 10 mL
甲醇溶解，配成 100 mg/L 母液备用。将母液稀释成
5.0、10.0、15.0、20.0 和 40.0 mg/L 的系列标准品溶液。
色 谱 条 件 流 动 相 ：甲 醇∶ 水（V/V）=65∶
35 ； 流速 1.0 mL/min，检测波长 227 nm，进样量 10
μL。配制的标准紫杉醇溶液上色谱柱分析检测，紫
杉醇标准品的保留时间为 23.574 min（图 1-A）；紫
杉醇浓度（μg/mL）X 与峰面积（μv·s）Y 的线性
回 归 方 程 为 ：y=4 853.4x+2 325.8，R2=0.999 3（ 图
1-B），表明紫杉醇在 20-120 μg /mL 范围内具有良好
的线形关系。
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0A
㢢䉡
3.066
23.574
μV×104
图 1 紫杉醇标准品 HPLC 检测图（A）及标准曲线（B）
样品中紫杉醇含量的检测 ：待测样品经 0.45 μm
微孔过滤器过滤，HPLC 仪检测，根据标准曲线计
算其浓度，用下式计算紫杉醇的含量 ：
紫杉醇含量（mg/g）=C×V/M ［9］
式中，C 为样品中紫杉醇的浓度（mg/mL），V
为样品定容的体积（mL），M 为称取样品质量（g）。
1.2.4 乙醇浸提紫杉醇单因素试验 考察原料粉碎
度、料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间对紫
杉醇得率的影响（表 1）。
1.2.5 正交试验设计 依据单因素试验结果，选取
对紫杉醉提取率有显著影响的 4 个因索 ：粉碎目数、
料液比、乙醇浓度、提取时间，利用正交试验分析
上述 4 个因素在 4 个水平上对红豆杉紫杉醉提取效
果的影响，采用 4 因素 3 水平进行 L16（3
4）正交试
验（表 2）。
800000B
峰
面
积
(μ
V
·s
)
600000
400000
200000
0
20 40 60⎃ᓖμg/mL80 100 120
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期100
表 2 正交试验因素与水平
水平
因素
粉碎度（目） 乙醇浓度（V/V） 料液比（g ：mL） 时间（h）
1 80 85 1∶10 9
2 100 90 1∶15 12
3 120 95 1∶20 15
2 结果与分析
2.1 醇提单因素试验条件研究
2.1.1 粉碎度对紫杉醇提取效率的影响 将干燥的
红豆杉树叶粉碎，分别过 60、80、100、120 和 140
目筛，收集筛分 2.0 g，按 1∶15 料液比加 95% 乙醇
40℃浸提 4 h，重复浸提 2 次，经纯化后测定紫杉醇
浓度，获得粉碎度与紫杉醇含量变化曲线（图 2）。
表 1 紫杉醇乙醇提取单因素变化条件
因素 单因素变化条件 其他条件
粉碎度（目） 60 80 100 120 140 1∶15 料液比、95% 乙醇、40℃浸提 4 h，重复浸提 2 次
乙醇浓度（V/V） 80 85 90 95 100 过 120 目筛、1∶15 料液比、40℃浸提 4 h，重复浸提 2 次
料液比（g ：mL） 1∶5 1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 过 120 目筛、95% 乙醇、40℃浸提 4 h，重复浸提 2 次
温度（℃） 20 30 40 50 60 过 120 目筛、95% 乙醇、1∶15 料液比、单次浸提 4 h，重复 2 次
总浸提时间（3 次，h） 6 9 12 15 18 过 120 目筛、95% 乙醇、1∶15 料液比、40℃浸提 3 次
0.011
0.012
0.013
60 80 100 120 140㊹⺾ᓖⴞ
㍛ᵹ
䞷ਜ਼
䟿m
g/
g
图 2 粉碎度对紫杉醇提取率的影响
结果显示，粉碎度低于 120 目时，随着粉碎
