全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
凝胶电泳技术，尤其是单向 SDS-PAGE 凝胶电
泳（1-DE）和二维凝胶电泳（2-DE）是目前蛋白质
组学研究中使用范围最广泛的蛋白质分离及定量技
术。一般的电泳技术用于蛋白质定量，需要通过染
色的手段使电泳分离后的蛋白质得以显示，再依据
蛋白质量与染色深度在一定范围内的线性关系，通
过检测染色深度对蛋白质进行定量。目前，常用的
凝胶上蛋白质染色方法主要有染料染色法、银染法、
负染法和荧光染色法［1］。其中，染料染色法以考
马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为
代表，Fazekas de St Groth 等［2］在 1963 年首次将考
收稿日期 ：2014-03-28
基金项目 ：国家“863”课题资助项目（2012AA020204）.
作者简介 ：饶维桥，男，硕士，助理工程师，研究方向 ：蛋白质组学实验技术 ； E-mail ：raoweiqiao@genomics.cn
通讯作者 ：訾金，男，博士，副研究员，研究方向 ：蛋白质组学 ； E-mail ：zij@genomics.cn
改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝染色方法研究
饶维桥 肖伟敏 张继远 饶媛 訾金
（深圳华大基因研究院质谱平台，深圳 518083）
摘 要： 旨在建立简便、经济、灵敏以及质谱兼容的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳染色法，在胶体考染（Blue Silver）配方（0.12%
的考马斯亮蓝 G-250，10% 的磷酸，10% 的硫酸铵，和 20% 的甲醇）的基础上，通过优化凝胶固定时间与染色液中各物质用量，
得到改良的染色液配方（0.1% 的考马斯亮蓝 G-250 或 R-250，5% 的磷酸，5% 的硫酸铵，10% 的甲醇）及简便的操作步骤。试验
对比结果显示，改良方法一与胶体考染相比仍保持了较高的染色灵敏度以及较好的质谱兼容性，且有机试剂使用量更少，染色深
度与蛋白质量的线性关系也更好。
关键词 ： 蛋白质染色 考马斯亮蓝 灵敏度 线性范围 经济环保
The Research of an Improved Method for Protein Staining in
Electrophoresis with Coomassie Brilliant Blue
Rao Weiqiao Xiao Weimin Zhang Jiyuan Rao Yuan Zi Jin
（Mass Spectrometry Platform，BGI-Shenzhen，Shenzhen 518083）
Abstract: In order to establish a convenient, sensitive, economic and Mass Spectrometry compatible staining method for protein
polyacrylamide gel electrophoresis, herein, we established optimized staining methods based on Blue Silver Staining, by optimizing the gel
immobilization time and buffer content. Comparison result indicated the method 1 keep the similar high sensitivity and well Mass Spectrometry
compatible feature as Blue Silver Staining, what’ s more, is more easily conducted, less organic solvent consuming and have better correlation
between protein amount and staining density.
