全 文 ：几种测定灰树花多糖中蛋白质含量方法的比较研究＊
王卫国1 , 吴 强1 , 胡宝坤1 , 包东武2 , 赵永亮3
(1.南阳理工学院生物与化学工程系 , 2.南阳理工学院医学院微生物室 , 河南 南阳 473004;
3.四川农业大学农学院 , 四川 雅安 6250014)
摘要:用双缩脲法 、 紫外吸收法 、 考马斯亮蓝 G-
250 染色法三种方法对灰树花多糖中蛋白质含量进行测
定 , 并同微量凯氏定氮法进行对比。结果表明:在蛋白
质量浓度 0.1～ 1.0mg/mL范围内 , 其测量误差分别为双缩
脲法大于 50%, 紫外吸收法大于 30%, 考马斯亮蓝 G-
250染色法最低可小于 3%。考马斯亮蓝 G-250染色法简
单 , 迅速 , 且相对较为准确 , 是测定灰树花多糖中蛋白
质含量的有效方法。
关键词:灰树花多糖;蛋白质含量;测定方法;考
马斯亮蓝 G-250染色法
中图分类号:Q513+2 文献标识码:A
文章编号:1003-8310 (2003) 01-0027-04
灰树花是一种兼具食用与药用功能的大型真菌,
富含大量的营养物质及生物活性物质。据农业部质检
中心和中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所检
验, 灰树花干品中含蛋白质32%, 其中含18种氨基酸,
总量近20%。碳水化合物50%及多种维生素和微量元
素。对于改进食物构成, 平衡营养成分及提高机体对
蛋白质的利用率具有重要作用[1] 。近20年的研究发现,
灰树花中含有一种抗艾滋病抗恶性肿瘤成分……灰树
花多糖 (Griflan), 具有诱导干扰素合成, 增强人体免
疫力, 抑制肿瘤及降血压等作用[ 2] 。据日本药学会 113
次年会报告, 对HIV 病毒有明显抑制作用 , 同时对胃
癌、 食道癌、 乳腺癌、 前列腺癌等疗效均优于其它大
型真菌多糖[3] 。日本医学家用灰树花多糖进行抗肿瘤
实验, 结果表明 , 灰树花多糖的抑瘤率可达 86.5%,
比国际认证的抗癌新药香菇多糖抑制率高 32%[ 4-9] 。
灰树花中含有多种杂质 , 影响其多糖纯度最主
要的物质为杂蛋白。如何快速 , 简单 , 准确地对其
中的蛋白质含量进行检出 , 无疑将直接影响着灰树
花多糖的纯化效率和开发应用。目前关于灰树花多
糖中蛋白质含量的测定方法还无专门报道 , 为此 ,
我们对目前常用的几种蛋白质测定方法进行了研
究 , 初步证实了考马斯亮蓝 G-250 染色法简单 、
迅速 , 且相对较为准确 , 是测定灰树花多糖中蛋白
质含量的有效方法。现将有关结果报道如下:
1 材料
灰树花多糖粗品 (本实验室自制);试剂:试
验所用硫酸铜 , 酒石酸钾钠 , NaOH , 考马斯亮蓝
G-250 , 85%磷酸 , 乙醇等试剂均为分析纯级 , 牛
血清蛋白为武汉亚法生物技术拓展公司进口分装;
仪器:721型分光光度计 , 751-G 型分光光度计 ,
微量凯氏定氮仪。
2 方法
2.1 样品制作:准确称取粗多糖 1.000g用蒸馏水
定溶至 1L。
2.2 牛血清蛋白 (标准品)的校正:采用微量凯
氏定氮法[ 10] 。
2.3 微量凯氏定氮法[ 5] 测定样品中杂蛋白含量:
按表 1 , 采用微量凯氏定氮法确定三个不同浓度的
样品中蛋白质的准确含量 , 以此做为衡量其它蛋白
质含量测量方法准确性的标准。
表 1 微量凯氏定氮法测定样品中杂蛋白含量分组
组 号 1 2 3
样品液(mL) 1 2 3
水(mL) 2 1 0
2.4 双缩脲法测定样品中杂蛋白含量:双缩脲试
剂的配制:930mLH2O 加入 10mol/ L氢氧化钾 10mL
和 25%酒石酸钾钠 20mL , 剧烈搅拌下逐滴加入4%
硫酸铜溶液 40mL;标准蛋白溶液的配制:准确称
取牛血清蛋白 100mg 用蒸馏水定溶至 100mL , 以此
作为绘制标准曲线的标准蛋白。标准曲线制作:按
表 2 操作 , 室温放置 15min 后于 540nm 下比色 (所
得曲线如图 1)。
表 2 双缩脲法测蛋白标准曲线分组
项 目 0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白(mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