粒度不断增大，紫杉醇的提取量亦随之增加，超过
120 目时，增势明显放缓，故粉碎度以控制在 120
目为宜。
2.1.2 乙醇浓度对紫杉醇提取效率的影响 收集
过 120 目筛的筛分 2.0 g，按 1∶15 料液比分别加入
80%、85%、90%、95% 和 100% 的乙醇 40℃浸提 4
h，重复浸提 2 次，经纯化后测定紫杉醇浓度，获得
乙醇浓度与紫杉醇含量变化曲线（图 3）。
结果表明，提高乙醇浓度有利于紫杉醇的浸出，
当乙醇浓度超过 95%，得率反而降低，100% 时提
0.008
0.0100832
0.0121664
0.0142496
80 85 90 95 100҉䞷⎃ᓖ%
㍛ᵹ
䞷ਜ਼
䟿m
g/
g
图 3 乙醇浓度对紫杉醇提取率的影响
取效率最低，仅有 0.008 6%。水的存在有利于细胞
中有效成分的溶出，但水的比例过大将使水溶性杂
质增多，因此选择 95% 的乙醇溶液为浸出最优浓度。
2.1.3 料液比对紫杉醇提取的影响 收集过 120 目
筛的筛分 2.0 g，按 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 和 1∶25
的料液比加入 95% 的乙醇 40℃浸提 4 h，重复浸提
2 次，经纯化后测定紫杉醇浓度，获得料液比与紫
杉醇含量变化曲线（图 4）。
0.008
0.009
0.01
0.011
0.012
0.013
1ĩ5 1ĩ10 1ĩ15 1ĩ20 1ĩ25
ᯉ⏢∄g/mL
㍛ᵹ
䞷ਜ਼
䟿m
g/
g
图 4 料液比对紫杉醇得率的影响
结果显示，随着提取溶剂用量的增加，紫杉醇
含量也相应提高，但增幅随溶剂用量的增加而减缓，
当浓缩比超过 1∶20 后，紫杉醇的得率保持不变，
为节省溶剂及回收溶剂的能耗，选择最佳料液比为
1∶20。
2.1.4 提取温度对紫杉醇提取率的影响 收集过
120 目筛的筛分 2.0 g，按 1∶15 料液比加入 95% 的
乙醇，分别于 20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃浸提
4 h，重复浸提 2 次，经纯化后测定紫杉醇浓度，获
得提取温度与紫杉醇含量变化曲线（图 5）。
2013年第10期 101余响华等 ：乙醇提取红豆杉树叶紫杉醇醇提条件的研究
0.01
0.011
0.012
0.013
20 30 40 50 60ᨀਆ⑙ᓖć
㍛ᵹ
䞷ਜ਼
䟿m
g/
g
图 5 提取温度对紫杉醇得率的影响
由图 5 可见，在 20-40℃提取范围内，随着温
度升高，紫杉醇得率明显增加 ；40℃ -50℃时，增
势明显放缓，趋于平稳 ；当温度超过 60℃后，得
率反而下降。原因主要在于浸出温度过高，经过一
段时间之后，使得浸提液实际浓度低于设定值，故
提取效率降低，因此紫杉醇乙醇提取温度宜控制在
40℃。
2.1.5 提取时间对紫杉醇提取率的影响 收集过
120 目筛的筛分 2.0 g，按 1∶15 料液比加入 95% 的
乙醇，40℃下分别浸提 2、3、4、5 和 6 h，重复浸
提 2 次，经纯化后测定紫杉醇浓度，获得提取时间
0.01
0.011
0.012
0.013
6 9 12 15 18
҉䞷䞷ᨀᰦ䰤h
㍛ᵹ
䞷ਜ਼
䟿m
g/
g
图 6 醇提时间对紫杉醇得率的影响
与紫杉醇含量变化曲线（图 6）。
由图 6 可知，浸提时间对紫杉醇的得率有较大
影响，提取时间越长，紫杉醇得率越高。考虑到提
取时间过长将延长提取周期，降低紫杉醇提取效率，
因此选择单次浸提 4 h、重复 2 次，总浸提时间 12 h
为宜。
2.1.6 正交试验优化 对影响提取得率较大的粉碎
度、料液比、乙醇浓度、提取时间 4 因素作 3 水平
的正交设计试验，所得结果见表 3。
由正交试验结果的直观分析可以看出，影响紫
表 3 L16（3
4）正交试验结果
试验编号 A 粉碎度目 B 乙醇浓度（%） C 料液比（g∶mL） D 提取时间（h） 紫杉醇含量（mg/g）