Key words: Protein staining Coomassie brilliant blue（CBB） Sensitivity Linear dynamic range（LDR） Economic and
environmental protection
马斯亮蓝 R-250 应用到醋酸纤维素膜上的蛋白质染
色，1965 年 Pink 等［3］使用甲醇 / 乙酸 / 水的溶液配
制 CBB R250 染色液为聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质
染色。由于考马斯亮蓝染色法简单易用，价格低廉，
且与下游的蛋白质谱分析高度兼容，因而，已成为
目前使用最广泛的染色方法。然而，其主要的问题
在于染色灵敏度不高，对低丰度蛋白质的显现较差。
自 Fazekas de st Groth 等第一次使用考马斯亮蓝
进行蛋白质染色以来［2］，已有很多研究为降低其染
色背景和提高其染色灵敏度而进行了努力。汪静等［4］
改良的考马斯亮蓝 G-250 染色法的灵敏度为 100 ng
2014年第9期 59饶维桥等：改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝染色方法研究
的牛血清白蛋白（BSA）电泳区带，并缩短了染色
时间，张瑶等［5］改良的考马斯亮蓝 G-250 染色法
的灵敏度为 39.1 ng 的 BSA，然而上述改良的考马
斯亮蓝染色法的染色和脱色均在醇 / 酸体系中进行，
染色后的凝胶再进行脱色时也容易将与蛋白质结合
的染料洗脱下来，直接影响试验的重复性，且灵敏
度仍然不高。而 Neuhoff 等［6］ 开发的胶体考染法
是考马斯亮蓝染色法优化史上重大意义的改进，该
方法在染色时染料颗粒穿透凝胶介质仅与蛋白质结
合，不受脱色时间影响，试验的重复性好，更重要
的是该方法可检测到 10 ng 的蛋白条带，适合在定
量分析的蛋白质组学研究中使用 ；Candiano 等［7］在
Neuhoff 染色体系上继续改良得到“Blue Silver”染
色法，其把染色液中的磷酸比例从 2% 提高到 10%，
把 CBB G-250 从 0.1% 提高到 0.12%，进而使蛋白质
染色灵敏度达到了 1 ng。而 Kang 等［8］创造性的将
Neuhoff 等开发的胶体考染法中的硫酸铵换成了硫酸
铝，染色灵敏度也达到了 1 ng/条带，而且还减少了
染色的时间 ；Pink 等［3］在 Kang 的基础上继续优化
染色液中各试剂的比例，把磷酸的浓度从 2% 提高
到 8%，其在 2-DE 分离时用相等的蛋白质量检测到
的蛋白质点数目提升了 44.7%。此外，Wang 等［9］
的研究也发现在传统的醇 / 酸染色体系基础上，通
过增加固定、敏化等步骤，也可以将灵敏度提升到
1 ng/条带。李慧等［10］把 3 种低毒高效的考染法与传
统 CBB-R-250 方法进行比较，其中 CBB-Al2（SO4）3
法的灵敏度可达 19.2 ng 的 BSA，与 Kang 等报道的
1 ng/条带的灵敏度有较大差异，同时在本研究中也
发现胶体考染通过肉眼判断的可见条带下限仅达 6
ng/条带，与 1 ng/条带的报道有差异。
前人大量的研究使胶体考染的方法在灵敏度以
及重复性方面有了很大提升，然而该方法仍然有一
些问题尚未解决，如染色背景较深，脱色时间较长，
脱色过程中胶体易碎等［3］。另外，蛋白质量与染色
深度的相关性高低对蛋白质定量分析的准确性有非
常重要的影响，而前人在改良染色方法时很少对染
色深度与蛋白质量的线性关系及线性范围进行研究
和评估。因此，本研究旨在前人工作基础上，继续
探索并尝试解决凝胶背景深、胶体易碎的问题，且
通过对标准量蛋白质的染色评估，分析染色方法与
蛋白质量的线性关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 蛋白质样品 牛血清白蛋白（BSA）标准溶
液 2 mg/mL（ 购 自 生 工 生 物 ）， 使 用 loading buffer
（Milli-Q H2O 2 mL，pH6.8、1.0 mol/L 的 Tris HCl 2
mL，SDS 0.8 g，DTT 0.568 g 和甘油 4 mL 混匀，再
加 入 10% 溴 酚 蓝 50 μL， 用 Milli-Q H2O 定 容 至 10
mL）依次梯度稀释，稀释完成后，均使用金属浴
95℃加热 5 min，20 000×g 离心 2 min 后备用。