水(mL) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
双缩脲(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
蛋白浓度
(mg/mL) 0 0.167 0.333 0.500 0.667 0.833 1.0
O.D∶540 0 0.621 1.239 1.859 2.478 3.101 3.719
＊:河南省南阳市科委资助的攻关项目 , 项目编号为 No.000308.TEL:0377-3120387 (H), 3121605 (0)FAX:
0377-3121404
收稿日期:2002—06—13
27第 22 卷 第 1期 中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA
DOI :10.13629/j.cnki.53-1054.2003.01.012
图 1 双缩脲法测蛋白标准曲线
样品测定:按表 3取样品 , 进行比色 , 每组做
三次重复。
表 3 双缩脲法测定样品中杂蛋白含量分组
组 号 0 1 2 3
样品液(mL) 0 0.2 0.4 0.6
水(mL) 0.6 0.4 0.2 0
双缩脲(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0
2.5 紫外吸收法测定样品中杂蛋白含量 标准蛋
白溶液配制:1.0mg/mL的牛血清蛋白溶液。标准
曲线线制作:按表 4 操作 , 于 280nm 下比色。 (曲
线如图 2)
表 4 紫外吸收法测蛋白标准曲线分组
项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8
标准蛋白 (mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
水 (mL) 8 7 6 5 4 3 2 1 0
蛋白浓度 (mg/mL) 0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 0.875 1.0
O.D∶280 0 0.295 0.654 0.901 1.123 1.323 1.523 1.831 2.201
蛋白浓度 (mg/mL)
图 2 紫外吸收法测蛋白标准曲线
蛋白浓度 (mg/mL)
图 3 考马斯亮蓝 G-250法测蛋白标准曲线
样品测定:按表 5 , 进行比色 , 每组做三次重
复。
表 5 紫外吸收法测定样品中杂蛋白分组
项目 0 1 2 3
样品液(mL) 0 2 4 6
水(mL) 6 4 2 0
2.6 考马斯亮蓝 G-250染色法测定样品中杂蛋白
含量 染色液的配制:取考马斯亮蓝 G-250 染色
剂100mg 溶于 50mL95%乙醇中 , 加 100mL85%磷
酸 , 加水 稀释至 1L;标准蛋白 溶液的配 制:
1.0mg/ mL的牛血清蛋白溶液;标准曲线制作:按
表6 操作 , 室温放置 15min 后于 595nm 下比色 (曲
线如图 3)。
表 6 考马斯亮蓝 G-250染色法
测蛋白标准曲线分组
项目 0 1 2 3 4 5
标准蛋白(mL) 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
水(mL) 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0
染色液(mL) 5 5 5 5 5 5
蛋白浓度
(mg/mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
O.D∶595 0 0.649 1.232 1.762 2.441 3.119
样品测定:按表 7 , 每组做三次重复。
28 中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA Vol.22 , No.1
表 7 考马斯亮蓝G-250染色法
测样品中杂蛋白分组
项目 0 1 2 3
样品液(mL) 0 0.5 1.0 1.5
水(mL) 1.5 1.0 0.5 0
染色液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0
测量误差的计算:
测定值-标准值 (凯氏定氮所得值)
标 准 值
3 结果与讨论