1 1 1 1 1 0.010 8
2 1 2 2 2 0.011 6
3 1 3 3 3 0.012 2
4 2 1 2 3 0.011 8
5 2 2 3 1 0.011 7
6 2 3 1 2 0.012 3
7 3 1 3 2 0.011 9
8 3 2 1 3 0.011 8
9 3 3 2 1 0.012 6
K1
’ 0.034 6 0.034 5 0.034 9 0.035 1
K2
’ 0.035 8 0.035 1 0.036 0 0.035 8
K3
’ 0.036 3 0.037 1 0.035 8 0.035 8
R’ 0.001 7 0.002 6 0.001 1 0.000 7
杉醇提取效果各因素的主次顺序依次是乙醇浓度 >
粉碎度 > 料液比 > 浸提时间，其中乙醇浓度和粉碎
度对得率影响较大，而浸提时间和料液比对得率影
响较小。4 因素的最佳组合为 A3B3C2D3 或 A3B3C2D2，
已知单因素试验 A3B3C2D2 组合紫杉醇含量为 0.012 5
mg/g，组合 A3B3C2D3 的紫杉醇含量为 0.012 6 mg/g，
该结果与单因素试验相吻合。考虑到单次提取时间
不宜太长，最终确定最佳组合为 A3B3C2D3，对应的
乙醇提取条件为 ：粉碎度 120 目，95% 乙醇，料液
比 1∶15，提取温度 40℃，提取 4 h，重复 2 次。
3 结论
经过一系列的单因素试验和正交试验，得到了
南方红豆杉紫杉醇乙醇提取工艺的最佳条件 ：粉碎
度 120 目、95% 乙醇浸提、料液比为 1∶15、提取
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期102
温度 40℃、提取 4 h、重复 2 次，经乙酸乙酯 - 丙
酮（6∶4）洗脱纯化，紫杉醇含量可达 0.012 5 mg/g。
参 考 文 献
［1］ 赵广河 , 张培正 . 紫杉醇提取纯化技术研究进展［J］. 食品与
发酵工业 , 2008, 34（5）：138-142.
［2］ 马晓驰 , 吴立军 , 贾景明 . 紫杉醇类化合物研究概况与展望［J］.
沈阳药科大学学报 , 2002, 19（2）：147-156.
［3］ 吴倩 , 高庆平 , 王正平 . 紫杉醇的提取和初分离工艺研究［J］.
化学工程师 , 2004, 11 ：40-42.
［4］ 赵凯 , 周东坡 . 抗癌药物紫杉醇的提取与分离纯化技术［J］.
生物技术通讯 , 2004, 15（3）：309-412.
［5］ 王少清 . 紫杉醇分离纯化工艺过程的研究［D］. 哈尔滨 ：哈尔
滨工程大学 , 2003 ：30-33.
［6］ Bai J, Kitabatake M, Toyoizumi K, et al. Production of biologically
active taxoids by a callus culture of Taxus cuspidata［J］. J Nat
Prod, 2004, 67（1）：58-63.
［7］ Nair MG, Mich O. Process for the isolation and purification of taxol
and taxanes from Taxus.spp ：US, 5279949 ［P］. 1994-01-01.
［8］ Chun MK, Shin HW, Lee H. Supercritical fluid extraction of
paclitaxel and baccatin Ⅲ from needles of Taxus cuspidata［J］.
J Supercrit Fluids, 1996, 9（3）：192-198.
［9］ 王秀君 , 张伟 , 王军 . 红豆杉紫杉醇提取方法的建立［J］. 生
物技术通讯 , 2007, 8（5）：789-791.
（责任编辑 狄艳红）