1.1.2 试剂 CBB R-250 和 CBB G-250 购自 Amresco，
甲醇、乙醇、硫酸铵、乙酸和磷酸为国产分析纯。
1.1.3 固定液的配制 ：量取 200 mL 无水乙醇、100
mL 乙酸，加 ddH2O 定容至 500 mL，充分混匀，室
温密封保存，可重复使用。
1.1.4 染色液的配制 本研究经试验优化后配制了
两种改良型染色液，分别命名为方法一和方法二染
色液，具体配制方法如下 ：（1）方法一染色液配制 ：
量取 29.4 mL 体积百分含量为 85% 的磷酸加入 50
mL ddH2O 中，混匀 ；加入 25 g 的硫酸铵于上述混合
液，搅拌使其溶解完全 ；再加入 0.5 g 的 CBB G-250
于上述混合液中，振荡混匀，然后把 50 mL 甲醇加
入混合液中，用 ddH2O 定容至 500 mL 混匀备用。（2）
方法二染色液的配制 ：方法二所用染色剂替换为
CBB R-250，其他物质及浓度组成均同方法一；另外，
对照实验所用的 Meyer Stain 和 Blue Silver 染色液组
成如下 ：Meyer Stain 染色液组成 ：0.1% CBB R-250、
10% 乙酸、45% 甲醇水溶液；Blue Silver 染色液组成：
0.12% CBB G-250、10% 硫酸铵、10% 磷酸、20% 甲
醇水溶液。
1.2 方法
1.2.1 电泳 采用 Bio-red mini 7 cm 垂直电泳系统，
90 V 电泳 30 min，然后改成 130 V 电泳 60 min 分离；
采用的 SDS-PAGE 凝胶是分离胶为质量百分含量为
12% 聚丙烯酰胺和浓缩胶为质量百分含量为 5% 聚
丙烯酰胺。
1.2.2 固定和染色方法 方法一和方法二相同，过
程如下 ：电泳结束后用蒸馏水漂洗 SDS-PAGE 凝胶，
洗掉凝胶表面的 SDS，倒去蒸馏水。加入 50 mL 固
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期60
定液，室温慢摇固定 30 min，回收固定液 ；加入适
量 ddH2O 漂洗两次，每次室温漂洗 15 min ；加入 50
mL 染色液，室温慢摇染色 8 h ；最后用蒸馏水洗掉
凝胶浮色，即可看到条带清晰明亮。
1.2.3 凝胶染色图像扫描 染色后的凝胶用 UMAX
Powerlook 2100XL-USB 扫描仪进行扫描。
1.2.4 凝胶染色强度分析 蛋白条带染色强度采用
ImageMasterTM 2D platinum，v5.0 软件进行计算。根
据软件说明进行各蛋白条带光密度值（Vol%）的计
算，以之作为蛋白条带染色强度的代表。
1.2.5 胶内酶解消化 将 SDS-PAGE 胶中的 BSA 条
带切胶，用 55 mmol/L 碘乙酰胺（IAM）烷基化后，
用 1 μg/μL Trypsin 37℃孵育过夜，然后萃取肽段冷
冻抽干，再用 10 μL 的 buffer（98%H2O+2%CH3CN+
0.1%HCOOH）复溶得到酶解肽段溶液。
1.2.6 MALDI-TOF 分 析 及 蛋 白 质 鉴 定 使 用
ultrafleXtreme MALDI-TOF 质 谱 仪（ 德 国 Bruker
Daltonics Inc.）进行一级质谱分析。按照系统推荐要
求设置进样程序。质谱分析检测模式采用线性阳离
子模式，氮激光波长 553 nm，激光频率 1 000 Hz。
质谱累计扫描离子源 1 电压 ：7.8 kV，离子源 2 电压
6.8 kV，聚集电压 3.5 kV，反射电压 1 为 29.5 kV，
反 射 电 压 2 为 13.95 kV ；LIFT 1 为 19 kV，LIFT 2
为 3 kV。检测范围 ：0.5-3.5 kD ；分辨率 ：50 000 ；
质谱累计扫描 1 000 次，使用 Bruker Dalt onics flex
Control3.3.108 软件分析处理扫描结果。
对获得的质谱数据用本地版的 Mascot 软件搜索
IPI_bovine bovine_v3.73（30403 sequences ； 16412134
residues）数据库。搜库参数设置 ：Type of search 选
择 Peptide Mass Fingerprint，Enzyme 选择 Trypsin，固
定修饰（Fixed modification）选择 Carbamidomethyl（C），
可 变 修 饰（Variable modification） 选 择 Deamidated