3.1 微量凯氏定氮法对牛血清蛋白及样品的检测
微量凯氏定氮法测定结果表明 , 牛血清蛋白中纯蛋
白含量为 98.5%。样品中杂蛋白含量见表 8。
表 8 微量凯氏定氮法测定样品中
杂蛋白含量结果表
组 号 1 2 3
杂蛋白含量(mg/mL) 0.141 0.288 0.441
通常认为微量凯氏定氮法是测定蛋白质含量的
最为可靠的方法 , 但因其操作较为复杂 , 耗时较
长 , 而逐渐被其它方法所取代。本试验中 , 我们用
其来校正牛血清蛋白及用来做为衡量测定蛋白质含
量的其它方法准确性的标准。
3.2 双缩脲法对样品中杂蛋白含量的检测 双缩
脲法对样品中杂蛋白含量的检测结果及其测量误差
见表 9。
表 9 双缩脲法对样品中
杂蛋白含量的检测结果
项 目 0 1 2 3
O.D∶540 0 0 0 0.798
蛋白含量(mg/mL) 0 0 0 0.212
测量误差 0% 100% 100% 51.9%
(注:表中所列 O.D 值为三次重复所测结果的平均
值;蛋白含量为 O.D值对应曲线上的蛋白含量值乘上牛
血清蛋白的纯度 98.5%后所得。)
由表 9所得结果可见 , 双缩脲法检测样品时在
杂蛋白浓度低于 0.4mg/ mL范围内难以检出 , 而浓
度大于 0.4mg/ mL时虽能检出 , 但其结果同 3.1 所
得结果相比却相差较大 , 其测量误差高达 50%以
上。出现这种情况原因可能是因为样品中富含较多
的色素及可能影响显色的物质 , 它们的存在严重影
响了显色。
3.3 紫外吸收法对样品中杂蛋白含量的检测 紫
外吸收法对样品中杂蛋白含量的检测结果及其测量
误差见表 10。
表 10 紫外吸收法对样品中
杂蛋白含量的检测结果
项 目 0 1 2 3
O.D∶280 0 0 0.341 0.324
蛋白含量(mg/mL) 0 0 0.150 0.274
测量误差 0 100% 47.9% 37.8%
(注:表中所列 O.D 值为三次重复所测结果的平均
值;蛋白含量为O.D 值对应曲线上的蛋白含量值乘上纯
度 98.5%后所得。)
由表 10 所得结果可见 , 紫外吸收法检测样品
时在蛋白质浓度低于 0.2mg/mL时难以检出 , 浓度
在 0.2mg/mL～ 0.4mg/ mL时虽可检出 , 其测量误差
却高达 47.9%, 浓度大于 0.4mg/mL 时其结果虽比
3.2所得结果更为准确但同 3.1 所得结果相比仍有
很大差距 , 其测量误差高达 37.8%。出现这种情况
的原因可能是因为样品中含有较多的色素或其它影
响光吸收的物质 , 以及设备本身可能引起的误差 ,
其真正原因尚需做进一步的研究 。
3.4 考马斯亮蓝G-250 染色法对样品中杂蛋白含
量的检测 考马斯亮蓝 G-250 染色法对样品中杂
蛋白含量的检测结果及其测量误差见表 11。
表 11 考马斯亮蓝 G-250染色法
对样品中杂蛋白含量的检测结果
项 目 0 1 2 3
O.D∶595 0 0.799 1.659 2.653
蛋白含量(mg/mL) 0 0.129 0.268 0.428
测量误差 0 8.5% 6.9% 2.9%
(注:表中所列 O.D 值为三次重复所测结果的平均
值;蛋白含量为 O.D 值对应曲线上的蛋白值乘上纯度
98.5%后所得。)
由表 11 所得结果可见 , 考马斯亮蓝G-250 染
色法在检测样品中杂蛋白含量时结果较为准确 , 其
测量误差在蛋白浓度由低到高时分别为 8.5%,
6.9%, 2.9%。 蛋白质含量在 0.1mg/ mL ～ 1.0mg/
mL范围内的样品可准确地对其进行测定。
为验证考马斯亮蓝 G-250 染色法的准确性 ,
我们进行了反复试验并对香菇多糖 、 灵芝多糖等其
它真菌类多糖中蛋白质含量进行了试验。结果均表
明 , 蛋白浓度在 0.1mg/mL ～ 1.0mg/mL 范围内 , 考
29第 22 卷 第 1期 中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA
马斯亮蓝 G-250 染色法在包括灰树花多糖在内的
多种真菌类多糖中蛋白质含量检测时其结果较为准
确 , 而且其操作简单 , 测定迅速 , 对设备要求较
低 , 是测定灰树花多糖中蛋白质含量的有效方法。
[ 参考 文 献]
[ 1] 王增池.灰树花的生态条件与药用价值 [ J] .中国食
用菌 , 1998 , 17(6):39-40.
[ 2] 裘娟萍.灰树花深层发酵培养基的研究 [ J] .微生物
学通报 , 2000 , 27 (4):275-278.
[ 3] 姚平生 , 姚秋生.日本灰树花栽培技术 [ J] .中国食
用菌 , 2001 , 20(6):33-34.
[ 4] 吴学廉 , 江苏食用菌 [ J] , 1994 , 15 (4):29-30.
[ 5] Ohno N , Hayashi M et al.Effect of glucans on the antitu-
mour activi ty of grif olan.Chemical and Pharmaceutical Bul-
letin , 1986 , 34(5):2149-2151.
[ 6] Adachi Y , OkazaKi M , Ohno N et al.Enhancement of cy-
tokine Production by macrophages stimulated with (1
f rom Grifola fondosa.Biological and Pharmaceutical Bul-
letin, 1994 , 17 (12) 1554-1560.
[ 7] Zhuang C , Mizuno T et al.Antitumor activity and immuno-
logical property of polysaccharides from the mycelium of
liquid-cultured Grifola frondosa.Nippon Shokuhin Kogyo
Gakkaishi Journal of the Japanese Society for Food Science
and Technology , 1994 , 41 (10):724-732.
[ 8] Okazaki M , Adachi Y , Ohno N et al.Structure-activity
relationship of(1
the induction of cytokine production form macrophages in vit-
ro.Biological and Pharmaceut ical Bulletin , 1995, 18
(10):1320-1327.
[ 9] Kubo K , Nanba H.Anti-hyperliposis effect of maitake
fruitbody (Grigola frondosa).Biological and Pharmaceutical
Bulletin , 1997, 20(7):781-785.
[ 10] 李如亮主编 , 生物化学实验 [ M] , 武汉大学出版
社 , 1998.
Comparative Study on Determination Methods
of Residual Protained in Grifolan
WANGWei-guo , WU Qiang , HU Bao-kun , BAO Dong-wu , ZHAO Yong-liang
1.Biochemical Engineering Dept., Nanyang Institute of Technology , Nanyang , Henan 473004 , PRC.2.Medical School ,
Nanyang Institute of Technology , Nanyang , Henan 473002 , PRC.3.Agricultural Dept., Sichuan Agricultural University.Ya an ,
Sichuan, 625014 , PRC.
Abstract:The Determination methods of residual proteins contained in grifolan such as Biuret Reaction , UV absorp-
tion and the dying method with Coomassie Brilliant Fluka G-250 were studied and compared with the Kjeldahl s minor ni-
trogendetermining method.The results indicated that the determination deviations are more than 50% for Biuret Reaction ,
more than 30% for UV absorption method , and less than 3% for the dying method with Coomassie Brilliant Fluka G-250
at least while the concentration of proteins ranges from 0.1 to 1.0 mg/ ml.The dying method with Coomassie Brilliant Flu-
ka G-250 possesses the properties of simplicity , rapidness and exactness , so it s an effective method of determining the
content of proteins contained in grifolan.
Key words:Grifolan;Content of protenins;Determination methods;Dying method with Coomasie Brilliant Fluka
G-250
收购金福菇产品及推广栽培技术
栽培 2000 袋金福菇生产成本 450 元 , 可产干菇 50kg , 现干品购价 120～ 140 元/kg , 产值 6000
～ 7500 元。本场为大量收购产品出口 , 特向稻麦草 、 棉籽壳 、 玉米芯丰富产区推广新法栽培金福菇
技术。
一 、 免费面授金福菇制种 、 栽培及加工技术 , 以现场参观 , 实地操作为主 , 实践与讲解结合 ,
随到随学。
二 、 提供高产金福菇菌种 , 技术培训教材及签订产品购销合同。
三 、 联系地址:福建省柘荣县新优食用菌种植场 (楮坪乡供销社旁 、 邮编:355300)。
电话:0593-8388205、 8352790
联系人:陈成弟 、 范少清
30 中国食用菌 EDIBLE FUNGI OF CHINA Vol.22 , No.1