（NQ），Mass values 选 择 Monoisotopic，Protein Mass
选 择 Unrestricted，Peptide Mass Tolerance 选 择 为
±100 ppm，Peptide Charge State 选择 1+，Max Missed
Cleavages 选择 1，Number of queries 为 50。
2 结果
2.1 四种染色方法的灵敏度
本 研 究 设 计 了 一 个 BSA 浓 度 梯 度 进 行 SDS-
PAGE，其浓度范围为 1-1 000 ng，上样量分别为
1 000、750、500、250、150、100、50、20、10、8、6、
4、2 和 1 ng ；方法一的染色结果如图 1-A 所示，肉
眼能观看到 6 ng 的 BSA 条带 ；Blue Silver 的染色结
果如图 1-B 所示，其肉眼可见灵敏度约为 6 ng ；方
法二染色结果如图 1-C 所示，肉眼能观看到 6 ng 的
BSA 条带 ；Meyer Stain 染色结果如图 1-D 所示，该
方法肉眼只能观察到 20 ng 的 BSA 条带，远低于 3
种胶体考染的染色效果，且 3 种胶体考染的染色效
果从肉眼直观上无明显差异。
2.2 四种染色方法的定量线性关系
本研究考察了方法一、方法二、Meyer Stain 和
Blue Silver 等 4 种染色方法的线性关系，分别对它
们的 SDS-PAGE 凝胶蛋白条带光密度值（Vol%）与
1-1 000 ng BSA 含量的相关性进行分析，以及 SDS-
PAGE 凝胶蛋白条带光密度值（Vol%）与低含量范
围的 BSA（1-10 ng）的相关性进行分析，结果如图
2 所示。
在 BSA 含 量 为 1-1 000 ng 范 围 内， 方 法 一
（图 2-A）、Blue Silver（图 2-B）、方法二（图 2-C）、
Meyer Stain（图 2-D）4 种染色方法的线性关系系
数 R2 值均大于 0.90，其中方法一的线性关系系数＞
0.98，方法二和 Blue Silver 的线性关系系数相当均约
为 0.96，而 Meyer Stain 的线性关系系数仅为 0.91 ；
同 时， 在 低 含 量 的 BSA（1-10 ng） 梯 度 内，Blue
Silver（图 2-F）、方法二（图 2-G）和 Meyer Stain（图
2-H）均不能随蛋白质量的增加而形成一定的线性关
系，而方法一（图 2-E）的线性关系系数 R2 值等于
0.94，表明其在低含量的 BSA（1-10 ng）范围内仍
有较好的线性关系。
2.3 四种染色方法的质谱兼容性评估
为了评价 4 种染色方法的质谱兼容性情况，将
SDS-PAGE 凝胶中 250 ng 和 50 ng 的 BSA 条带进行
胶内酶解消化，然后进行 MALDI-TOF 质谱分析（见
图 3）及鉴定，结果见表 1 ；对于 250 ng 的 BSA 条
带，表 1 结果表明 4 种考染方法的质谱鉴定得分差
异不大，每种方法的重复试验的得分也能保持相对
稳定，且均大于 57 分，表明得到的鉴定结果是可信
的 ；而对于 50 ng 的低含量 BSA 条带，胶体考染的
2014年第9期 61饶维桥等：改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝染色方法研究
质谱鉴定结果不稳定，仅有一次试验鉴定出目的蛋
白质 BSA，方法二和 Meyer Stain 3 次重复试验均未
能鉴定出目的蛋白质 BSA，但方法一的 3 次重复试
验的质谱鉴定的平均得分为 65，说明其实验体系稳
定，重复性好且质谱兼容性也是 4 种方法中最好的。
3 讨论
在本研究中，我们采用基于胶体考染的实验体
系进行优化，因该体系是现有最灵敏的考染体系之
一。该体系的灵敏度主要取决于甲醇、磷酸、硫酸
铵及 CBB G-250 4 种物质的浓度，在本研究中我们
优化了体系中四种物质的浓度，确定了优化方法一；
同时尝试用 CBB R-250 代替方法一中的 CBB G-250，
拓展染色方法的应用范围，其他物质浓度保持不变，
建立方法二。
本研究改良的考马斯亮蓝染色法虽减少了染色
液中各物质的用量，但染色灵敏度仍与胶体考染灵
敏度相当。胶体考染具有较高的灵敏度一方面是由
于染色时染料胶束直接穿过凝胶基质直接与蛋白质
结合，降低了凝胶的背景 ；另一方面，磷酸作为一
种稳定的中强酸，比 Meyer Stain 中使用的乙酸更易
使蛋白质质子化，增强了染料和蛋白质之间的作用
力，同时为蛋白质的着色提供了适当的 pH 范围［3］。
本研究改良的方法首先是将凝胶置于含酸的固定液
中进行固定处理，一方面是可洗掉凝胶中残留的少
量 SDS，便于染色过程中染料和蛋白质的结合 ；另
a
97
66
43
31
20
16
kDA b c d e f g h i j k l m n o
a
97
66
43
31
20
16
kDB
b c d e f g h i j k l m n o
a
97
66
43
31
20
16
kDC
b c d e f g h i j k l m n o
a
97
66
43
31
20
16
kDD
b c d e f g h i j k l m n o
A ：方法一 ； B ：Blue Silver ； C ：方法二 ；D ：Meyer Stain ； a ：Marker，上样
量均为 2.4 μg，折合每条带的蛋白质含量为 400 ng ；b-o ：BSA 上样量分别为
1、2、4、6、8、10、20、50、100、150、250、500、750 和 1 000 ng
图 1 四种染色方法在 BSA 梯度 SDS-PAGE 中的比较
表 1 四种染色方法的 SDS-PAGE 凝胶中 BSA 条带
MALDI-TOF 鉴定分析情况表
方法 BSA（ng） Noa） Scoreb） Sequence Coverage（%）
方法一
250
1 125 23
2 139 25
3 144 26
50
1 60 15
2 65 15
3 71 15
Blue Silver
250
1 158 31
2 160 36
3 132 31
50
1 71 14
2 / /
3 / /
方法 2
250
1 173 37
2 158 35
3 147 27
50
1 / /
2 / /
3 / /
Meyer Stain
250
1 181 33
2 193 36
3 176 33
50
1 / /
2 / /
3 / /
Note ：a）Each sample analysis was repeated three times by MALDI-TOF ；b）
Mascot scores，significance setting P<0.05 ； Protein scores greater than 57 are
significant.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期62
A
y=2.9163x-26.091
R2=0.9830
3500
Vo
l % 2500
1500
500
0
0 200 400 600
BSALoad ng 800 1000 1200100020003000 B y=3.7002x-187.74R2=0.96525000Vol % 20000 0 200 400 600BSALoad ng 800 1000100030004000
y=3.3723x-152.93
R2=0.9668
5000
Vo
l %
2000
0
0 200 400 600
BSALoad ng 800 1000100030004000C
0
0
-50
-100
-150
-200
2 4 6 8 10 12
BSALoad ng F
y=4.3338x-148.09
R2=0.2088
Vo
l % E y=5.7639x-7.0679R2=0.94025060Vol % 20
0
0 200 400 600
BSALoad ng 800 1000103040
D
y=3.3871x-69.887
R2=0.9156
5000
Vo
l %
2000
0
0 200 400 600
BSALoad ng 800 1000100030004000
G
y=1.2607x-172.04
R2=0.0042
300
Vo
l % 200150
0
0 2 4 6
BSALoad ng 8 10 1210050250 H y=8.7495x-104.39R2=0.3884140Vol % 400 0 42 6 8BSALoad ng 10 12206080100120
A、B、C、D 分别为方法一、Blue Silver、方法二、Meyer Stain 在 BSA 梯度含量为 1-1 000 ng 的线性关系图 ；E、F、G、H 分别为方法一、Blue
Silver、方法二、Meyer Stain 在 BSA 梯度含量为 1-10 ng 的线性关系图
图 2 四种染色方法在 BSA 梯度 SDS-PAGE 中的定量线性关系比较
一方面由于凝胶经过固定处理后胶体收缩，减少了
蛋白质的溶出，胶体收缩后间隙变大，染料胶束更
易穿过凝胶与胶中的蛋白质结合。经过固定处理后
的胶体，磷酸浓度达到 5% 即可提供一个适当的质
子环境使蛋白质充分着色。另外，硫酸铵能起到将
染料固定在蛋白质上的作用，由于本研究改良的方
法凝胶经过固定处理，所以本研究降低了染色液中
硫酸铵的用量仍能达到较好的染色灵敏度。而且，
硫酸铵浓度的降低使染色液中的盐离子浓度降低，
胶体不易过度收缩，仍能保持较好的韧性，不易碎。
2014年第9期 63饶维桥等：改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝染色方法研究
与优化前的胶体考染（Blue silver）相比，甲醇、磷酸、
硫酸铵的用量减少了一半，这样一方面可减少了试
剂费用 ；另一方面实验过程中产生的有毒废液也更
少，更环保。
对于生物样品，不同类型的蛋白质含量有显著
的差异，如血浆中蛋白质浓度相差超过 10 个数量
级［11］，良好的定量线性关系对于基于凝胶分离和定
量的体系而言是很重要的，尤其是双向电泳技术体
系，因此考察低浓度蛋白质着色情况及其在较宽浓
度范围内响应的线性关系是非常必要的［12］。本研究
改良的方法一不仅在 1-1 000 ng BSA 范围内线性关
系良好，且在低含量的 BSA（1-10 ng）范围内仍保
持较好的线性关系，比胶体考染、Meyer Stain、方法
二具有更宽的定量线性动态范围。这一方面可能是
因为凝胶经固定处理后，迅速的将凝胶中的蛋白质
锁定，避免了染色试验操作误差导致的不稳定，另
一方面是由于 G250 与 R-250 相比更易在酸性环境中
形成胶体，更适用于胶体染色 ；另外，质谱鉴定的
结果也表明方法一在较低蛋白质含量时有更好的质
谱兼容性。因此，本研究改良的胶体染色方法对定
量结果和质谱鉴定均是有利的。
4 结论
本研究从染色灵敏度、线性范围、质谱兼容性
等几个方面系统的评价了改良方法，其中与经典的
Meyer stain、胶体考染相比较，改良方法二不仅保
持了胶体考染的灵敏度，并且染色所需试剂用量低，
A、B、C、D 分别为方法一、Blue Silver、方法二、Meyer Stain 的 SDS-PAGE 中 50 ng BSA 条带胶内酶解 MALDI-TOF 分析图
图 3 四种染色方法 SDS-PAGE 中 50 ng BSA 条带胶内酶解 MALDI-TOF 分析图
6000
4000
2000I
nt
ea
s.[
al
l]
0
3000
4000
2000
1000
In
te
as
.[a
ll]
0
1250
1500
1000
250
500
750
In
te
as
.[a
ll]
0
2000
A
B
C
D
1500
1000
500
800 1000
927.490
870.545
1567.724
2082.978 2383.933
1479.728
1320.5411179.547
927.468
870.514 1567.677
1707.704
1045.563
1163.631 1305.716
870.553
927.498 1479.792
1045.506
1163.560
1305.639
876.999
927.442
1639.845
1567.660
1794.715
1880.823
2104.886
2225.003
2383.832
1567.742
1639.926 1880.913
2104.979 2225.110
1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400
In
te
as
.[a
ll]
0
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期64
得到的凝胶保持了良好的韧性，不易碎，且基本无
背景，脱色简单，极大的提高了染色效率，更经济、
环保。改良方法一在保持方法二优点的基础上，在
定量线性范围和质谱兼容性方面均有显著的提升 ；
其在低蛋白质含量时有更好的线性关系，适用范围
广 ；且其在低蛋白质含量时质谱兼容性也是 4 种方
法中最好的。因此，本研究改良得到的两种考马斯
亮蓝染色方法均具有较好的实用性及推广意义，方
法一更优。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）